CC BY
68
Medical Immunology/
Медицинская иммунология ОЮЫгННаЛЬНЬ1@ C^fttt^ftbU Meditsinskaya Immunologiya 2014, Т. 16, № 5, стр. 443-448 * ^ . . . . . 2014, Vol. 16, No 5, pp. 443-448
© 2014, СПб РО РААКИ Original articles © 2014, SPb RAACI
ИЗУЧЕНИЕ ЛИГАНД-ОПОСРЕДОВАННОГО ХЕМОТАКСИСА КЛЕТОК МАКРОФАГАЛЬНОЙ ЛИНИИ U937
Филина А.Б.1, Свитич О.А.1, Ганковская Л.В.2, Лабжинов П.А.1, Парфенова Т.М.1, Зверев В.В.1
1ФГБУ«Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН, Москва, Россия
2 ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России, Москва, Россия
Резюме. В настоящее время очень остро стоит вопрос о лечении онкологических заболеваний. Большое значение в их развитии имеет метастазирование, которое напрямую зависит от хемотаксиса опухолевых клеток.
Цель: изучение миграции опухолевых клеток на примере лиганд-опосредованного хемотаксиса клеток макрофагальной линии U937.
В качестве хемоаттрактантов использовались синтетические лиганды TLR (DNA_lig, RNA_lig). Изучение экспрессионного профиля TLRs (TLR2, TLR3, TLR7, TLR9) мигрировавших клеток проводилось в динамике с помощью камеры Бойдена и метода ПЦР в режиме реального времени клеток.
Была выявлена повышенная миграция клеток по направлению к DNA_lig и TNFa. Экспрессия TLR2, TLR7 и TLR9 значимо увеличились под воздействием TNFa в 1,5, 4 и 19 раз соответственно. Под воздействием DNA_ lig увеличилась экспрессия TLR9 в 105 и TLR3 в 2 раза, но снизилась экспрессия TLR2. При воздействии RNA_lig экспрессия TLR3 увеличилась в 3 раза.
Полученные данные могут быть использованы с целью снижения хемотаксиса опухолевых клеток путем воздействия на данные лиганды и на разные звенья хемотаксиса.
Ключевые слова: хемотаксис, опухолевые клетки, U937, TLRs, хемокины, камера Бойдена
DOI: http://dx.doi.org/10.15789/1563-0625-2014-5-443-448
Введение процесс опосредован хемокинами, ростовыми
„ „ факторами и их рецепторами. Хемокины активи-
В течение последних десятилетий учеными
руют рост опухолевых клеток, ангиогенез, про-активно разрабатываются методы и лекарствен- f^t-j > > г
ные препараты, способные излечить или замед- тивоопухолевый иммунитет и другие пр°цессы. лить онкологические процессы в организме че- В первую очередь хемокины, выделяемые опухо-ловека. Недавние исследования американских левыми к^тсами участвуют в хемотаксисе крученых показали, что очень большую роль в раз- ток иммунной системы: CCL2 и CCL5 являются витие злокачественных опухолей и их метастази- хемоаттрактантами для моноцитов и нейтрофи-ровании играет процесс хемотаксиса [4, 8]. Этот лов, которые в последующем участвуют в инакти-
Авторы:
Филина А.Б. — лаборант-исследователь лаборатории молекулярной иммунологии ФГБУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН, Москва, Россия Свитич О.А. — д.м.н., заведующая лабораторией молекулярной иммунологии «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН, Москва, Россия
Ганковская Л.В. — д.м.н., профессор, и.о. заведующего кафедрой иммунологии ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России, Москва, Россия
Лабжинов П.А. — заочный аспирант лаборатории молекулярной иммунологии ФГБУ «Научно-
исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН, Москва, Россия
Парфенова Т.М. — старший научный сотрудник лаборатории диагностики вирусных инфекций ФГБУ «Научно-
исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН, Москва, Россия
Зверев В.В. — д.б.н., профессор, академик РАН, директор ФГБУ «Научно-исследовательский институт вакцин
и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН, Москва, Россия
Адрес для переписки: Поступила 18.02.2014
Свитич Оксана Анатольевна Отправлена на доработку 27.03.2014
д.м.н., заведующая лабораторией молекулярной иммунологии ФГБУ Принята к печати 14.04.2014 «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН
105064, Россия, Москва, Малый Казенный пер., 5а. Тел.: 8 (926)148-83-22.
