ИЗУЧЕНИЕ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ВАКЦИННОГО ВИРУСА ЧУМЫ МЕЛКИХ ЖВАЧНЫХ ШТАММА ВНИИЗЖ Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

УДК 619:616.98:578.823.1 Е.В. Капускин

ИЗУЧЕНИЕ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ВАКЦИННОГО ВИРУСА ЧУМЫ МЕЛКИХ ЖВАЧНЫХ ШТАММА «ВНИИЗЖ»

Введение

Для получения вакцинных и диагностических препаратов большое значение имеет вируссодержащее сырье с высокой биологической активностью.

Известно, что вирус чумы мелких жвачных (ЧМЖ) репродуцируется в различных клеточных системах, в том числе в первично трипсинизированных (почка ягненка, тестикул ягненка, почка козленка, тести-кул козленка, эмбриональные клетки почки мелких жвачных, клетки кожи эмбриона овцы, клетки почек обезьян) и в перевиваемых (почка теленка (MDBK), почка сайгака (ПС), почка овцы (ПО), почка эмбриона свиньи (СПЭВ), почка свиньи (IB-RS-2), почка сирийского хомячка (BHK-21), почка африканской зеленой мартышки (VERO) и др.) [1, 2, 3, 4, 5].

В результате проведенных ранее исследований впервые нами показана высокая чувствительность к вирусу ЧМЖ штамма «ВНИИЗЖ» перевиваемой культуры клеток гонады козы (Ch-91). Для получения вируссодержащего сырья с высокой биологической активностью необходимы не только наиболее чувствительная культура клеток, но и оптимальные условия культивирования.

Учитывая вышеизложенное, целью нашей работы являлась оптимизация условий культивирования вакцинного вируса ЧМЖ штамма «ВНИИЗЖ».

Материалы и методы

Для культивирования в стационарных условиях лиофилизированный, аттенуиро-ванный на перевиваемой культуре клеток Ch-91, штамм «ВНИИЗЖ» вируса ЧМЖ разводили поддерживающей средой Игла до первоначального объема (1 см3). В работе использовали вирус с активностью 5,0 lg ТЦД50/см3 и выше. Разведенную вируссодержащую суспензию вносили на предварительно отмытый от ростовой среды раствором Хенкса 2-3-суточный монослой культуры клеток Ch-91, выращенный в 1,5 дм3 клинских матрасах и экспонировали в течение часа при 37±0,5° С, после чего вирус удаляли, монослой однократно отмывали и в матрасы с культурой клеток вносили по 200 см3 поддерживающей среды. В

дальнейшем инфицируемую культуру клеток просматривали под микроскопом перед сменой среды и ежедневно для оценки цитопатического действия (ЦПД) вируса. Смену среды проводили через каждые 2 суток. Инфицированную культуру инкубировали при 37° С, и при поражении площади монослоя не менее 70-80%, клетки 3-кратно промораживали, производили сбор вируса с последующим отбором проб для исключения микробной контаминации и определения инфекционной активности вируса титрованием в культуре клеток ^-91. Полученный материал снова замораживали и хранили при температуре минус 40° С до получения результатов контроля.

Результаты и обсуждение

Изучали накопление вируса ЧМЖ штамма «ВНИИЗЖ» в культуре клеток ^-91 в зависимости от величины инфицирующей дозы, состава поддерживающей среды и других факторов.

Накопление вируса ЧМЖ в культуре клеток С^91 при разной множественности инфицирования. С этой целью мо-нослойную культуру клеток С^91, выращенную в 50 см3 флаконах, инфицировали вирусом ЧМЖ в дозах 1,0; 0,1; 0,01 и 0,001 ТЦД50/кл и инкубировали при 37° С со сменой среды через 2-3 суток. Через каждые сутки после инфицирования из групп брали по 3 флакона на протяжении 15 суток и промораживали при минус 20° С. После оттаивания определяли активность вируссо-держащих суспензий методом титрования в культуре клеток С^91. Динамика накопления вируса ЧМЖ в зависимости от дозы заражения представлена на рис.

