CC BY
123
Вестник ДВО РАН. 2014. № 1
УДК 547.918:593.96:615.275.4+547.99:615.244:615.28:616.36+547.99:593.95:615.254.1
В.И. КАЛИНИН, Н.В. ИВАНЧИНА, Д.Л. АМИНИН, Н.И. КУЛЕШ, С.А. ФЕДОРЕЕВ
Изучение механизмов и особенностей действия новых лекарственных препаратов из дальневосточных растений и морских беспозвоночных
Кукумариозид А2-2 в субтоксических концентрациях активирует резкий и обратимый вход ионов кальция в клетки, что может служить сигнальным механизмом в инициации иммунного ответа макрофагов. Его фар-макокинетическое поведение, изученное с помощью 3Н-меченого производного в гомогенате селезенки мышей, совпадает с таковым, изученным с помощью МАЛДИВП масс-спектрометрии. С помощью МАЛДИ имиджин-га изучено пространственное распределение кукумариозида A2-2 в криогенных срезах селезенок мышей. В очень низких концентрациях кукумариозид А -2, его аналог фрондозид А, а также их комплексы с холестерином инги-бируют множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток. Идентифицированы индивидуальные полифенольные метаболиты из растения Maackia amurensis. Найдены противоопухолевые свойства in vitro для гепатопротекторного препаратаМаксар®. Изучено влияние гентиобиозидов изофлавонов и птерокарпанов из корней маакии амурской на параметры свободно-радикального окисления. При окислительном стрессе предварительная обработка животных этими изофлавоноидами в большей степени ингибирует прооксидантную активность, чем в случае препарата Максар®. Угнетение микросомального окисления ослабляет диуретический эффект препарата Гистохром® у крыс. Мочегонный эффект препарата обусловлен не нативным соединением (эхинохром А), а продуктами его метаболизма.
Ключевые слова: Кумазид, Максар®, Гистохром®, кукумариозид А-2, изофлавоноиды, иммуномодулирующая активность, антиоксидантная активность, ингибирование роста колоний опухолевых клеток.
Studies into mechanisms and peculiarities of action of some new leads from Far Eastern plants and marine invertebrates. V.I. KALININ, N.V. IVANCHINA, D.L. AMININ, N.I. KULESH, S.A. FEDOREYEV (G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS, Vladivostok).
Cucumarioside А-2 activates dramatic and reversible entry of calcium ions into cells in sub-toxic concentrations that may serve as a signal mechanism in initiation of immune response of macrophages. Pharmacokinetic behavior of Н-cucumarioside А -2 in mouse spleen homogenate coincides with the one studied by MALDITOF mass-spectrometry. Spacing of cucumarioside A-2 in cryogenic cross-sections of mouse spleens has been studied using MALDI imaging. In very low concentrations, rncumarioside A-2, its analog frondoside A and their complexes with cholesterol inhibit multi drug resistance of tumor cells. Individual polyphenolic metabolites have been identified in the plant Maackia amurensis. Antitumor properties (in vitro) of hepatoprotector drug Maxsar® have been found. Influence of gentiobiosides of isofla-vones and pterocarpans from the roots of M. amurensis on parameters of free radical oxidation has been studied. At oxidative stress, the preliminary treatment of animals with these fl avonoids inhibits pro-oxidant activity stronger than with drug preparation Maxsar®. Suppression of microsomal oxidation decreases diuretic effect of preparation Hystochrome® for rats. Diuretic effect of the preparation is caused by products of metabolism of its native substance (echinochrom A) but not the preparation.
*КАЛИНИН Владимир Иванович - доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник, ИВАНЧИНА Наталья Владимировна - кандидат химических наук, старший научный сотрудник, АМИНИН Дмитрий Львович - кандидат биологических наук, заведующий лабораторией, КУЛЕШ Надежда Ивановна - кандидат химических наук, старший научный сотрудник, ФЕДОРЕЕВ Сергей Александрович - доктор химических наук, заведующий лабораторией (Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, Владивосток). *Е-шаП: kalininv@piboc.dvo.ru
Работа выполнена при поддержке Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» (проект № 12-1-П5-04) и программы ДВО РАН «Дальний Восток»
Key words: Cumaside, MaxsarHystochrome®, cucumarioside А -2, isofl avonoids, immunomodulatory activity, antioxidant activity, inhibition of tumor cells colony growth.
Многие объекты уникального растительного мира и фауны российского Дальнего Востока и прилегающих морей содержат природные соединения, на основе которых могут быть созданы различные лекарственные препараты.
В Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН ранее были разработаны несколько новых лекарственных препаратов, разрешенных к применению и производству в России. В их числе - Гистохром® для кардиологии, Гистохром® для офтальмологии и недавно зарегистрированный и лицензированный гепатозащитный лекарственный препарат Максар®, применяющийся при токсических поражениях печени, хроническом гепатите и циррозе печени.
В настоящее время в институте продолжаются исследования, которые могут привести к созданию еще нескольких лекарственных препаратов, в их числе иммуностимулирующий Кумазид, противоаллергический и ранозаживляющий Коурохитин, неомитилановая мазь, препарат Транслам и др. Одновременно ведутся работы по расширению сферы медицинского применения ранее разработанных лекарств и созданию на их основе новых лекарственных форм. В особенности это касается препарата Максар®.
В настоящей статье приводятся некоторые данные, полученные в 2012-2013 гг. при изучении молекулярных механизмов и особенностей действия одного из разрабатываемых лекарственных средств - Кумазида, препаратов Максар® и Гистохром®, а также исследование зависимостей структура-активность для активных субстанций этих препаратов, их аналогов и производных.
Исследование компонентов активной субстанции препарата Кумазид и их аналогов
Было изучено влияние кукумариозида А2-2 (из голотурии Cucumaria japonica) - природного низкомолекулярного биорегулятора морского происхождения, основного компонента нового иммуностимулирующего препарата Кумазид, на транспорт Са2+ в перитонеальных мышиных макрофагах. Показано, что интенсивность соответствующей флуоресценции клеток в стадии покоя находится на низком уровне. Это свидетельствует о незначительном содержании свободного Са2+ в цитоплазме (в диапазоне концентраций 10-9-10-12 М). Если кукумариозид А2-2 исследовался в наномолярных иммуностимулирующих концентрациях в кальцийсодержащей среде, то через несколько секунд после добавления гли-козида наблюдалось выраженное резкое обратимое увеличение базального уровня [Ca2+] с последующим спадом до исходного уровня. Увеличение [Ca2+] было временным, длилось на протяжении 5-10 с (контроль - 0,72 ± 0,05, гликозид - 1,48 ± 0,07, уровень внутриклеточного кальция измерен через 10 с, p < 0,05, n = 5), и в течение последующих 40-60 с медленно достигался исходный уровень. Дозозависимая кривая имеет куполообразный характер с максимально эффективной концентрацией 0,02 мкМ. Наблюдалось два вида ответов клеток на добавляемый гликозид. Один тип клеток демонстрировал однократное быстрое кратковременное повышение концентрации кальция в цитоплазме макрофагов, в то время как в другом типе клеток наблюдались постоянные колебаниями (осцилляция) с частотой 1-3 в минуту и амплитудой от 0,9 до 1,2 относительных единиц [9].
Для того чтобы выяснить, с какой стороны Са2+ поступает в цитоплазму - из внеклеточного пространства или из внутриклеточного депо (эндоплазматического ретикулума и/или митохондрий), клетки культивировали в бескальциевой среде, где весь остаточный Са2+ был связан хелатором двухвалентных катионов - ЭГТА (5 мМ). При добавлении субтоксической дозы гликозида наблюдалось практически полное отсутствие увеличения
концентрации Са2+ в цитоплазме. Это свидетельствует о том, что под действием кукумари-озида А2-2 ионы кальция поступают в цитоплазму из внеклеточной среды. Для выяснения участия ряда мембранных структур в переносе ионов кальция в цитоплазму под действием гликозида был проведен ингибиторный анализ. Блокаторы потенциал-чувствительных кальциевых каналов, такие как верапамил, нифедипин и дилтиазем, преинкубированные с клеточным монослоем в эффективной концентрации 10-6 М, не блокировали увеличение концентрации кальция в цитоплазме после действия кукумариозида А2-2. Амилорид, ингибитор №+/Са2+-обменника в клетках, в концентрации 50 мкМ также оказался неэффективен. Применение блокатора в-белков, тиопроизводного дифосфата гуанозина, приводило к блокировке входа кальция только при высокой концентрации - > 1 мМ. Таким образом, было установлено, что кукумариозид А2-2 стимулирует в макрофагах вход Са2+ через хемочувствительные Са2+-каналы [2].
Кроме того, изучалось взаимодействие кукумариозида А2-2 со спленоцитами селезенки мышей. Было показано, что кукумариозид А2-2 в различных концентрациях вызывает существенное изменение эксимеризации зонда пирена в биомембранах этих клеток и, следовательно, микровязкости биомембран. Это свидетельствует о том, что гликозид взаимодействует с мембранами и интеркалирует в липидный бислой. Такое взаимодействие приводит к резкому и быстрому уменьшению эксимеризации пирена и увеличению интенсивности флуоресценции в регионе спектра, соответствующего мономерной форме пирена.
