CC BY
44
УДК 57.042, 57.043, 57.084, 574.2, 574.5
DOI: 10.24411/1728-323X-2018-14025
ИЗУЧЕНИЕ ИЗМЕНЕНИЙ РЕГЕНЕРАЦИОННОЙ СПОСОБНОСТИ ПЛАНАРИЙ йивЕ5!А Г!вЯ!ЫА ПОД ДЕЙСТВИЕМ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ
Н. Н. Павлова, кандидат биологических наук, доцент, Обнинский институт атомной энергетики — филиал Национального исследовательского ядерного университета «МИФИ», [email protected], Обнинск, Россия, Н. В. Амосова, кандидат биологических наук, доцент, Обнинский институт атомной энергетики — филиал Национального исследовательского ядерного университета «МИФИ», [email protected], Обнинск, Россия,
М. М. Рассказова, кандидат биологических наук, доцент, Обнинский институт атомной энергетики — филиал Национального исследовательского ядерного университета «МИФИ», [email protected], Обнинск, Россия
В представленном исследовании была проведена оценка регенера-ционной способности планарий Dugesia tigrina под действием ионизирующего излучения. На первом этапе работы была изучена радиочувствительность планарий по изменению площади образования бластемы при воздействии различных доз (0,01 Гр, 0,1 Гр; 1 Гр; 10 Гр) ионизирующего излучения в модельном эксперименте. На следующем этапе работы была проведена оценка выживаемости планарий Dugesia tigrina в пробах воды из тестируемых скважин хранилища радиоактивных отходов г. Обнинска Шурф-1, Шурф-2, Шурф-3, Шурф-4, Шурф-5, И-1 в опыте продолжительностью 72 часа. Далее оценивали изменение площади образования бластемы у планарий, находящихся в исследуемых пробах воды из контрольных скважин хранилища радиоактивных отходов в течение 3-х суток. Модельные эксперименты показали, что плана-рия является радиочувствительным тест-организмом, который можно использовать при биологической диагностике радиоактивных загрязнений. Результаты определения изменения площади образования бластемы у планарий, находящихся в воде из контрольных скважин хранилища радиоактивных отходов г. Обнинска, в течение трех суток показали, что способность планарий к регенерации уменьшается с увеличением активности 90Sr.
The assessment of the regenerative ability of planaria Dugesia tigrina under ionizing radiation has been conducted in the study. At the first stage of the work the radiosensitivity of planaria was investigated according to the modifications of the blastema area under the impact of different radioactive doses (0,01 Gy; 0,1 Gy; 1 Gy; 10 Gy) during the model experiment. At the following stage of the work the authors evaluated the planarium (Dugesia tigrina) survival rate in water samples taken from tested boreholes of a storage facility for radioactive waste in Obninsk (Shurf-1, Shurf-2, Shurf-3, Shurf-4, Shurf-5, I-1); the duration of the experiment was 72 hours. Further, the changes of the planarium blastema area, which were found in the experimental water samples from tested boreholes of the storage facility for radioactive waste, were assessed for a period of three days. The model experiments showed that the planaria is a radio sensitive test-organism, which can be used during biodiagnostics of radioactive contamination. The results of the experiment with changing of the planarium blastema area from control water samples taken from tested boreholes of a storage facility for radioactive waste (during three days) showed that the regenerative ability of planaria decreases with the increase of the activity of 90Sr.
Ключевые слова: ионизирующее излучение, биологический мониторинг, хранилище радиоактивных отходов, регенерационная способность планарий, радиоактивное загрязнение.
Keywords : ionizing radiation, biological monitoring, radioactive waste storage, regenerative ability of planaria, radioactive contamination.