E-mail: [email protected] © Филина А.Б. и соавт., 2014
вации иммунного ответа на опухолевые антигены [6]. В свою очередь опухоль — ассоциированные нейтрофилы и макрофаги выделяют иммунносу-прессивные цитокины, такие как ^-10, TGF-p, и разнообразные хемокины, такие как CCL4, CCL7, CCL22 и СXCL12, которые инактиви-руют функционирование Т-клеток. Также опухолевые клетки продуцируют такие хемокины, как СХ^12, CXCL2 и CXCL8, к которым имеются рецепторы на поверхности эндотелиальных клеток сосудов, что в свою очередь активирует ангиогенез в опухолевую ткань. При воздействии же хемокинов на опухолевые клетки наблюдается инвазия и диссеминация. На данный момент по материалам зарубежных статей известно, что на поверхности клеток опухолей есть такие рецепторы, как CXCR4 и CXCR7. Перициты (от-ростчатая клетка соединительной ткани мелких сосудов) выделяют CXCL12, который является лигандом для CXCR4, а опухоль-ассоциирован-ные фибробласты выделяют CCL21, который является лигандом для CCR7. Воздействуя на свои рецепторы, CCL21 и CXCL12 активируют поляризацию и протрузию клетки в сторону сосуда, что обуславливает инвазию и диссеминацию [6, 8].
На основании данных литературы можно сказать об актуальности исследования хемотаксиса в онкологии. Данное направление очень перспективно с возможностью дальнейшего определения рецепторного аппарата различных типов опухолей и воздействия на хемотаксис опухолевых клеток с целью снижения метастазирования.
Цель данного исследования — изучение миграции опухолевых клеток на примере лиганд-опос-редованного хемотаксиса клеток макрофагаль-ной линии и937.
Материалы и методы
В качестве исследуемого материала использовалась культура клеток линии U937. Данная культура была любезно предоставлена научным сотрудником ГУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи РАМН» Т.М. Парфеновой. Клетки U937 являются моноцитарны-ми клетками, полученными из гистиоцитарной лимфомы [6, 7].
В качестве хемоаттрактантов использовались следующие синтетические лиганды DNA_ lig (ccg-gtc-cac-aag-ggg-ggc-ca) и RNA_lig (ccg-agg-aug-cga-ggc-uug-uu), последовательности которых были аналогичны последовательностям вирусов из базы данных GeneBank. Синтетические лиганды и праймеры для ПЦР были синтезированы на фирме Синтол (Россия).
Для изучения хемотаксиса клеток использовались следующие методы: хемотаксис in vitro в ка-
мере Бойдена; подсчет клеток в камере Горяева. Для исследования хемотаксиса in vitro использовалась камера Бойдена фирмы BD Falcon™ HTS FluoroBlok™ 96-Multiwаll Insert System (компания «Биолайн», Россия). В верхний отсек камеры помещалась взвесь клеток линии U937 в объеме 30 мкл и количестве 60±1 х 103. В нижний отсек камеры вносили хемоаттрактант (лиганд) в объеме 250 мкл в концентрации 10 мкг/1 мл. Эксперимент хемотаксиса проводился в динамике через 10, 30, 60 мин и через 4 суток с использованием вышеперечисленных лигандов. В качестве контроля использовали среду RPMI-1640 без глутамина (ПанЭко, Россия) и TNFa (eBiosciene, Австрия). Подсчет клеток проводился в камере Горяева [2].
Для определения уровня экспрессии генов TLR2, TLR3, TLR7, TLR9 из мигрировавших клеток была выделена РНК с помощью набора «РИБО-сорб» (ИЛС, Россия), далее проведены реакция обратной транскрипции (ОТ-1, Синтол, Россия) и ПЦР-РВ («Набор реагентов с SYBR Greenl», Синтол, Россия) на амплифи-каторе ДТ-96 (ДНК-технология, Россия). Реакционная смесь для ПЦР — РВ содержала 18 мкл: 10 пкмоль/мкл праймера (1 мкл); 20 Мм MgCl2 (2 мкл); 2 мкл 10 х ПЦР буфера Б; 2 мМ dNTP (2 мкл); 10 мкл H2O; 0,5 Е/мкл ДНК-полимеразы (0,3 мкл); 3 мкл образца. ПЦР проводилась по программе 94 °С — 5 мин (60 °С — 40 сек, 94 °С — 40 сек) 40 циклов. Уровень экспрессии исследуемых генов проводили относительно экспрессии гена р-актина [3, 11, 16].
