CC BY
91
УДК 615.322
ИЗУЧЕНИЕ КАЧЕСТВЕННОГО СОСТАВА И СОДЕРЖАНИЯ ЭКДИСТЕРОИДОВ ДИКОРАСТУЩЕЙ В МОНГОЛИИ И ИНТРОДУЦИРОВАННОЙ В ЗАПАДНУЮ СИБИРЬ SILENE REPENS
© Н. Мунхжаргал1, Л.Н. Зибарева1, Р. Лафон2, Л.Н. Прибыткова3, С.И. Писарева4
1 Томский государственный университет, пр. Ленина, 36, Томск, 634050 (Россия) E-mail: zibareval@inbox.ru
2Парижский университет Пьера и Марии Кюри, Париж (Франция)
3Сибирский государственный медицинский университет, Московский тракт,
2/7, Томск, 634050 (Россия)
4Институт химии нефти СО РАН, пр. Академический, 3, Томск, 634021 (Россия)
Методом ВЭЖХ установлен экдистероидный профиль: в надземной части синтезируются 2-дезоксиэкдизон, 2-дезокси-20-гидроксиэкдизон, полиподин В, 20-гидроксиэкдизон, интегристерон А. изучен состав БАВ - подтверждено присутствие тритерпеновых гликозидов, алкалоидов, флавоноидов и впервые обнаружены дубильные вещества. Показано влияние экологических условий - высоты над уровнем моря, влажности на состав экдистероидов и уровни БАВ.
Ключевые слова: смолевка, фитоэкдистероиды.
Введение
Экдистероиды - полиоксистероиды, являющиеся аналогами гормонов линьки и метаморфоза насекомых, широко распространены в растительном мире, и в настоящее время установлены структуры более 400 соединений. Отсутствие токсического действия у экдистероидов при очень сильно выраженной фармакологической активности послужило толчком для поиска растений, продуцирующих эти вещества, в разных экологогеографических регионах России и зарубежных странах.
Весьма актуален не только поиск новых источников экдистероидов растительного происхождения, являющихся перспективными для получения лекарственных веществ разнообразного физиологического действия, но и нахождение благоприятных условий для биосинтеза, способствующих повышению уровня этих соединений.
Однако до настоящего времени не известны их физиологические функции в растениях. изучение экди-стероидсодержащих растений в различных аспектах способствует опосредованному выявлению их роли в развитии растений. Одним из таких направлений является исследование особенностей поведения, химических изменений, происходящих в растениях при введении их в культуру в несвойственных для них условиях произрастания.
В литературе имеются сведения, что концентрации и качественный состав экдистероидов подвержены весьма существенным колебаниям в зависимости от места и времени сбора растений. Так Silene brachuica, произрастающая в Киргизии, содержит 20-гидроксиэкдизон (20Е), полиподин В, интегристерон А, витико-стерон Е, силенеозиды А, В, С, Д, 22 сульфат a-экдизон, а образец этого же вида из Узбекистана - 20Е, по-липодин В, интегристерон А, витикостерон Е, силенеозиды А, В, С, Е, 2-дезоксипроизводные экдизона и 20Е, 20,22-моноацетонид, 2-дезоксиэкдизон-22-ацетат [1]. Вариабильность химического профиля экдисте-роидов наблюдалась и в образцах Serratula coronata L. разного происхождения: растения, собранные в Уз-
* Автор, с которым следует вести переписку.
бекистане, содержали 20Е, витикостерон Е, экдизон [2,3], выращенные в Республике Коми, - 20Е, экдизон, 258-инокостерон, макистерон А, макистерон С, аюгастерон С, дакрихайнаньстерон [4], в то время как в дикорастущих в Башкирии растениях обнаружены 20Е, полиподин В, аюгостерон С, 22-О-ацетил-20Е, 22дезокси-20Е, коронатостерон [5].