Было обнаружено, что изменения в микровязкости биомембран напрямую зависят от концентрации гликозида в инкубационной среде. Максимальное увеличение микровязкости регистрировалось при концентрации 1 мкМ, а минимальное - при 0,01 мкМ. Максимальное интеркалирование кукумариозида А2-2 и увеличение микровязкости регистрировалось в течение первых 1-2 мин взаимодействия гликозида с клетками. При концентрации гликозида 0,01 мкМ наблюдалось восстановление микровязкости до первоначального значения через 10 мин инкубирования.
Дополнительно было исследовано влияние кукумариозида А2-2 на мембранный потенциал макрофагов мышей. Перитонеальные макрофаги мышей линии БЛЬБ/е, нагруженные флуоресцентным зондом БЮС2(3), флуоресцируют при X = 500 нм при облучении X = 488 нм. Измеряемая интенсивность флуоресценции клеток была относительно высокой, что позволило регистрировать изменения флуоресценции во времени с использованием цифровой видеомикроскопии.
Было показано, что добавление в инкубационную среду кукумариозида А2-2 в концентрациях 0,001-0,1 мкМ приводит к резкому увеличению флуоресценции клеток, соответствующей деполяризации биомембран макрофагов. Вызванная гликозидом деполяризация была стабильной на протяжении 100 с. Затем значения мембранного потенциала возвращались к первоначальному уровню. Изменения мембранного потенциала, вызванного гликозидом, были концентрационно-зависимыми. Максимальное изменение мембранного потенциала наблюдалось при концентрации 0,1 мкМ [9].
Таким образом, установлено, что кукумариозид А2-2 в субтоксических иммуномодули-рующих концентрациях способен активировать резкий и обратимый вход ионов кальция в клетки из внеклеточного пространства. Такой тип индукции входа Са2+ в иммунокомпе-тентные клетки может служить сигнальным механизмом в инициации иммунного ответа макрофагов.
В ходе исследований изучили также фармакокинетическое поведение 3Н-кукумарио-зида А2-2 в гомогенате селезенки мышей. Была исследована динамика изменения концентрации радиоактивно-меченого кукумариозида А2-2 в селезенке мыши. Для описания фармакокинетики 3Н-кукумариозида Л2-2 при внутрибрюшинном способе введения препарата использовали двухкамерную фармакокинетическую модель первого порядка. После однократного внутрибрюшинного введения мышам 3Н-кукумариозида Л2-2 в дозе
5 мг/кг наблюдалось довольно быстрое поглощение препарата. Максимальная концентрация радиоактивно-меченого гликозида в гомогенате ткани селезенки мышей достигалась за 10-30 мин (T ), она составляла около 100 нг/мг сырого веса ткани (C ). Обнаруже-
v mas" А v max' í J
но, что гликозид выводился из органа с умеренной скоростью. Клиренс (Cl) составлял 21,5 мл/мин, период полувыведения препарата (T из селезенки - около 90 мин, а среднее время пребывания препарата (MRT) - 135 мин [8].
Также были проведены идентификация и количественное определение кукумариози-да А2-2 в гомогенате селезенки мыши. Для исследования фармакокинетического поведения кукумариозида А2-2 в органе-мишени методом масс-спектрометрии прежде всего были определены масс-спектрометрические характеристики кукумариозида A2-2. Спектральные данные для кукумариозида A2-2 получены методом МАЛДИ ВП (MALDI TOF) масс-спектрометрии на сухих образцах, с нанесением капли раствора препарата (1 мкл) в гомогенат ткани селезенки мышей и с использованием 7 мг/мл а-циано-4-гидроксицин-наминовой кислоты в качестве матрицы. Для исследования зависимости ионизационных свойств кукумариозида A2-2 и линейности сигнала масс-спектрометра от концентрации препарата раствор гликозида последовательно разбавляли в свежевыделенном гомогенате селезенки. Затем оценивали интенсивности его сигналов в масс-спектре. Были рассчитаны интенсивности сигналов от 5 индивидуальных спектров для каждой исследуемой концентрации препарата. Установлено, что интенсивность сигнала гликозида находится в линейной зависимости от его концентрации в диапазоне 1-1000 нг/мл (r2 = 0,996) с пределом обнаружения 1 нг/мл.