Статистический анализ проводили с использованием компьютерной статистической программы BioStat, а также программы Excel. В таблицах и рисунках результаты представлены в виде Х±а. В связи с разным числом наблюдений в каждой из групп для оценки статистической достоверности различий в количестве мигрировавших клеток и в уровнях экспрессии генов TLRs использовали непараметрический критерий Манна—Уитни [1].
Результаты
По данным литературы проводились эксперименты по направленному движению опухолевых клеток по направлению к разнообразным хемокинам [6, 8]. В нашей работе был исследован хемотаксис опухолевых клеток с хемокинами, которые предположительно могут влиять на миграцию опухолевой культуры.
На первом этапе исследовалась динамика миграции клеток в камере Бойдена. Подсчет клеток, мигрировавших в нижний отсек камеры, производился через следующие временные промежутки: 10 мин, 30 мин, 60 мин, 4 суток. В качестве
хемокинов были использованы следующие ли-гадны: TNFa, DNA_ RNA_lig.
Спонтанная миграция опухолевых клеток в среде RPMI была следующей: в течение часа миграция клеток миграции клеток линии и937 планомерно снижалась, последующие 4 суток было резкое возрастание миграции.
Результаты показали, что миграция по направлению к DNA_ % имеет положительную динамику: миграция через 4 суток возросла в 2 раза. Также под воздействием TNFa миграция опухолевых клеток резко возрастает: в течение 4 суток увеличилась в четыре раза. Полученные данные достоверно отличаются от контроля на протяжении всего эксперимента. Миграция опухолевых клеток по направлению к RNA_lig схожа со спонтанным хемотаксисом. Но в отличие от контроля, миграция по направлению к RNA_lig_2 на промежутке 60 мин и 4 сут. возрастает более постепенно и стабильно, но менее резко (рис. 1).
Можно сделать заключение, что миграция клеток опухолевой линии и937 повышалась по направлению к TNFa и DNA_ что может говорить об активации данными лигандами хемотаксиса.
На втором этапе мы изучали экспрессию То11-подобных рецепторов у мигрировавших клеток к выбранным нами препаратам, поскольку предположительно имеется связь между опухолевой пролиферацией и активностью TLRs [5, 9, 10]. Также известно, что опухолевые клетки (плаз-магические клетки из множественной миеломы) экспрессируют более широкий спектр TLRs нежели клетки здорового человека [10]. Основываясь на вышеперечисленных данных, можно сказать, что изучение воздействия новых лиган-дов, возможно, активирующих экспрессию TLR, и непосредственно самих То11-подобных рецепторов необходимо для большего понимания связи между этими двумя механизмами и возможности дальнейшего воздействия на него.
Проводилось изучение экспрессии следующих генов TLR2, TLR3, TLR7 и TLR9 в клетках опухолевой линии и937 после миграции. Так, уровень экспрессии гена TLR2 достоверно увеличивался относительно контрольных значений под действием цитокина TNFa практически в 2 раза, при воздействии DNA_ % статистически значимо снижался в два и более раз. Экспрессия гена TLR3 достоверно увеличивается под воздействием RNA_lig в 3 раза и по воздействием
с
о
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200
L''
Ж' / 1
Т
г \ * / \ / / \ / .. / \ .......
/ д-'/'х
/ •• / 1---/
/у S
0
4
5
-х -Контроль ...........DNA_ lig -RNA_lig---TNFa
Рисунок 1. Динамика миграции опухолевых клеток линии U937 в камере Бойдена спонтанно и по направлению к лигандам
Примечание. По оси абсцисс - время, через которое проводили измерение мигрировавших клеток: 1 - 0 мин; 2 - 10 мин; 3 - 30 мин; 3 -60 мин; 4 - 4 суток.
По оси ординат - количество мигрировавших клеток спонтанно или по направлению к лигандам. * - показатель достоверно отличается от показателя в группе сравнения (спонтанная миграция) - р < 0,05.