Введение. В связи с интенсивным развитием атомной энергетики в настоящее время особую актуальность приобретают исследования, связанные с оценкой влияния предприятий ядерно-топливного цикла и хранилищ радиоактивных отходов (РАО) на объекты окружающей среды. В последнее время при оценке загрязнений объектов окружающей среды все чаще используют методы биологического м ониторинга как наиболее адекватного подхода к исследованию состояния экологических систем. Они дают объективную интегральную информацию о состоянии экосистем, основанную на реакции живых организмов на изменение среды обитания [1]. Представленная работа проводится в городе Обнинске, на территории которого уже более 60 лет действует ряд производств, связанных с обоснованием и разработкой объектов атомной энергетики. Градообразующее предприятие Акционерное общество Государственный научный центр Российской Федерации Физико-энергетический институт им. А. И. Лейпунского (АО «ГНЦ РФ — ФЭИ»). У данной организации на балансе находятся два пункта захоронения радиоактивных отходов (действующий и старый могильники). Действующий могильник расположен на территории промзоны АО «ГНЦ РФ — ФЭИ», старый — за ее пределами в районе городских очистных сооружений. Старое хранилище радиоактивных отходов (РАО) было законсервировано в 1967 г., а в 50—60-е годы в него активно свозились радиоактивные отходы со всех предприятий Москвы и Ленинграда [2].
Одним из наиболее опасных радионуклидов, входящих в состав РАО старого хранилища, является 90$г. В связи с этим целью представленной работы является проведение биологического мо-
ниторинга проб воды из контрольных скважин Шурф-1, Шурф-2, Шурф-3, Шурф-4, Шурф-5, И-1 хранилища радиоактивных отходов г. Обнинска. Для реализации указанной цели были поставлены следующие задачи:
1. Определение радиочувствительности пла-нарий по изменению площади образования бластемы при воздействии различных доз (0,01 Гр, 0,1 Гр; 1 Гр; 10 Гр) ионизирующего излучения в модельном эксперименте.
2. Оценка выживаемости планарий Бщв81а tigrina в пробах воды из тестируемых скважин Шурф-1, Шурф-2, Шурф-3, Шурф-4, Шурф-5, И-1 в опыте продолжительностью 72 часа;
3. Определение кислотности воды из исследуемых скважин;
4. Определение изменения площади образования бластемы у планарий, находящихся в исследуемых пробах воды из контрольных скважин хранилища РАО в течение 3-х суток.
Модели и методы. Во многих исследованиях по изучению влияния антропогенных факторов на живые организмы в качестве тест-объектов широко используются ресничные черви [3]. Пла-нарии — повсеместно распространенная группа животных, часто встречаемая в пресноводных водоемах. В данной работе в качестве тест-объекта использовалась планария Dugesia й^та. Следует отметить, что планарии — удобный объект для экологических исследований благодаря простоте культивирования, высокой способности к регенерации, чувствительности к малым дозам загрязнителей, возможности фиксировать четкий воспроизводимый отклик на воздействие внешних факторов, хорошей воспроизводимости результатов при проведении биологических экспериментов. Регенерация планарий происходит методом отрастания регенерационной почки (бластемы), которая формируется за счет пролиферации резервных клеток — необластов. Параллельно с пролиферацией идет дифференцировка этих клеток в нервные клетки нового ганглия. Следовательно, в ходе регенерации происходит рост бластемы за счет пролиферации клеток и ее морфогенез за счет их дифференцировки. Регистрация феномена отрастания новых частей тела у пла-нарий положена в основу метода прижизненной компьютерной морфометрии [4]. Важной особенностью планарий Dugesia tigrina является отсутствие зависимости темпа регенерации от сезона года. Возможность круглогодичного ведения лабораторной культуры, крупные размеры плана-рий, удобное анатомическое строение и высокая чувствительность к воздействию загрязняющих веществ делают Dugesia tigrina подходящим объ-
Рис. 1. Схема точек пробоотбора
ектом для исследований. Благодаря этим достоинствам, регенерация планарий успешно используется для тестирования фармакологических веществ, биологического действия электромагнитных факторов, исследования действия тяжелых металлов, а также влияния радионуклидов [4—6]. Планарии сравнительно легко культивируются, давая несколько генераций в год. Содержат их в небольших аквариумах в условиях комнатной температуры. Воду в аквариуме не следует менять часто. Рекомендуется доливать в аквариум отстоянную водопроводную воду до постоянного уровня. Кормят червей 1—2 раза в неделю, лучше всего личинками хирономид. После подкормки (в течение 2—3 часов) остатки пищи следует удалить. [4].