Данные рис. показывают, что при дозе инфицирования 0,1 ТЦД50/кл на 7-8 сутки активность вируса в суспензии достигала 6,0-6,25 ^ ТЦД50/см3 с наличием ЦПД на 7090% поверхности монослоя. При множественности заражения 1,0 ТЦД50/кл накопление вируса шло быстрее, но активность при этом не превышала 5,25 ^ ТЦД50/см3, а при множественности заражения 0,01-0,001 ТЦД50/кл титр вируса достигал 5,50-5,75 ^ ТЦД50/см3, однако при этом увеличивалось время культивирования до 9-11 суток.

Накопление вируса в зависимости от

Рис. 1. Накопление вируса ЧМЖ штамма «ВНИИЗЖ» в культуре клеток ^-91 при различной множественности заражения

Таблица 1

Накопление вируса в зависимости от вида питательной среды

7

С")

е

В

1 2 3 4 5 6 7 8 Э 10 11 12 13 14 15

Время культивирования, сутки

-ГоТЦД50~йсл — 0,1 ТЦД50/кл

---0,01ТЦД50Л<л --0,001 Т|ДД50/кл

Среда для культивирования Выраженность ЦПД Уровень накопления вируса, ^ ТЦД^см3

ПСС +++ 5.69±0,08

ПСП ++++ 5,17±0,13

Игла +++ 5,82±0,17

Дрожжевой раствор Хенкса ++++ 5,04±0,10

Игла + ПСП +++ 5,45±0,09

№199 ++ 4,33±0,19

множественность заражения 0,01 ТЦД50/кл

вида питательной среды. Для определения влияния различных поддерживающих сред на репродукцию вируса в опытах были использованы следующие среды: ПСС, ПСП, Игла (по прописи ФГУ «ВНИИЗЖ»), раствор Хенкса с дрожжевым экстрактом, Игла + ПСП в соотношении 1:1 и №199. В каждую среду добавляли 2% фе-тальной сыворотки и инкубировали в течение 8 суток. Активность вируса определяли методом титрования в культуре клеток ^-91. Результаты опыта представлены в табл. 1.

Как видно из табл. 1, наиболее активное накопление вируса отмечалось при использовании питательной среды Игла, где титр составлял 5,82±0,17 ^ ТЦД50/см3 и ПСС-5,69±0,08 ^ ТЦД50/см3, а при использовании питательной среды ПСП и раствора Хенк-са с дрожжевым экстрактом отмечено наиболее выраженное ЦПД. Из вышеизложенного следует, что для получения вирусной суспензии с наибольшей биологической активностью целесообразно использовать питательную среду Игла или ПСС.

Зависимость репродукции вируса

ЧМЖ от вида сывороток в поддерживающей среде. Изучение накопления вируса ЧМЖ проводили с использованием различных видов сывороток крови: инактивиро-ванной фетальной (FS ин.) и не инактиви-рованной фетальной (FS), инактивирован-ной КРС ^КРС ин.) и не инактивирован-ной КРС ^КРС), инактивированной ягненка ^ягненка ин), инактивированной лошади ^лошади ин.). Контролем служила среда без добавления сыворотки. Результаты исследований представлены в табл. 2.

Как видно из табл. 2, наибольшее накопление вируса отмечалось при использовании 2% инактивированной феталь-ной сыворотки и среды Игла, а также дозы заражения 0,1 ТЦД50/кл., где титр составил 6,39±0,25 ^ ТЦД50/см3. Достаточно высокие титры вируса были и при использовании инактивированной фетальной сыворотки, среды ПСС и дозы заражения 0,1; 0,01 ТЦД50/кл, а также при использовании питательной среды Игла и дозы заражения 0,01; 0,001 ТЦД50/кл, когда титр составлял от 5,75 до 6,00 ^ ТЦД50/см3. Внесение среды Игла с добавлением инактивиро-

Таблица 3

Влияние способа заражения культуры клеток на репродукцию вируса ЧМЖ

Таблица 2

Зависимость репродукции вируса от вида сыворотки в поддерживающей среде

Доза заражения (ТЦД50/Кл.) Титр вируса (^ ТЦД^см3)

Среда с добавлением 2% сыворот ки крови Среда без добавления сыворотки

FS ин. FS SКРС ин. SКРС Sягнен-ка ин. Sлоша-ди ин.