2500
2000
1500
1000
500
Ш
TLR2
TLR3 TLR7
Контроль □ DNA_ lig □ RNA_lig □ TNFa
TLR9
Рисунок 2. Лиганд-опосредованная экспрессия TLR2, TLR3, TLR9 в мигрировавших клетках линии U937
Примечание. По оси абсцисс - исследуемый показатель - TLR.
По оси ординат - уровень экспрессии гена TLR (количество копий исследуемого гена относительно уровня экспрессии гена актина) под воздействием разных лигандов.
* - показатель достоверно отличается от показателя в группе сравнения (спонтанная миграция) - р < 0,05.
*
*
*
*
*
0
DNA_ % — в 2 раза по сравнению с контролем. Экспрессия гена TLR7 статистически значимо увеличивается в 4 раза (TNFa). Экспрессия под действием других лигандов увеличивалась недостоверно относительно контроля. Экспрессия гена TLR9 увеличивается под воздействием DNA_ % и TNFa в 105 раз и в 17 раз, соответственно, по сравнению с показателем в интакт-ной культуре (рис. 2).
Обсуждение
Из результатов проведенного исследования известно, что под действием TNFa увеличивается уровень экспрессии генов TLR7 и TLR9 в опухолевых клетках линии и937 и усиливается хемотаксис по сравнению с интактной культурой клеток. Под воздействием DNA_ % наблюдалось усиления хемотаксиса на протяжение всего эксперимента (в течение 4 суток происходило медленное, но планомерное усиление) и наблюдалось увеличение экспрессии TLR3 и TLR9. Недавно учеными Медицинской Школы Йельского Университета была показана связь между воздействием провоспалительных цитокинов на TLRs и развитием онкологического процесса при хроническом воспалении [13, 15]. Также было выяснено, что образование опухолевых клеток и повышенный канцерогенез в хроническом вос-
палении выражены при активации только тех TLRs, чей сигнальный путь был связан с внутриклеточным белком MyD88 [12, 14]. В дальнейшем были проведены исследования экспрессии белка MyD88 в опухолевых клетках при макроглобу-линемии Вальденстрема и в лимфоцитах здоровых доноров. Было выяснено, что в опухолевых клетках присутствует измененная структура белка MyD88 в отличие от лимфоцитов здоровых людей, что указывает на связь онкологического процесса с изменениями в сигнальных путях, где участвует данный белок [14].
В свою очередь была замечена усиленная экспрессия MyD88 в солидных опухолях, особенно в колоректальном раке. Соответственно, можно говорить о связи развития малигнизации, чрезмерной активации белка MyD88 путем воздействия провоспалительных цитокинов на TLRs или мутации этого белка. Также MyD88 активирует сигнальный путь NF-кB, который в свою очередь ведет к усиленному синтезу провоспа-лительных хемокинов, а в особенности таких, как CXCL2, 6, которые являются хемоаттрактан-тами [14, 15]. Соответственно, прослеживается прямая связь между хроническим воспалением, воздействием экзогенных и эндогенных лигандов на свои TLRs и развитием онкологического про-
цесса, а в частности — хемотаксиса опухолевых клеток.
Сопоставив проведенные нами опыты с известными данными по TLRs, можно сказать, что активация ^^ 2, 7, 9 ведет к усилению хемотаксиса опухолевых клеток, путем активации сигнального пути MyD88, при этом мы можем наблюдать снижение хемотаксиса клеток, на которых был обнаружен TLR3, связанный с другим сигнальным путем. Известно, что передача внутриклеточного сигнала от TLR3 идет по пути TRIF, т.е. не по пути известного нам уже MyD88 [14]. Нами также было изучено, что по направлению к RNA_lig хемотаксис почти не меняется в сравнении с контролем, и при этом наблюдается повышение экспрессии TLR3 по отношению к эспрессии данного гена в интактной культуре. Соответственно, активация пути TRIF, по данным нашего исследования, не влияет на хемотаксис опухолевых клеток.