Как уже отмечалось выше, у АО «ГНЦ РФ — ФЭИ» на балансе находятся два пункта захоронения радиоактивных отходов (действующий и старый могильники). С целью контроля на территории старого хранилища РАО и за его пределами пробурено 12 наблюдательных скважин. Для биологического мониторинга были отобраны пробы воды из 6 скважин, активность 90$г в которых выше, чем в остальных скважинах (ШУРФ-1, ШУРФ-2, ШУРФ-3, ШУРФ-4, ШУРФ-5, И-1). Схема точек пробоотбора представлена на рис. 1.
Биотестирование с использованием тест-функции выживаемости планарий проводили по следующей методике. Пробу воды объемом 50 мл из каждой точки пробоотбора наливали в стаканчики емкостью 100 мл и помещали в растворы по 5 планарий. Контролем служили показатели выживаемости планарий, помещенных в дехлорированную отстоянную водопроводную воду. Все эксперименты проводились в трех повторностях [6]. Содержание 90$г в исследуемой воде из скважин определяли радиохимическим методом [7], кислотность воды — потенциометрическим методом.
Для исследования изменения площади образования бластемы у планарий в эксперименте ис-
пользовали планарии Dugesia tigrina, отобранные в равноценные экспериментальные группы по морфологическим параметрам тела. Основным и достаточным параметром при отборе животных является длина планарий. Оптимальным инструментом для проведения операций на планариях являются скальпели. Проверенным и эффективным естественным фактором торможения подвижности планарий является низкая температура. Поэтому животных помещают на кусочек пищевого льда и далее скальпелем проводят декапита-цию в течение 1—1,5 минут [8—10]. Для эксперимента отбирали по 5 планарий для каждой пробы и каждой повторности (т. е. 15 планарий на одну пробу из скважины). Декапитацию проводили под контролем микроскопа МБС-10 (бинокулярная лупа) с увеличением х2. После этого животных помещали в тестируемую воду на 3 суток для наблюдения за регенерационной активностью.
5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0
Контроль 0,01 Гр 0,1 Гр 1 Гр 10 Гр
D, Гр
Рис. 2. Измерение площади образования бластемы у планарий Dugesia tigrina
Рис. 3. Зависимость площади образования бластемы у планарий от дозы облучения
Через указанный временной интервал образуется регенерационная почка (бластема). Оценку реге-нерационной активности планарий проводили с помощью программы Scopephoto и системы Plana (рис. 2).
Оценки средних, дисперсий, стандартных отклонений и доверительных интервалов проводили стандартными методами математической статистики.
Вычисления проводили с использованием следующих статистических пакетов программ: SPSS (® SPSS Inc.), Microsoft Office Excel, Statistica 6.0.
Также использовался пакет программ Plana, который разработан А. А. Деевым (ИБК г. Пущи-но) специально для анализа изображений интак-тных и регенерирующих планарий, полученных по методу прижизненной компьютерной морфо-метрии.
В модельном эксперименте облучение планарий проводилось на базе МРНЦ им. А. Ф. Цыба на установках «Луч-1» и «Исследователь» с источником излучения — 60Со и мощностью экспозиционной дозы — 14,73 сГр/мин и 16,29 Гр/мин соответственно. Планарии были облучены в дозах 0,01 Гр, 0,1 Гр, 1 Гр и 10 Гр.
Результаты, представленные на рис. 3, показывают, что при увеличении дозы ионизирующего излучения происходит уменьшение площади образования бластемы у планарий.
Оценка зависимости изменения площади образования бластемы от дозы облучения и от кислотности проводилась с помощью корреляционного анализа (табл. 1). Кислотность воды, в которой проводилось облучение планарий в модельном эксперименте, была равна 7,1 ± 0,1.