Удачными объектами исследования в этом плане являются виды многочисленного рода Silene, ареал которых - от Атлантического до Тихого океана. Показано, что образцы семян одного и того же вида Silene, полученные из разных мест произрастания, содержат различное количество экдистероидов либо они вообще отсутствуют, а также что их уровень возрастает при введении в культуру в несвойственных условиях [6].
Цель исследования - изучить качественный состав и содержание экдистероидов Silene repens в зависимости от условий произрастания.
Вследствие того, что Silene repens характеризуется разнообразным применением в народной медицине [7-9], широким распространением в Сибири и Монголии, но малой степенью изученности химического состава, представляет интерес исследовать БАВ и влияние экологических условий на их биосинтез. Известно, что растения смолевки ползучей синтезируют тритерпеновые сапонины [10], флавоноиды [11, 12], следы алкалоидов [13]. Присутствие фитоэкдистероидов в смолевке ползучей впервые установлено Ревиной и соавторами [14]. Позже показано, что помимо 20-гидроксиэкдизона это растение синтезирует и другой экди-стероид - полиподин В [6]. В работе [15] изучено распределение 20-гидроксиэкдизона в органах растений в фазу цветения и интегристерона А.
Экспериментальная часть
Silene repens Patr - смолевка ползучая, многолетнее корневищное растение сем. Caryophyllaceae [7]. Растения собраны автором в Западной и Центральной Монголии в течение 2006-2008 гг., часть образцов предоставлена сотрудниками Ховдского университета Монголии и кафедры ботаники Томского государственного университета. Все образцы собраны в фазу цветения на высоте 1215-2350 м над у.м. Образцы определены А.И. Пяком. Гер-барные образцы хранятся в коллекции Сибирского ботанического сада ТГУ.
Количественное определение экдистероидов в образцах осуществляли спектрофотометрическим методом [16, 17]. Оптическую плотность элюата измеряли на спектрофотометре UV-1800 («Shimadzu», Япония) в кюветах с толщиной слоя 1 см на фоне элюата холостого опыта. Максимум поглощения, обусловленный наличием в молекуле экдистероидов а,Р-ненасыщенной кетогруппировки, фиксировали при 242-244 нм.
Определение экстрактивных веществ, влаги, дубильных веществ, флавоноидов и алкалоидов проводили по общеизвестным методикам [18]. Антиоксидантную активность (АО) анализируемых образцов оценивали с помощью модельной реакции инициированного окисления кумола. В качестве инициатора использовали азо-бис-изобутиронитрил. Измерение АО производили по скорости поглощения кислорода на автоматизированной газометрической установке при помощи пузырькового расходомера [18].
Выделение экдистероидов. Растительное сырье Silene repens Patr (500 г) экстрагировали пятикратно 70% этанолом. Экстрагент отгоняли под вакуумом с помощью ротационного испарителя. Концентрированный экстракт разбавили водой (2 : 1). Фильтрат очищали от липофильных веществ н-гексаном, хлороформом. Методом ТСХ в гексановой и хлороформной фракциях искомые соединения не обнаружены. Сумму экдистероидов из очищенного фильтрата извлекали н-бутиловым спиртом. Бутанольную фракцию сконцентрировали до смолообразного состояния. Эту сумму соединений подвергли многократному разделению на колонках с силикагелем марок КСК (Россия) с размером частиц 0,1-0,16 мм.
В процессе хроматографирования в качестве элюентов использовали следующие системы растворителей: хлороформ-этанол в различных соотношениях: 1) 15 : 1, 2) 10 : 1, 3) 7 : 1, 4) 4 : 1, 5) 3 : 1, 6) 2 : 1, 7) 1 : 1. Элюаты собирали примерно по 30 мл. Получен ряд фракций, которые в дальнейшем рехроматографировали с целью выделения индивидуальных веществ. Отгонку растворителей проводили с помощью ротационного испарителя при температуре 60 °С. Контроль за разделением веществ осуществляли с помощью ТСХ на пластинках «Silufol UV 254» и «Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ» в системах растворителей в различных соотношениях хлороформ-этанол: 1) 7 : 1, 2) 4 : 1, 3) 3 : 1, 4) 2 : 1. В качестве реактива обнаружения использовали 3% раствор ванилина в этиловом спирте с добавлением концентрированной кислоты серной.