Для более точного количественного определения изменения содержания кукумариози-да A2-2 в ткани селезенки мышей во времени использовали внутренний стандарт тритер-пеновый гликозид фрондозид А из голотурии Cucumaria frondosa. Обнаружено, что при однократном введении кукумариозид А2-2 абсорбировался довольно быстро. Максимальная концентрация кукумариозида А2-2 в гомогенате ткани наблюдалась в первые 30 мин после введения, минимальные значения регистрировались через 3 ч. Кукумариозид A2-2 умеренно выводится из селезенки. Время полувыведения составило около 80 мин, а среднее время пребывания препарата (по MRT) - примерно 140 мин. Эти результаты сопоставимы с данными, полученными при исследовании фармакокинетики 3Н-кукумариозида А2-2 [8].
Была выполнена оценка пространственного распределения кукумариозида A2-2 методом МАЛДИ имиджинга (MALDI-IMS) в криогенных срезах селезенок мышей, отобранных через 15 мин после внутрибрюшинной инъекции препарата в дозе 15 мг/кг. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином для определения областей, где была сделана масс-спектрометрическая визуализация. Срезы получили из центральной части селезенки. На гистологических срезах были определены области серозной оболочки, красной и белой пульпы. Реконструкцию графического изображения масс-спектров гликозида в срезах селезенки выполнили с помощью программного обеспечения BioMAP. Кукумариозид А2-2, локализованный на срезе селезенки, хорошо детектировался с m/z 1295,2. Полученные с помощью метода MALDI-IMS изображения (при разрешении прибора в 200 мкм) показали, что основное количество гликозида концентрируется в области серозной оболочки, а не в красной или белой пульпе. На изображениях, полученных с более высокой четкостью, видно, что при разрешении 100 мкм гликозид почти равномерно распределен по серозной оболочке селезенки.
Следующим этапом была оценка распределения кукумариозида А2-2 в органе-мишени во времени. С этой целью мышам однократно вводили кукумариозид А2-2 в дозе 15 мг/кг (внутрибрюшинно), после чего селезенку отбирали через 15, 30 мин, 1, 2 и 3 ч. Распределение кукумариозида А2-2 определяли в ткани срезов селезенки мыши методом MALDI-IMS, чтобы выяснить, проникает ли лекарственное средство через барьер серозной оболочки. Полуколичественный анализ проводился путем сопоставления интен-
сивностей масс-спектров гликозида в различных структурах селезенки. Было отмечено, что при однократном введении гликозида максимально интенсивный сигнал наблюдается в первые 15-30 мин в области серозной оболочки, окружающей орган. Затем количество обнаруживаемого кукумариозида А2-2 начинает постепенно уменьшаться. Полученные за 60-180 мин после инъекции изображения четко отражают снижение концентрации препарата в поверхностной части органа (в серозной оболочке) и очень небольшое перераспределение во внутреннюю часть селезенки, соответствующую красной и белой пульпе [8].
Кроме того, изучалось влияние тритерпеновых гликозидов и их комплексов с холестерином на мультилекарственную устойчивость опухолевых клеток. В частности, провели исследование мультилекарственной устойчивости (МЛУ) клеток карциномы Эрлиха мышей с использованием флуоресцентного зонда кальцеин-АМ. Был установлен эффект блокирования МЛУ опухолевых клеток некоторыми тритерпеновыми гликозидами голотурий и их комплексами с холестерином. Показано, что фрондозид А, кукумариозид А2-2 и их комплексы с холестерином способны блокировать МЛУ в диапазоне концентраций от 0,001 до 1 мкг/мл. Наиболее эффективным был кукумариозид А2-2 в концентрации 0,001 мкг/мл: в его присутствии концентрация зонда кальцеин в цитоплазме опухолевых клеток увеличивалась на 54 % по сравнению с контрольными клетками. Верапамил, препарат сравнения, в максимально эффективной концентрации 0,012 мкг/мл вызывает увеличение флуоресценции зонда кальцеин в цитоплазме на 45-50 % от контроля [7].
Таким образом, способность фрондозида А, кукумариозида А2-2 и их комплексов с холестерином ингибировать множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток сопоставима с верапамилом, который не используется в терапии онкологических заболеваний только из-за высокой кардиотоксичности. Изученные тритерпеновые глико-зиды и их комплексы с холестерином и композиции на их основе могут быть применены в качестве лекарственных препаратов ингибирования множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток в очень низких концентрациях.