Среда Игла

0,1 6,39±0,25 4,45±0,23 5,75±0,14 3,0±0,08 4,75±0,16 4,65±0,23 3,75±0,11

0,01 6,0±0,11 4,27±0,22 5,55±0,25 3,25±0,28 5,0±0,15 4,35±0,61 3,07±0,17

0,001 5,75±0,13 4,19±0,18 5,47±0,23 3,13±0,34 5,0±0,25 4,0±0,21 2,51±0,09

Среда ПСС

0,1 6,0±0,31 3,75±0,13 5,03±0,24 2,85±0,27 4,5±0,31 4,0±0,25 2,73±0,05

0,01 5,9±0,29 4,71±0,28 4,61±0,11 3,45±0,43 5,0±0,14 4,55±0,20 2,7±0,24

0,001 5,4±0,12 3,69±0,35 4,53±0,16 3,14±0,50 4,5±0,26 4,21±0,26 3,01±0,18

Способ заражения Посевная концентрация клеток (тыс./см3) Количество пассажей вируса Время культивирования (сутки) Титр вируса ТЦД^см3)

1 9 4,50±0,23

На монослой клеток 2 9 5,21±0,17

350-400 3 7 5,25±0,25

4 6 5,45±0,14

5 5 6,21±0,27

1 7 4,75±0,21

В суспензию клеток 2 6 5,24±0,17

350-400 3 6 5,69±0,11

4 6 5,73±0,55

5 5 6,45±0,15

ванной сыворотки КРС и множественностью заражения 0,1 ТЦД50/кл вызывало накопление вируса в титре 5,75±0,14 ^ ТЦД50/ см3. Более низкий показатель накопления вируса отмечался при использовании сред без добавления сыворотки, а также не ина-ктивированной сыворотки КРС. Установлено, что при использовании всех не инак-тивированных сывороток титр вируса был ниже на 1,0-2,0 ^ ТЦД50/см3.

Из вышеизложенного следует, что для получения вирусной суспензии с высокой биологической активностью возможно использование инактивированной фе-тальной сыворотки, а при наработке вируса для изготовления вакцин экономически целесообразно использовать в составе поддерживающих сред инактивированную сыворотку КРС.

Влияние способа заражения на репродукцию вируса ЧМЖ. Для оптимизации условий культивирования вируса изучали различные способы заражения культуры клеток. Для этого вносили вирус ЧМЖ в дозе 0,01 ТЦД50/кл на полностью сформи-

рованный монослой перевиваемой культуры клеток ^-91 и в суспензию клеток. Накопление вируса выражали в ^ ТЦД50/ см3. Данные этих исследований представлены в табл. 3.

Из табл. 3 следует, что при внесении вируса в суспензию клеток титр был в среднем на 0,25 ^ ТЦД50/см3 выше, чем при заражении на полностью сформированный монослой. При увеличении количества пассажей титр вируса повышался на 1,52,0 ^ ТЦД5с/см3.

Выводы

Заражение монослоя перевиваемой культуры клеток ^-91 в дозе 0,1 ТЦД50/кл вызывало накопление вируса ЧМЖ в титре 6,00-6,25 ^ ТЦД50/см3.

При получении расплодки вируса оптимальной средой является среда Игла с добавлением 2% инактивированной феталь-ной сыворотки.

Полученные результаты показывали, что заражение суспензии клеток CH-91 вирусом ЧМЖ обусловливало его более высокое накопление.