Препаративное разделение и идентификацию выделенных сумм экдистероидов осуществляли с помощью нормально- и обращенно-фазовой ВЭЖХ на аналитических и препаративных колонках: (150 мм х 4,6 мм), 5 цм (250 мм х 9,4 мм, 5 цм) Zorbax Sil и АСЕ 5 CJ8 HL 5 цм. Хроматограф «Termo Seperation
Products» с UV-детектором «Spectra Serias UV-100». Системы растворителей: циклогексан - пропанол-2 -вода 100 : 30 : 1,5 (система 1); дихлорметан - пропанол-2 - вода 125 : 30 : 1,5 (система 2).
Обсуждение результатов
Флора Монголии впервые исследована на присутствие экдистероидов. Изучение флоры Монголии и Сибири методом химического скрининга позволило выявить наличие экдистероидов в 17 из 298 проанализированных видов, в том числе в 7 новых продуцентах - Silene ichebogda, Silene mongolica, Silene aprica, Silene turgida, Serratula marginata, Chenopodium frutescens, Axyris prostrata.
Наибольшее число продуцентов экдистероидов выявлено в семействе Caryophyllaceae - из 25 искомые соединения обнаружены в 10 видах, впервые - в 4 видах рода Silene (табл. 1).
Данные таблицы 1 свидетельствуют о том, что наибольший уровень 20Е оказался у таких видов, как Silene repens, Silene jenissensis, произрастающих на территории Монголии, причем он выше, чем в одноименных алтайских образцах [14], тогда как в других видах наблюдалось одинаковое содержание 20Е либо ниже.
Дополнительная очистка суммы выделенных соединений от сопутствующих веществ фенольного комплекса путем растворения в системе растворителей хлороформ - этанол в соотношении 4 : 1 позволила отделить коричневый осадок. ТСХ-анализ показал, что он состоит преимущественно из полярных флавоноидов. Выход фракции, обогащенной экдистероидами, составил 8,4% от массы воздушно-сухого сырья.
Детальное изучение химического состава разделенных методом колоночной хроматографии обогащенных фи-тоэкдистероидами фракций Silene repens проводили при последующей идентификации методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в Парижском университете совместно с профессором Р. Лафоном.
Из данных ВЭЖХ (рис. 1) следует, что Silene repens синтезирует характерные для видов этого рода экди-стероиды: 2-дезоксиэкдизон (2dE), 2-дезокси-20-гидроксиэкдизон (2d20E), полиподин В (PolB), 20-гидроксиэкдизон (20E), интегристерон А (IntA).
Структуры выделенных из образца, собранного на Богд Хан Уул (Монголия), мажорных экдистероидов представлены на рисунке 2.
20-Гидроксиэкдизон и полиподин В являются близкими по структуре экдистероидами и как следствие -трудно разделимыми хроматографически, последний отличается присутствием дополнительной ОН-группы в 50-положении. Наиболее удачное разделение достигнуто в системе дихлорметан - пропанол-2 - вода 125 : 30 : 1,5. Их УФ-спектры приведены на рисунке 3, максимумы поглощения а,Р-ненасыщенной кето-группировки наблюдаются в области 242-244 нм.
Изучение содержания и состава экдистероидов в связи с высотным распределением растений является актуальной проблемой, поскольку ранее такого рода исследования не проводились. В связи с этим мы изучали особенности накопления экдистероидов в одном перспективнрм по содержанию и составу экдистероидов виде Silene repens вдоль высотного градиента в условиях Монголии.