Исследование гепатопротекторной активности препарата
из корней мааакии амурской,
включая индивидуальные компоненты его активной субстанции
Из корней МааеЫа атигвтч^' были выделены и структурно идентифицированы методами хромато-масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС) и ЯМР 'И, 13С спектроскопии семь изофлавоноидов: даидзин (1), 7-О-гентиобиозид генистеина (2), 7-О-гентиобиозид псев-добабтигенина (3), 7-О-гентиобиозид формононетина (4), 3-0-гентиобиозид (6аЯ, 11аЛ)-маакиаина (5), 3-0-гентиобиозид (6аЯ, 11аК) медикарпина (6) и 7-О-гентиобиозид 5-О-метилгенистеина (7). Четыре гентиобиозида изофлавонов 2, 4, 7, а также птерокарпа-нов 5 и 6 были выделены из природного источника впервые [5].
Выделенные соединения входят в состав нового гепатопротективного средства.
Зарегистрированное в РФ гепатопротективное средство «Максар® таблетки, покрытые пленочной оболочкой» содержит изофлавоноиды и стильбены [6].
Из корней маакии амурской нами получен новый препарат, содержащий до 70 % изо-флавоноидов 1-7, который обладал более выраженными гепатопротективными свойствами, чем препарат Максар®
Выход суммы очищенных гентиобиозидов изофлавонов и птерокарпанов составлял 2,2 % в пересчете на сухие корни. Терапевтическую эффективность препарата оценивали по его влиянию на выживаемость животных, морфологические характеристики печени и биохимические показатели сыворотки крови в сравнении с препаратами Максар® и Легалон на экспериментальной модели СС14-гепатита. Показано, что средство, состоящее из изофлавоноидов 1-7, обладает выраженным гепатопротективным действием при поражении печени четыреххлористым углеродом, а механизм его терапевтического дей-
р-О-глюкопиранозил Гентиобиозил
(р-О-Ок)
К1 «э
1 р-0-01е Н Н
2 гентиобиозил ОН Н
3 гентиобиозил - -
4 гентиобиозил Н СН
5 гентиобиозил - -
6 гентиобиозил - -
7 гентиобиозил ОСН3 Н
ствия обусловлен реабилитирующим влиянием на нарушения метаболизма и функции печени, вызванные токсикантом. В частности этот препарат:
восстанавливает активность ферментов эндогенной системы антиоксидантной защиты организма супероксиддисмутазы (СОД), глутатионпероксидазы (ГПО) и глутатион-редуктазы;
сохраняет пул восстановленного глутатиона в системе антиоксидантной защиты печени; ингибирует свободнорадикальные реакции, повышает интегральную антирадикальную активность печени и уменьшает образование токсических продуктов липоперокси-дации;
стабилизирует мембраны гепатоцитов и тормозит выход в плазму крови печеночных ферментов, таких как аланинаминотрансфераза (АлАТ).
В результате было установлено, что новое гепатопротективное средство в условиях интоксикации четыреххлористым углеродом превосходит эталонные гепатопротекторы Максар® и Легалон по способности восстанавливать массу животных, удельную массу печени, количество общих липидов и активность АлАТ; повышать антирадикальную и антиоксидантную активность печени [1].
Были также изучены противоопухолевые свойства полифенольных фитоэстрогенов препарата Максар® для расширения сферы его медицинского применения. Исследовалось действие сухого экстракта ядровой древесины маакии амурской в качестве противоопухо-
левого средства в отношении клеток рака кишечника НТ-29 и DLD-1. Средство представляет собой высушенный под вакуумом спиртовой экстракт, полученный из измельченной ядровой древесины этого растения, и состоит из растительных полифенолов, обладающих гепатозащитным действием. Ранее сухой экстракт ядровой древесины маакии амурской был зарегистрирован в качестве субстанции (Р N003309/01 от 12.04.2004 г.) для приготовления лекарственного средства «Максар® таблетки, покрытые оболочкой, 60 мг» (Р N003294/01 от 12.04.2004 г.), применяемого для лечения хронических гепатитов.
Были исследованы жизнеспособность DLD-1 и НТ-29 клеток, обработанных сухим экстрактом ядровой древесины маакии амурской, и ингибирующее действие сухого экстракта ядровой древесины маакии амурской на рост колоний клеток рака кишечника человека DLD-1 и НТ-29.