Результаты, представленные в табл. 1, демонстрируют, что ионизирующее излучение достоверно снижает площадь образования бластемы у планарий.
4,50 4,00 3,50 3,00
2,50
2,00
1,50 1,00 0,50
0,00
Контроль Ш-2, Ш-5, Ш-4, Ш-3, И-1, Ш-1,
12,7 Бк/л 19,1 Бк/л 20,9 Бк/л 23,4 Бк/л 25,3 Бк/л 26,5 Бк/л
Рис. 4. Зависимость площади образования бластемы у планарий от активности в тестируемой воде из контрольных
скважин хранилища РАО
Далее проводили оценку выживаемости планарий в воде из контрольных скважин хранилища РАО г. Обнинска с активностью в диапазоне от 12,7 ± 1,3 до 26,5 ± 1,3 Бк/л. В ходе ис-
Таблица 1 Значение коэффициентов корреляции зависимости площади образования бластемы у планарий от дозы ионизирующего излучения и от кислотности
* в скобках указана значимость коэффициентов корреляции
Таблица 2
Активность 908г в воде из контрольных скважин
следований было выявлено, что активность 90$г в вышеуказанном диапазоне не влияет на выживаемость планарий в опыте продолжительностью 72 часа, выживаемость особей в эксперименте была 100 %.
Кислотность воды из контрольных скважин в районе старого хранилища радиоактивных отходов г. Обнинска варьирует от 6,8 ± 0,2 до 7,1 ± 0,2.
В табл. 2 представлены результаты измерения активности 90$г в воде из контрольных скважин хранилища РАО г. Обнинска.
Результаты измерений активности 90$г показали, что самая высокая активность данного радионуклида наблюдается в скважинах Шурф-1, Шурф-3, И-1.
На рис. 4 представлены результаты определения площади образования бластемы у планарий в зависимости от активности 90$г в тестируемой воде из контрольных скважин хранилища РАО г. Обнинска.
Из результатов, представленных на рис. 4, видно, что при увеличении активности 90$г происходит уменьшение площади образования бластемы у планарий.
Для оценки достоверности влияния активности стронция и кислотности на изменение регене-рационной способности планарий полученные данные обработаны с помощью корреляционного (табл. 3) и регрессионного (табл. 4) анализов. Статистическая обработка данных с помощью
№ пробы Шифр пробы Активность 908г, Бк/л
1 Шурф-1 (Ш-1) 26,5 ± 1,3
2 Шурф-2 (Ш-2) 12,7 ± 1,3
3 Шурф-3 (Ш-3) 23,4 ± 1,3
4 Шурф-4 (Ш-4) 20,9 ± 1,3
5 Шурф-5 (Ш-5) 19,1 ± 1,3
6 И-1 25,3 ± 1,3
Биологический показатель Ионизирующее излучение Кислотность
Площадь образования бластемы, 5 -0,754 (0,023)* 0,248 (0,015)
Таблица 3 Значение коэффициентов корреляции зависимости площади образования бластемы у планарий от активности стронция и кислотности
* в скобках указана значимость коэффициентов корреляции.
Таблица 4
Оценка зависимости изменений площади
образования бластемы у планарий от активности стронция и кислотности с помощью регрессионного анализа
корреляционного анализа показала зависимость изменения площади образования бластемы от активности стронция. Коэффициент корреляции имеет значение —0,772. Для более детального анализа полученных экспериментальных данных был применен регрессионный анализ.
При проведении статистической обработки с использованием регрессионного анализа использовали метод множественной пошаговой линейной регрессии. Исходными независимыми переменными являлись: кислотность и активность стронция. В качестве зависимой переменной рег-
рессионной модели была площадь образования бластемы у планарий:
yi = во + PAi + Р2Х2 + ••• + Р nXin + si, (!)