Таблица 1. Результаты скрининга видов семейства Caryophyllaceae флоры Монголии и Русского Алтая на
содержание экдистероидов
№ Виды Содержание 20Е, % от массы а.с.с. Литература
1 2 3
1 Melandrium apetala (L) Fenzl. 0,1 0,2 [19]
2 Melandrium brachypetala (Hormen) Tolm. et Kozhanczikov - 0,9 [19]
3 Silene aprica Turel* 0,1 - -
4 Silene chamarensis Turcz. 0,1 - 0,4 [14]
0,3 [6]
5 Silene graminifolia Otth. 0,1 0,7 0,6 [14]
б Silene ichebogda Glub*. 0,1 - -
7 Silene jenissensis Willd. 2,2 0,3 1,3 [14]
8 Silene mongolica Maxim*. 0,2 - -
9 Silene repens Patr. 1,1 0,3 0,5 [14]
10 Silene turgida L*. - 0,05 -
11 Silene viscosa (L.) Pers. - 0,3 + [20]
Примечания: 1 - во флоре Монголии, 2 - во флоре Сибири, 3 - литературные данные; «-» - отсутствие данных; * - новые источники фитоэкдистероидов.
система І
Рис. 1. Нф-ВЭЖХ бутанольного экстракта Silene repens
система 2
1. R1 =R2= R3 = R4= H
2. R1=R2 = R3= H; R4= OH
3. R1= R3 = H; R2= R4=OH
4. R1=H; R2= R3= R4= OH
5. R3= H; R1= R2 = R4= OH
Рис. 2. Структуры экдистероидов, выделенных из Silene repens: 1 - 2-дезоксиэкдизон, 2 - 2-дезокси-20-гидроксиэкдизон, 3 - 20-гидроксиэкдизон, 4 - полиподин В, 5 - интегристерон А
Рис. 3. УФ-спектры экдистероидов - полиподина В, 20-гидроксиэкдизона, выделенных из Silene repens
Таблица 2. Выход фитоэкдистероидов, изолированных
из Silene repens
Сравнение состава экдистероидов образцов Silene repens Patr. из разных мест произрастания (табл. 3) показало присутствие во всех образцах 20-гидроксиэкдизона (20Е), 2-дезоксиэкдизона (2дЕ), полиподина В (Пв), интегристерона А (Инт А). В образцах, собранных на Богд Хан Уул, Улаандав, помимо указанных соединений синтезируется 2-дезокси-20-гидроксиэкдизон
(2д20Е).
Сравнительный анализ содержания биологически активных веществ в образцах монгольского происхождения Silene repens свидетельствует о повышении содержания дубильных веществ, алкалоидов, экдистерои-дов с увеличением высоты над уровнем моря.
№ Экдистероиды Брутто- формула Выход, %
1 2-дезоксиэкдизон С27Н 44О5 0,0017
2 2-Дезокси-20Е С27Н 44О6 0,0002
3 Полиподин В С27Н 44О8 0,007
4 20-Гидроксиэкдизон С27Н 44О7 0,078
5 Интегристерон А С27Н 44О8 0,004
Таблица 3. Содержание биологически активных веществ в БИвпв гврвт в зависимости от условий произрастания
№ Место сбора Высота над Экстрактивные Содержание БАВ, %
образца уровнем моря, м вещества, % 20Е Другие экдистероиды Танины Алкалоиды
1 Хребет Хантайшира 2348 23,55 0,8 2дЕ, Пв, Инт А 2,56 1,3
2 Их Улан даваа 2326 19,48 0,2 2дЕ, Пв, Инт А 2,08 0,4
3 (на берегу реки ) Гора Богд 2256 28,57 1,1 2дЕ, 2д20Е, Пв, Инт А 2,10 1,5
4 Хужирта (на берегу реки) 2267 20,93 0,4 2дЕ, Пв, Инт А 2,08 0,5
5 Салхит, Ховд 1360 24,38 0,4 2дЕ, Пв, Инт А 0,93 0,3
6 Харганат (на берегу реки) 1215 21,76 0,4 2дЕ, Пв, Инт А 0,70 0,5
По всей вероятности, влияние оказывает не только высота над уровнем моря, но и влажность местности. Низкое содержание 20Е в 2-м и 4-м алтайском (0,3%) и томском (0,2%) образцах является, видимо, следствием климатических условий, характеризующихся повышенной влажностью. Самое высокое содержание 20Е (1,1%) наблюдали в образцах БПвпв гврвт, собранных в фазе цветения в горах Монголии на высоте 2256-2348 м над у.м.