Для оценки цитотоксичности использованы нормальные клетки кожи мышей JB6 С141, опухолевые клетки НТ-19, DLD-1 (рак кишечника человека), RPMI-7951 (меланома человека) и применен MTS-метод. Клетки (1-104/мл) рассеивали в 96-луночные планшеты и культивировали в 200 мкл соответствующей среды в инкубаторе при температуре 37 °С в течение 24 ч. Затем клетки обрабатывали веществами различной концентрации и инкубировали в течение 24 ч. После инкубации в лунки добавляли по 15 мкл 3-(4,5-диметил-тиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолия (MTS-реа-гент) и помещали в инкубатор (37 °С) на 4 ч.
MTS-метод основан на свойстве живых клеток трансформировать MTS-реагент в фор-мазан. Количество образовавшегося формазана пропорционально количеству оставшихся в живых клеток после воздействия вещества, оно определяется спектрофотометрически при 492 нм. Концентрации, при которых препарат проявил цитотоксичность, были следующие: 28, 52 и 73 мкг/мл в отношении клеток JB6 С141, DLD-1 и НТ-19, соответственно. Средство не проявило цитотоксичности к клеткам RPMI-7951 в концентрации до 100 мкг/мл.
Была также определена способность заявляемого средства ингибировать рост колоний клеток рака кишечника человека и меланомы человека (метод мягкого агара). Метод мягкого агара основан на том, что раковые клетки, находящиеся в неприкрепленном состоянии в толще мягкого агара, дают рост клеточных колоний, а вещества, обладающие антиопухолевым действием, ингибируют рост клеточных колоний. Эксперимент выполнен на клетках рака кишечника НТ-29 и DLD-1. Все вещества были растворены в диме-тилсульфоксиде (ДМСО), в качестве контроля для обработки клеток использовали ДМСО. Клетки рака кишечника человека НТ-29, DLD-1 и меланомы кожи человека RPMI-7951 (2,4-104 кл./мл) были обработаны экстрактами веществ в нецитотоксической концентрации до 7 мкг/мл в 1 мл 0,33 %-го ВМЕ агара поверх 3,5 мл 0,5 %-го ВМЕ агара, содержащего экстракты веществ в концентрации до 7 мкг/мл. Клетки культивировали при 37 °С, 5 % CO2 в течение 30 дней. Колонии клеток оценивали с использованием обратимого микроскопа (Motic AE 20, China) и Motic Image Plus программы (China). Для каждого вещества были выполнены два независимых эксперимента с тремя образцами для каждой концентрации. Для определения действия заявляемого средства на рост колоний раковых клеток в мягком агаре были выбраны концентрации до 7 мкг/мл, поскольку при концентрации 14 мкг/мл средство ингибировало рост колоний клеток НТ-29 и DLD-1 практически на 90 %.
Следует отметить, что при исследованных концентрациях (до 7 мкг/мл) не наблюдалось ингибирования роста колоний клеток меланомы кожи RPMI-7951, что указывает на избирательное действие сухого экстракта ядровой древесины маакии амурской по отношению к клеткам рака. Результаты показывают, что заявляемое средство в исследованном интервале концентрации ингибирует рост колоний клеток рака кишечника человека DLD-^ НТ-29. При концентрациях 4,1 и 8,8 мкг/мл для клеток DLD-1 и НТ-29, соответственно, происходит ингибирование роста колоний на 50 %. При концентрации 14 мкг/мл ингибирование роста колоний клеток НТ-29 под действием генистеина и сухого экстракта ядровой древесины маакии амурской составляет 48 и 87%, соответственно. Эти результаты
указывают на то, что заявляемое средство обладает более сильным противоопухолевым действием по отношению к клеткам рака кишечника человека по сравнению с генистеи-ном [4].
Для оценки антиоксидантных свойств нового гепатопротективного препарата (изофла-воноидов 1-7 из корней М. атигетч5) исследовали влияние гликозидов изофлавонов и птерокарпанов 1-7, выделенных из корней маакии амурской, на параметры свободнора-дикального окисления. Окислительный стресс был индуцирован у животных субплантар-ной инъекцией раствора формалина. В результате окислительного стресса у животных контрольной группы (II) наблюдалось значительное увеличение концентрации малонового диальдегида (МДА) и других продуктов пероксидации липидов, взаимодействующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), по сравнению с интактными животными (группа I). Кроме этого окислительный стресс, активированный различными антиоксидантными механизмами, повышал активность ферментов антиоксидантной защиты организма, особенно ГПО, СОД и каталазы (КАТ) [6].
Предварительное введение животным спиртового экстракта и суммы изофлавоноидов 1-7 из корней М. атигетч5 в течение двух недель (группы III и IV) в дозе 25 мг/кг массы тела приводило к уменьшению концентрации МДА и других продуктов пероксидации липидов, взаимодействующих с ТБК, в 2,5 раза при сравнении с интактными животными группы I и в 4 раза - с животными контрольной группы II.