где уi — биологический показатель, Р — коэффициенты чувствительности биологического показателя на действие различных факторов (в нашей работе два фактора: кислотность и активность 90Sr), Ро — const, Xin — действующий на биологический показатель фактор, Zj — ошибка измерения i•
Из результатов, представленных в табл. 4, следует, что на изменение регенеративной способности планарий достоверное (а < 0,05) негативное влияние оказывает активность 90Sr. Эту зависимость можно описать следующим уравнением:
S = -3,574 - 0,75890Sr (r = 0,673). (2)
Таким образом, оценка полученных данных с помощью регрессионного анализа показала, что регенерационная способность планарий является чувствительным показателем к действию Р-излучения 90Sr и этот показатель можно использовать при проведении биологического мониторинга территорий, загрязненных данным радионуклидом.
Заключение. Модельные эксперименты показали, что планария Dugesia tigrina является радио -чувствительным тест-организмом, который можно использовать при биологической диагностике радиоактивных загрязнений.
В ходе исследований было выявлено, что активность 90Sr в диапазоне от 12,7 ± 1,3 до 26,5 ± 1,3 Бк/л не влияет на выживаемость планарий в опыте продолжительностью 72 часа. Также в работе было показано, что кислотность воды из контрольных скважин в районе старого хранилища радиоактивных отходов г. Обнинска находится в диапазоне от 6,8 ± 0,2 до 7,1 ± 0,2. Результаты определения изменения площади образования бластемы у планарий, находящихся в воде из контрольных скважин хранилища РАО г. Обнинска, в течение трех суток показали, что способность планарий к регенерации уменьшается с увеличением активности 90 Sr.
Биологический показатель Активность 90Sr Кислотность
Площадь образования бластемы, S -0,772 (0,013)* 0,445 (0,028)
Биологический показатель Параметры линейной регрессионной модели
Ро Р1 Р2
Площадь образования бластемы, S -3,574 (0,025) 0,464 (0,874) -0,758 (0,018)
В скобках указана значимость коэффициентов регрессии (а < 0,05). р0 — постоянная;
р! — коэффициент, характеризующий влияние рН; р2 — коэффициент, характеризующий влияние активности 90бг.
Библиографический список
1. Донченко, В. К. Актуальные проблемы изучения техногенного загрязнения окружающей среды // Экологическая безопасность. — 2007. — № 1—2. — С. 4—24.
2. Силин, И. И. Экология и экономика природных ресурсов бассейна р. Протвы (Калужская и Московская области). — Калуга: ВИЭМС. — 2003. — 324 с.
3. Филенко, О. Ф., Дмитриева, А. Г. Механизм реагирования водных организмов на воздействие токсичных веществ. Антропогенное влияние на водные экосистемы // М.: Изд-во МГУ. — 2005. — С. 70—93.
4. Шейман, И. М., Крещенко, Н. Д., Седельников, З. В., Грозный, А. В. Морфогенез у планарий Вщез1а tigгina // Онтогенез. — 2004. — Т. 35, № 4. — С. 285—290.
5. Зейферт, Д. В., Абдрашитов, Я. Ф., Овсянникова, И. В. Экологический мониторинг поверхностных вод с использованием биотестирования // Экологический вестник России. — 2014. — № 5. — С. 34—40.
6. Экологический мониторинг: Учеб.-метод. пособие для вузов / Под ред. Ашихминой Т. Я. — М.: Академ. проект. — 2005. — 416 с.
7. Методические рекомендации. Отбор и подготовка проб питьевой воды для определения показателей радиационной безопасности. — 2007. — 212 с.
8. Моисеенок, Т. А., Гашев, С. Н., Петухова, Г. А. Биологические методы оценки качества вод: часть 2. Биотестирование // Вестник Тюменского государственного университета. — 2010. — № 7. — С. 42—50.
9. Мичукова, М. В. Области использования культуры Вщез1а tigгina // Вестник Казанского технологического университета. — 2007. — № 3. — С. 106—123.
10. Мелехова, О. П., Егорова, Е. И., Евсеева, Т. И. и др. Биологический контроль окружающей среды: биоиндикация и биотестирование: учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений; под ред. О. П. Мелеховой и Е. И. Егоровой. — М.: Издательский центр «Академия». — 2007. — 480 с.