Таким образом, опираясь на полученные данные и проведенные ранее работы ученых, можно сказать, что изменения в MyD88 и его активация в опухолевых клетках влияют не только на пролиферацию опухолевых клеток, но и на их хемотаксис, соответственно, на метастазирование клеток. Из вышесказанного следует, что возможно воздействие на ^^ и на MyD88 (его инги-бирование) с целью снижения канцерогенеза в клетках, пролиферации опухолевых клеток и их хемотаксиса. Продолжая изучать в дальнейшем движение клеток опухолей, мы сможем с большей точностью сказать о воздействии на него лигандов, и появится возможность снижать скорость метастазирования или же полностью его прекратить, блокируя механизм передачи сигнала в клетку или сам лиганд. Изучение взаимосвязи рецепторного аппарата и миграции клетки также даст нам возможность снизить метастази-рования, блокируя или активируя определенный рецептор, в зависимости от его природы.
Список литературы / References
1. Гланц С. Медико-биологическая статистика: Пер. с англ. М.: Практика 1999. 459 с. [Giants S. Mediko-biologicheskaya statistika. Per. s angl. [Biomedical statistics.Engl. Transl.]. Moscow: Practice, 1999. 459 p.]
2. Ковальчук Л.В., Игнатьева Г.А., Ганковская Л.В. Иммунология. Практикум. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010.192 c. [KovaFchuk L.V., Ignafeva G.A., Gankovskaya L.V. Immunologiya. Praktikum [Immunology. Practical course]. Moscow: GEOTAR-Media, 2010. 192 p.]
3. Ребриков Д.В. ПЦР в реальном времени. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2011. 223 с. [Rebrikov D.V. PTSR v realnom vremeni [PCR in real time]. Moscow: Binom, 2011. 223 p.]
4. Ярилин АА. Иммунология. M., 2012. С. 80-123. [Yarilin A.A. Immunologiya [Immunology]. Moscow, 2012, pp. 80-123.]
5. Bohnhorst J.,Rasmussen T., Moen SH., Flerttum M., Knudsen L., B0rset M., Espevik T., Sundan A. Toll-like receptors mediate proliferation and survival of multiple myeloma cells. Leukemia. 2006, vol. 20, no. 6, pp. 1138-1144.
6. Borsig L., Wolf M.J., Roblek M., Lorentzen A. and Heikenwalder M. Inflammatory chemokines and metastasis — tracing the accessory. Oncogene, 2013, pp. 1-8.
7. Christer Sundstram, Kenneth Nilson. Establishment and characterization of a human histiocitic lymphoma cell line (U-937). Int. J. Cancer, 1976, no. 17, pp. 565-577.
8. Evanthia T. Roussos, John S. Condeelis and Antonia Patsialou. Chemotaxis in cancer. Nature Reviews Cancer. 2011, Vol. 11, pp. 573-587.
9. Istvdn Fiiri, Ferenc Sipos, Tiana M. Germann, Aleksandra Kalmir, Zsolt Tulassay, Molnir B., Mtizes G. Epithelial toll — like receptor 9 signaling in colorectal inflammation and cancer: Clinico — pathogenic aspects. World Journal of Gastroenterology, 2013, Vol. 19, no. 26, pp. 4119-4126.
10. Jego G., Bataille R., Geffroy-Lozeau A., Descamps G., Pellat-Deceunynck C. Pathogen-associated molecular patterns are growth and survival factors for human myeloma cells through Toll-like receptors. Leukemia,
2006, Vol. 20, no. 6, pp. 1130-1137.
11. Koval'chuk L.V., Gankovskaya L.V., Gankovskaya O.A. Herpes simplex virus, innate immunity and treatment Immune Mediated Diseases: From Theory to Therapy. Advances in Experimental Medicine and Biology,
2007, Vol. 601, p. 480.
12. Ngo V.N., Young R.M., Schmitz R., Jhavar S., Xiao W, Lim K.H., Kohlhammer H., Xu W., Yang Y, Zhao H., Shaffer A.L., Romesser P., Wright G., Powell J., Rosenwald A., Muller-Hermelink H.K., Ott G., Gascoyne R.D., Connors J.M., Rimsza L.M., Campo E., Jaffe E.S., Delabie J., Smeland E.B., Fisher R.I., Braziel R.M., Tubbs R.R., Cook J.R., Weisenburger D.D., Chan WC., Staudt L.M. Oncogenically active MYD88 mutations in human lymphoma. Nature, 2011, Vol. 470, no. 7332, pp. 115-119.
