CC BY
40VETERINARY PHARMACOLOGY WITH TOXICOLOGY
УДК: 619:615.3:576.3:615.9
ИЗУЧЕНИЕ ИЗБИРАТЕЛЬНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ КУЛЬТУР КЛЕТОК IN VITRO К ДЕЙСТВИю Т-2 ТОКСИНА
1Рин.С. Мухаммадиев - кандидат биологических наук, н.с.; 1Риш.С. Мухаммадиев - мл.н.с.;
1В.В.Бирюля - кандидат биологических наук, в.н.с.; 2Л.М.Залялютдинова - аспирант;
1И.И.Идиятов - кандидат биологических наук, с.н.с., 1С.Р.Галлямова - младший научный сотрудник;
34А.А.Набатов - доктор биологической наук, доцент;1Л.Р.Валиуллин - кандидат биологических наук,
зав сектором.
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г.Казань (420008, Казань, Научный городок-2, тел. +7(843) 239-53-20, e-mail: vnivi@mail.ru).
2ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет», г.Казань
(420008, Россия, г. Казань, ул. Кремлевская, 18, тел.+7(843) 233-71-09, e-mail:public.mail@kpfu.ru).
'Поволжская государственная академия физической культуры, спорта и туризма, г.Казань (420010, Казань, дер.Универсиады, 35, тел. +7 (843) 294-90-02, e-mail: info@sportacadem.ru)
4Казанская государственная медицинская академия, г.Казань (420012, Россия, г. Казань, ул.Муштари, 11, +7(843) 267-61-51, e-mail: ksma.rf@tatar.ru).
Проведено изучение цитотоксичности Т-2 токсина в отношении линий клеток фибробластов кожи человека (HSF) и клеток эпителия легкого эмбриона крупного рогатого скота (LEK). Цитотоксическое действие токсина определяли по выживаемости культур клеток стандартным методом МТТ- теста и выражали через значения параметров 1С0 (наименьшая концентрация токсина, способная к 50% подавлению роста клеток изучаемой культуры). Совместная инкубация Т-2 токсина в концентрациях2500-1,2 нМ с клетками фибробластов кожи HSFи эпителия легкого эмбриона крупного рогатого скота LEK приводило к подавлению роста клеток изучаемых культур. Наиболее выраженное цитотоксическое действие отмечается при воздействие токсина на линию клеток фибробластов кожи человека HSF. Т-2 токсин в диапазоне концентрации 2500-1,2 нМ проявлял дозозависимое токсическое действие по отношению к линий клеток фибробластов кожи, с величиной IC0121,05 ± 22,1 нМ. Исследование морфологии исследуемых культур после совместной инкубации их с Т-2 токсином показало, что более низкие дозы Т-2 токсина приводили к изменению размеров, формы большинство клеток фибробластов кожи HSF, их конденсации, обособлению, и потере контактов между ними. Высокие дозы токсина приводили к деградации мембран клеток, препятствию образования монослоя, образованию неоформленных клеточных агрегатов и гибели исследуемых клеток путем апоптоза. Концентрация токсина, при которой наблюдалось 50%-ное ингибирование роста линии клеток эпителия легкого эмбриона крупного рогатого скота (LEK), составляла выше 2500 нМ.
КЛюЧЕВЫЕ СЛОВА: Т-2 токсин, культура клеток, клетки фибробластов кожи человека, клетки эпителия легкого эмбриона крупного рогатого скота, морфология, выживаемость, цитотоксичность.