Сравнение содержания экдистероидов в образцах БПвпв гврвт в процессе развития растений из экологогеографически удаленных мест - монгольском и образце, культивируемом в Западной Сибири (рис. 4, 5), свидетельствует о том, что фазой максимального накопления экдистероидов для всех органов надземной части БПвпв гврвт' является цветение. Однако для корней отмечается, напротив, наименьший уровень в этот период развития, что свойственно многолетним видам. Максимальное содержание наблюдается в репродуктивных органах: в бутонах - 1,0%, цветках - 1,1%.
Данные сравнительного анализа динамики содержания 20-гидроксиэкдизона в образцах различного происхождения (рис. 5), интродуцируемых в Западную Сибирь, свидетельствуют об идентичности характера изменений в течение вегетации - максимальный уровень экдистероидов достигается в фазе цветения.
Однако для интродуцента БПвпв гврвт монгольского происхождения почвенно-климатические условия и высотный уровень на экспериментальном участке Сибирского ботанического сада ТГУ являются нетипичными. Следует отметить, что в надземной части интродуцента алтайского происхождения из более сходного по климатическим условиям региона уровень 20Е выше, чем у образца, семена которого были собраны в Монголии (на берегу р. Харганат, 1215 м над у.м.) и посеяны в Западной Сибири. При этом надземная часть дикорастущего образца в Монголии в фазе цветения содержала в 4 раза больше 20-гидроксиэкдизона. По всей вероятности, на содержание экдистероида оказывает влияние как высота над уровнем моря, так и влажность воздуха. При этом характер изменения сохраняется в течение вегетационного периода. Возможно, этим объясняется столь низкое содержание экдистероидов в надземной части - 0,2% по сравнению с
0,4% у дикорастущего в горах Монголии образца.
Установлено, что этанольные экстракты БПвпв гврвт' в различной степени обладают антиоксидантной активностью, составляющей от 0,010 до 0,203 моль/кг. Проведенные исследования показали, что этанольные экстракты надземной части смолевки ползучей не токсичны.
Рис. 4. Динамика содержания 20-гидрокси-экдизона в различных органах БПвпв гврвт' алтайского происхождения, выращиваемого в Сибирском ботаническом саду (% от массы сухого сырья)
ч
О
О
В Стебель
I Листья
Фаза развития
□ Корень □ Цветки и Бутоны □ Плоды
0,35 -| 0,3' 0,25 -
г
i 0,2-р 0,15С 0,1 -
0,05-
0-
ЕЕэгетация Бутонизация
Цветение ГЛюдоношэние
Фазы развития
- Алтайский и Монгольский
Рис. 5. Динамика содержания 20-гидроксиэкдизона в БПвпв гврвп' алтайского и монгольского происхождения, выращиваемых в Сибирском ботаническом саду
Выводы
Таким образом, с использованием метода ВЭЖХ установлено, что смолевка ползучая синтезирует мажорные экдистероиды, характерные для рода Silene: 2-дезоксиэкдизон, 2-дезокси-20-гидроксиэкдизон, по-липодин В, 20-гидроксиэкдизон, интегристерон А.
На аккумулирование и состав экдистероидов влияют высота над уровнем моря и влажность - более благоприятны экстремальные горные условия, характеризующиеся засушливостью.
Список литературы
1. Саатов 3. Экдистероиды растений сем. Caryophyllaceae, Labiatae, Compositae: автореф. дис. ... д-ра хим. наук. Ташкент, 1993. С. 36.