ASSESSMENT OF THE REGENERATIVE ABILITY OF PLANARIA DUGESIA TIGRINA UNDER IONIZING RADIATION
N. N. Pavlova, Ph. D. (Biology), lecturer;
Obninsk Institute for Nuclear Power Engineering (OINPE), [email protected], Obninsk, Russia N. V. Amosova, Ph. D. (Biology), lecturer;
Obninsk Institute for Nuclear Power Engineering (OINPE), [email protected], Obninsk, Russia M. M. Rasskazova, Ph. D. (Biology), lecturer;
Obninsk Institute for Nuclear Power Engineering (OINPE), [email protected], Obninsk, Russia References
1. Donchenko V. K. Aktualnye problemy izucheniya tehnogennogo zagryazneniya okruzhayushej sredy. [Current issues of studying technogenic pollution of the environment]. Ekologicheskaya bezopasnost. No. 1—2, 2007. P. 4—24. (in Russian)
2. Silin I. I. Ekologiya i ekonomika prirodnyh resursov bassejna r. Protvy (Kaluzhskaya i Moskovskaya oblasti). [Ecology and economy of natural resources of the basin of the river Protva (the Kaluga and Moscow Regions)]. Kaluga, VIEMS, 2003. P. 324. (in Russian)
3. Filenko O. F., Dmitrieva, A. G. Mehanizm reagirovaniya vodnyh organizmov na vozdejstvie toksichnyh veshestv. Antropo-gennoe vliyanie na vodnye ekosistemy. [The mechanism of the reaction of aquatic organisms to the effect of toxic substances. Anthropogenic impact on aquatic ecosystems]. Moscow, Izdatelstvo MGU, 2005. P. 70—93. (in Russian)
4. Shejman I. M., Kreshenko N. D., Sedelnikov Z. V., Groznyj A. V. Morfogenez u planarij dugesiatigrina. [Morphogenesis in the planaria dugesiatigrina]. Ontogenez, Vol. 35, No. 4, 2004. P. 285—290. (in Russian)
5. Zejfert, D. V., Abdrashitov, Ya. F., Ovsyannikova, I. V. Ekologicheskij monitoring poverhnostnyh vod s ispolzovaniem bio-testirovaniya. [Ecological monitoring of surface waters using biotesting]. Ekologicheskij vestnik Rossii. No. 5, 2014. P. 34—40. (in Russian)
6. Ekologicheskij monitoring: Uchebno metodicheskoe. posobie dlya vuzov. Pod redakciey Ashihminoj T. Ya. [Environmental monitoring: university tutorial. Edited by Ashihmina T. Ya.]. Moscow, Akadem. proekt, 2005. P. 416. (in Russian)
7. Metodicheskie rekomendacii. Otbor i podgotovka prob pitevoj vody dlya opredeleniya pokazatelej radiacionnoj bezopasnosti. [Guidelines. Selection and preparation of drinking water samples for determination of radiation safety indicators]. 2007. P. 212. (in Russian)
8. Moiseenok, T. A., Gashev, S. N., Petuhova, G. A. Biologicheskie metody ocenki kachestva vod: chast 2. Biotestirovanie. [Biological methods for assessing water quality: Part 2. Biotesting]. Vestnik tyumenskogo gosudarstvennogo universiteta No. 7, 2010. P. 42—50. (in Russian)
9. Michukova, M. V. Oblasti ispolzovaniya kultury Dugesia tigrina. [Using of the culture Dugesia tigrina]. Vestnik Kazanskogo tehnologicheskogo universiteta. No. 3, 2007. P. 106—123. (in Russian)
10. Melekhova, O. P., Egorova, E. I., Evseeva, T. I. Biologicheskij kontrol okruzhayushej sredy: bioindikaciya i biotestirovanie. Uchebnoe posobie dlya studentov vuzov. Pod red. O. P. Melehovoj i E. I. Egorovoj. [Biological control of the environment: bioindication and biotesting: a tutorial for university students]. Moscow, Akademiya, 2007. P. 480. (in Russian)