РЕЗЮМЕ

В работе представлены данные по изучению репродукции вакцинного вируса чумы мелких жвачных штамма «ВНИИЗЖ» в перевиваемой культуре клеток гонады козы в зависимости от величины инфицирующей дозы, состава поддерживающей среды и способа заражения. SUMMARY

Data on studying the reproduction of «ARRIAH» strain of peste des petits ruminants vaccine virus in caprine gonad cell culture (Ch-91) depending on the amount of an infectious dose, maintenance medium composition and route of infection are demonstrated in the paper.

Литература

1. Изучение культуральных свойств вакцинного штамма 45G37/35-К вируса чумы мелких жвачных / И.П. Михалкин, Т.Ф. Горшкова, Л.И. Аниси-мова [и др.] // Науч. основы произв-ва вет. биол. препаратов. Щелково, 2005. С. 163-166.

2. Изучение чувствительности различных клеточных культур к вирусу чумы мелких жвачных животных / В.И. Диев, Л.Н. Соколов, Р.В. Мамкова [и др.] // Вирусные болезни с.-х. ж-ных: тез. докл. науч.-практ. конф. Владимир, 1995.- С. 94.

3. Михалкин, И.П. Чума мелких жвачных / И.П.

Михалкин //Сибирская язва и другие опасные инфекционные болезни животных. Покров, 2005. С. 159-163.

4. Attenuation une souche de virus de la peste des petits ruminants: candidat peour un vaccin homologue vivant / A. Diallo, WP. Taylor, P.C. Zefevre, A. Provost // Revue Elev. Med. Vet. Pays Trop. 1989. Vol.42, №3. Р. 311-319.

5. Lefevre, P.-C. Peste des petits ruminants / P.-C. Lefevre, A. Diallo // Rev. sci. tech. Off. Epiz. 1990.-Vol. 9, №4. P. 951-965.

УДК 619:616.98:578.823.91:636.22/.28:573.6.086.83:57.083.3 Г.С. Скитович, О.П. Бьядовская, Л.Б. Прохватилова

РАЗРАБОТКА НЕПРЯМОГО ВАРИАНТА ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К РОТАВИРУСУ В СЫВОРОТКАХ КРОВИ КРС МЕТОДОМ ОДНОГО РАЗВЕДЕНИЯ

Введение

Ротавирусы являются наиболее распространенным этиологическим агентом острых гастроэнтеритов КРС. Ущерб, причиняемый ротавирусами, слагается из отставания в росте и гибели молодняка, особенно ощутим в животноводческих хозяйствах промышленного типа. Результаты проведенных за последние годы исследований свидетельствуют о широком распространении данной инфекции в хозяйствах РФ [1, 2, 3].

Важным условием успешной борьбы с инфекцией является своевременная диагностика заболевания, для чего используются различные диагностические методы, в том числе иммуноферментный анализ (ИФА), главным достоинством которого является высокая чувствительность. Лабораторная диагностика ротавирус-ной инфекции КРС, кроме выявления антигена, предусматривает также выявление антител.

Целью нашей работы была разработка непрямого варианта иммуноферментного анализа для выявления антител к ротави-

русу в сыворотках крови КРС при исследовании их в одном разведении.

Материалы и методы

В качестве антигена в работе использовали очищенный, концентрированный ро-тавирус КРС штамм ТЕ-87-ДЕП, полученный в культуре клеток МДВК.

Использовали сыворотки крови КРС из различных хозяйств России (290 образцов), а также контрольные положительные и отрицательные сыворотки, полученные от экспериментально инфицированных животных.

Для выявления специфического комплекса использовали коммерческий препарат антител против ^О (H+L) быка, меченных пероксидазой (Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, г. Москва).

Антиген разводили в 0,1М карбонат-но-бикарбонатном буферном растворе, рН 9,5-9,6. Для заполнения сайтов неспецифического связывания на твердофазном сорбенте применяли раствор 0,05 М трис-НС1 с 0,2 М ЫаС1, 0,01% твин-20, 10% лошадиной сыворотки. Разведение сыворо-