Наши эксперименты показали, что при окислительном стрессе наблюдалось двукратное уменьшение активности ГПО у крыс, получавших суммарный этанольный экстракт или сумму изофлавоноидов 1-7. Однако активности ферментов СОД и КАТ в плазме крови подопытных животных были выше, чем у интактных животных (группа I).
Таким образом, при окислительном стрессе предварительная обработка животных изо-флавоноидами 1-7 в дозе 25 мг/кг в большей степени ингибирует прооксидантную активность и уменьшает активность ГПО, чем препарат Максар® в дозе 100 мг/кг.
Значительная биологическая активность (антиоксидантная и гепатопротективная) ген-тиобиозидов изофлавонов и птерокарпанов 1-7 может быть вызвана их более высокой растворимостью в воде, а следовательно, их более высокой биодоступностью по сравнению с изофлавонами и птерокарпанами из древесины М. атигетч5 (препарат Максар®).
Таким образом, наши предыдущие результаты в сочетании с данными, полученными в настоящем исследовании, показывают, что корни маакии амурской являются новым биологическим источником изофлавоноидов с хорошим потенциалом для их использования в фармацевтической промышленности.
Исследование препарата Гистохром®
В ходе исследований препарата Гистохром® было показано, что угнетение ми-кросомального окисления ослабляет его диуретический эффект для крыс.
Возникшие также в процессе клинического применения препарата Гистохром® вопросы относительно его биотрансформации предопределили цель данного исследования -изучить участие монооксигеназной системы печени в обеспечении фармакологической активности Гистохрома®.
Простым и информативным методом прижизненного контроля влияния монооксиге-назной системы печени на метаболизм лекарственного средства является оценка изменений фармакологического эффекта исследуемого препарата на фоне ингибитора микро-сомального окисления. В экспериментах на крысах изучено влияние хлорамфеникола на диуретический эффект Гистохрома® как наиболее удобный для скрининга [3].
Контрольной группе животных (15 крыс) подкожно вводили Гистохром® в дозе 10 мг/кг массы тела в течение 10 сут. Опытная группа крыс (16 животных) за 3 ч до введения Гистохрома® перорально получала хлорамфеникол в дозе 50 мг/кг массы тела. В обеих
исследуемых группах каждые 2 сут измеряли объем суточного диуреза, экскрецию креа-тинина (ммоль/сут) и ионов Na+ и K+ (мкмоль/сут). До введения препаратов у животных оценивали базальный уровень показателей экскреторной функции почек.
Длительное применение Гистохрома® сопровождалось пятикратным увеличением диуреза и параллельным ростом экскреции креатинина. Выделение ионов натрия статистически значимо возрастало на 11-е сутки эксперимента, а калия - начиная с 9-х суток введения Гистохрома®. В условиях превентивного применения хлорамфеникола объем суточного диуреза и экскреция креатинина оказались значительно ниже контрольных показателей. Выделение с мочой ионов натрия уменьшилось почти в 2 раза по сравнению со значениями, зафиксированными при введении Гистохрома® животным контрольной группы. Экскреция ионов калия соответствовала исходному уровню на протяжении всего периода наблюдения.
Учитывая, что хлорамфеникол является мощным ингибитором микросомального окисления в печени, логично предположить, что ослабление экскреторной функции почек связано с угнетением метаболизма эхинохрома А, а мочегонный эффект препарата обусловлен не столько нативным соединением (эхинохромом А), сколько продуктами его метаболизма. Скорее всего, метаболиты эхинохрома А повышают скорость клубоч-ковой фильтрации, обеспечивая диуретическую реакцию препарата.
Заключение
В ходе наших исследований получены новые интересные данные, касающиеся свойств препарата Кумазид, компонентов его активной субстанции и их аналогов. Установлено, что кукумариозид А2-2 в субтоксических иммуномодулирующих концентрациях способен активировать резкий и обратимый вход ионов кальция в клетки из внеклеточного пространства. Такой тип индукции входа Са2+ в иммунокомпетентные клетки может служить сигнальным механизмом в инициации иммунного ответа макрофагов.