13. Rakoff-Nahoum S, Medzhitov R. Toll-like receptors and cancer. Nat. Rev. Cancer, 2009, vol. 9, no. 1, pp. 5763.
14. Salcedo R., Cataisson C., Hasan U., Yuspa S.H., Trinchieri G. MyD88 and its divergent toll in carcinogenesis. Trends in Immunology 2013, Vol. 34, no. 8, pp. 379-389.
15. Dimicoli S., Wei Y, Bueso-Ramos C., Yang H., DiNar C., Jia Y., Zheng H., Fang Z., Nguyen M., Pierce S., Chen R., Wang H., Wu C., Garcia-Manero G. Overexpression of the Toll-Like Receptor (TLR) Signaling Adaptor MYD88, but Lack of Genetic Mutation, in Myelodysplastic Syndromes. PLoS One, 2013, no. 8, pp. 1-9.
16. Svitich O., Gankovskaya L., Lavrov V., Grigoreva O., Karaulov A., Zverev V. Herpes simplex virus type 2 infection during pregnancy is correlated with elevated TLR9 and TNF expression in cervical cells. International Trends in Immunology, 2014, Vol. 1, no. 1, pp. 62-66.
Medical Immunology/ Meditsinskaya Immunologiya noiriMAi adtipi cc
2014, Vol. 16, No 5, pp. 443-448 OrI«INAl AR|ICLES
LIGAND INDUCED CHEMOTAXIS OF MACROPHAGE CELL LINE U937
Filina A.B.a, Svitich O.A.a, Gankovskaya L.V.b, Labzhinov P.A.a, Parfenova T.M.a, Zverev V.V.a
a I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Serums, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow, Russian Federation
b N.I. Pirogov Russian State Medical University, Moscow, Russian Federation
Abstract. Treatment of malignant tumors is among challenging issues of clinical medicine. Dissemination and matestasis of tumor cells plays a major role in oncology, being immediately dependent on chemotaxis of tumor cells. Hence, the aim of our study is to evaluate migration of tumor cells, in terms of ligand-mediated chemotaxis of a human U 937 lymphoma cell line. Synthetic TLR ligands (DNA_lig, RNA_lig) were used as chemoattractants. Assessment of time-dependent TLR expression by the migrating cells (including TLR2, TLR3, TLR7, TLR9) was carried out by means of real-time PCR, using Boyden's chamber system for the migration assays. We have revealed an increased cell migration towards DNA_ lig and TNFa gradient. Expression of TLR2, TLR7 and TLR9 was found to be increased under the influence of TNFa (respectively 1.5-, 4- and 19-fold). Under the influence of DNA_lig, TLR9 expression was 105-fold increased, whereas TLR3 expression was 2-fold higher, along with decrease of TLR2 expression. Expression of TLR 3 was shown to be 3-times higher under the influence of RNA_lig. The effects observed could be potentially applied for suppression of tumor cell chemotaxis by means of these ligands and by influencing different pathways of chemotaxis regulation. (Med. Immunol., 2014, vol. 16, N5, pp 443-448)
Keywords: chemotaxis, tumor cells, U937 line, TLRs, chemokines, Boyden chamber assay
DOI: http://dx.doi.org/10.15789/1563-0625-2014-5-443-448
Authors:
Filina A.B., Laboratory Assistant, Laboratory of Molecular Immunology, I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Serology, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow, Russian Federation
Svitich O.A., PhD, MD (Medicine), Chief, Laboratory of Molecular Immunology, I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Serology, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow, Russian Federation Gankovskaya L.V., PhD, MD (Medicine), Chief, Department of Immunology, N.I. Pirogov Russian State Medical University, Russian Ministry of Health Care, Moscow, Russian Federation
Labzhinov P.A., PhD Candidate, Laboratory of Molecular Immunology, I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Serology, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow, Russian Federation
Parfenova T.M., Senior Research Associate, Laboratory of Viral Diagnostics, I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Serology, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow, Russian Federation Zverev W, PhD, MD (Biology), Professor, Full Member of RAS, Director, I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Serology, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow, Russian Federation
Address for correspondence:
Svitich Oksana A.
PhD, MD, Chief, Laboratory of Molecular Immunology, I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Serology 105064, Russian Federation, Moscow, Maly Kazenny Lane, 5а. Phone: 7 (926) 148-83-22. E-mail: [email protected]
Received 18.02.2014 Revision received 27.03.2014 Accepted 14.04.2014