2. Новосельская И.Л. Фитоэкдизоны растений рода Serratula: автореф. дис. ... канд. хим. наук. Ташкент, 1977. 23 с.
3. Новосельская И. Л., Горовиц М.Б., Абубакиров Н.К. Витикостерон Е, экдистерон, а-экдизон. Фитоэкдистерои-ды Serratula coronata L. // Химия природных соединений. 1981. №5. С. 668-669.
4. Volodin V.V., Alexeeva L.I., Kolegova N.A, Sarker S.D., Sik V., Lafont R., Dinan L. Futher ecdysteroids from Serratula coronata. L (Asteraceae) // Biochemical systematics and ecology. 1998. V. 26. P. 456-461.
5. Galiautdinov I.V., Khalilov L.M., Nedopekin D.N., Fatykhov A.A., Odinoкov V.N. Traditional and new ecdysteroides from Serratula coronata L. // 14th Ecdyzone Workshop. Rapperswil, Switzerland, 2000. P. 58.
6. Зибарева Л.Н. Фитоэкдистероиды растений семейства Caryophyllaceae: дис. ... д-ра хим. наук. Новосибирск, 2003. 247 с.
7. Растительные ресурсы СССР. Цветковые растения, их химический состав, использование. Семейства Magnoliaceae - Limoniaceae. Л., 1985. 460 с.
8. Народная медицина. Смолевка ползучая [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://health-
news.ru/herbs/herbsil_re.html
9. Хайдав Ц. и др. Лекарственные растения в Монгольской медицине. Улан-Батор, 1985. С. 188.
10. Юхананов Д.Х., Сапунова Л.А. Наличие гипсозида у представителей сем. Саryophyllaceae // Растительные ресурсы. 1976. Т. 7. Вып. 2. С. 244-247.
11. Минаева В.Г., Киселева А.В., Волхонская Т.А. Некоторые результаты обследования Краснодарского края на содержание флаваноидов // Перспективные и полезные растения флоры Сибири. Новосибирск, 1973. С. 170-178.
12. Дармограй В.Н. Фармакогностическое изучение некоторых видов семейства гвоздичных и перспективы использования их в медицинской практике: дис. в виде доклада ... д-ра фарм. наук. Рязань, 1996. С. 64-65.
13. Баньковский А.И., Зарубина М.П., Сергеева Л.Л. Исследование растений, применяемых в народной медицине на содержание алкалоидов // Труды ВНИИ лекарственных ароматических растений. 1974. Т. 9 С. 119-179.
14. Ревина Т.А., Ревушкин А.С., Ракитин А.В. Экдистероидсодержащие виды во флоре Горного Алтая // Растительные ресурсы. 1988. Вып. 4. С. 565-569.
15. Володина С.О. Экдистероидсодержащие растения: Ресурсы и биотехнологическое использование: автореф. дис. . канд. биол. наук. Сыктывкар, 2006. 20 с.
16. Якубова М.Р., Генкина Г.Л., Шакиров Т.Т., Абубакиров Н.К. Хроматоспектрофотометрический метод определения экдистерона в растительном сырье // Химия природных соединений. 1978. №6. С. 737-740.
17. Патент №2082168 (Россия). Способ обнаружения и количественного определения экдистероидов в растительных объектах / Л.Н. Зибарева, В.И. Еремина, П.В. Зибарев // БИ. 1997. №17. С. 178-179.
18. Государственная фармакопея СССР. М., 1990.
19. Зибарева Л.Н., Ревина Т.А. Фитохимическое изучение некоторых представителей рода Melandrium сем. Гвоздичных // Молодые ученые и специалисты - народному хозяйству: Тез. докл. конф. Томск, 1986. С. 14.
20. Volodin V., Chadin I., Whiting P., Dinan L. Screening plants of European North-East Russia for ecdysteroids // Biochemical Systematics and Ecology. 2002. V. 30. P. 525-578.
Поступило в редакцию 29 июня 2009 г.