Изучено фармакокинетическое поведение 3Н-кукумариозида А2-2 в гомогенате селезенки мышей. Разработана методика идентификации и количественного определения ку-кумариозида А2-2 в гомогенате селезенки мыши методом МАЛДИ ВП масс-спектромет-рии. Полученные результаты сопоставимы с данными исследования фармакокинетики 3Н-кукумариозида А2-2 методом радиоизотопного анализа, что открывает возможность проводить фармакокинетические исследования без использования радиоактивных изотопов. Впервые в России применен метод МАЛДИ имиджинга, с помощью которого изучено пространственное распределение кукумариозида A2-2 в криогенных срезах селезенок мышей. Это дает возможность прямого контроля за распределением лекарственных метаболитов в тканях и органах животных.
Изучено влияние тритерпеновых гликозидов и их комплексов с холестерином на муль-тилекарственную устойчивость опухолевых клеток. Показано, что изученные тритерпе-новые гликозиды и их комплексы с холестерином и композиции на их основе могут быть применены в качестве препаратов ингибирования множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток в очень низких концентрациях.
Изучены индивидуальные полифенольные метаболиты из корней растения M. amurensis, установлены их структуры. Показано, что новый гепатопротективный препарат из корней M. amurensis обладает противоопухолевыми свойствами in vitro. Изучено влияние гентиобиозидов изофлавонов и птерокарпанов из корней маакии амурской на параметры свободнорадикального окисления. Установлено, что при окислительном стрессе предварительная обработка животных изофлавоноидами в большей степени ин-гибирует прооксидантную активность, чем препарат Максар®.
Впервые показано, что угнетение микросомального окисления ослабляет диуретический эффект препарата Гистохром® у крыс. Установлено, что мочегонный эффект препарата обусловлен не столько нативным соединением (эхинохром А), сколько продуктами его метаболизма.
ЛИТЕРАТУРА
1. Кулеш Н.И., Федореев С.А., Веселова М.В., Мищенко Н.П., Кушнерова Н.Ф., Спрыгин В.Г., Фоменко С.Е. Гепатопротективное средство: пат. № 2454243; опубл. 27.06.2012, Бюл. № 18.
2. Пислягин Е.А., Соколов Р.А., Асташев М.Е., Аминин Д.Л. Влияние кукумариозида А2-2 на динамику транспорта ионов Са2+ в иммунокомпетентных клетках // Материалы II Междунар. конф. «Перспективные направления биомедицинских технологий», Владивосток, 17-18 мая 2012. Владивосток, 2012. С. 43-49.
3. Талалаева О.С., Жариков А.Ю., Зверев Я.Ф., Федореев С.А., Брюханов В.М., Лампатов В.В. Угнетение микросомального окисления ослабляет диуретический эффект препарата гистохром у крыс // Бюл. сиб. медицины. 2013. Т. 12, № 3. С. 69-75.
4. Федореев С.А., Кулеш Н.И., Мищенко Н.П., Ермакова С.П., Звягинцева Т.Н. Средство, обладающее противоопухолевой активностью: пат. № 2414920; опубл. 27.03.2011, Бюл. № 9.
5. Fedoreyev S.A., Kulesh N.I., Veselova M.V., Mischenko N.P., Zverev Y.F., Zamyatina S.V. Isoflavonoids from the roots ofMaackia amurensis Rupr. et Maxim // 2nd International Symposium on Life Sciences. Vladivostok, 2013. P. 9.
6. Kulesh N.I., Fedoreyev S.A., Veselova M.V., Mischenko N.P., Denisenko V.A., Dmitrenok P.S., Zverev Y.F., Zamyatina S.V. Antioxidant activity of the isoflavonoids from the roots of Maackia amurensis // Nat. Prod. Commun. 2013. Vol. 8, N 5. P. 589-592.
7. Menchinskaya E.S., Aminin D.L., Avilov S.A., Silchenko A.S., Andryjashchenko P.V., Kalinin V.I., Stonik V.A. Inhibition of tumor cells multidrug resistance by cucumarioside A2-2, frondoside А and their complexes with а cholesterol // Nat. Prod. Commun. 2013. Vol. 8, N 10. P. 1377-1380.
8. Pislyagin E.A., Dmitrenok P.S., Gorpenchenko T.Yu., Avilov S.A., Silchenko A.S., Aminin D.L. Determination of cucumarioside A2-2 in mouse spleen by radiospectroscopy, MALDI-MS and MALDI-IMS // Eur. J. Pharm. Sci. 2013. Vol. 49. P. 461-4672.
9. Pislyagin E.A., Gladkikh R.V., Kapustina I.I., Kim N.Yu., Shevchenko V.P., Nagaev I.Yu., Avilov S.A., Aminin D.L. Interaction of holothurian triterpene glycoside with biomembranes of mouse immune cells // Int. Immuno-pharmacol. 2012. Vol. 14. P. 1-8.