Трихотецены представляют собой большую группу вторичных метаболитов, главным образом, продуцируемых микромицетами рода Fusarium
[1]. Они могут образовываться в продуктах зерновых культур, включая кукурузу, пшеницу и ячмень, выращиваемые в регионах мира с умеренным климатом
[2]. При попадании трихотеценовых токсинов через зараженную пищу и корм в организм, они могут вызывать нарушение обмена веществ, дисбактериоз, аллергические реакции, пищевые отравления людей и животных [3]. Наиболее выраженным токсическим эффектом трихотеценов на молекулярном и клеточном уровнях является ингибирование синтеза белка и нуклеиновой кислоты, а также индукция апоптоза клеток [4,5]. Т-2 токсин, принадлежащий к группе трихотеценов типа А, является одним из высокотоксичных и распространенных микотоксинов [1]. Он способен проникать во все типы клеток, способствуя генерации активных форм кислорода (АФК), которые могут впоследствии индуцировать перекисное окисление
липидов, повреждение ДНК и апоптоз клеток [6, 7]. Ряд авторов указывают эффект Т-2 токсина на клетки желудочно-кишечного тракта, дыхательной системы, кожи и лимфоидные клетки [8, 9]. Число публикаций по данной тематике увеличивается, что свидетельствует об актуальности проводимых исследований.
Целью настоящей работы было изучение избирательной чувствительности культур клеток in vitro к действию Т-2 токсина.
Материалы и методы. Линии клеток фибробластов кожи (HSF) и клеток эпителия легкого эмбриона крупного рогатого скота (LEK) были предоставлены из коллекции культур клеток Научно-образовательного центра фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета и Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии (г.Москва).
Цитотоксичность токсина определяли по выживаемости культур клеток общепринятым методом МТТ-теста [10]. Клетки выращивали на питательной
32
НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ ЖУРНАЛ
№ 5/2018
ВЕТЕРИНАРНАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ С ТОКСИКОЛОГИЕИ
среде DMEM («Gibco», США) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки, 0,5% пенициллина-стрептомицина, 0,5% 200 мМ L-глутамина в инкубаторе MCO-19AIC (Sanyo, Япония) при температуре 37°С, 5% CO2 и 95% влажности. Клетки высевали в 96-ти луночные планшеты из расчета 5000 кл/мл и культивировали в инкубаторе в тех же условиях в течение 24 часов. Т-2 токсин, растворенный в 96% этиловом спирте, в концентрациях 2500-1,2 нМ вносили в лунки планшета с клетками и полученную смесь выдерживали при температуре 370С и 5% CO2 в течение 72 часов. После чего к клеткам вносили 4,5-ди-метилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтетразолиум бромид (МТТ-реагент, 0,5 мг/мл), растворенного в фосфатном солевом буфере (150 мМ NaCl, 5,2 мМ Na2HPO4, 1,7 мМ KH2PO4, pH 7.4) и проводили инкубацию смеси в течение 3 часов. После аспирирования красителя добавляли диметилсульфоксид (ДМСО), выдерживали в течение 10 мин и проводили измерение оптической плотности на микропланшетном ридере TECAN Infinite М200 Pro, при длине волны 555 нм (референтная длина-750 нм). Цитотоксическую активность токсина на клетки в условиях in vitro выражали через значения параметров 1С50. Контролем являлись клетки, инкубированные без д50обавления соединения.
Исследование морфологии клеточных культур после совместной инкубации клеток с токсином осу-
ществляли с помощью микроскопа Nikon Eclipse TS 100 (Япония) и программы Scope Photo 3.0.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с применением стандартного пакета программ Microsoft Office Excel 2013. Значения IC50 оценивали на основе дозозависимых кривых с использованием программы OriginTM.
Результаты исследований. Для изучения цито-токсичности биологически активных соединений на культуре клеток обычно применяют MTT- тест, метод окрашивания трипановым синим и измерение активности лактатдегидрогеназы (LDH). В наших экспериментах определение количества живых клеток проводили методом МТТ-теста, поскольку существенными преимуществами данного метода является высокая чувствительность, простота выполнения, данный метод входит во многие протоколы методов молекулярной биологии и медицины [11].
Результаты экспериментов показали, что после совместной инкубации Т-2 токсина в концентрациях 2500-1,2 нМ с клетками фибробластов кожи (HSF) и эпителия легкого эмбриона крупного рогатого скота (LEK) происходит подавление роста клеток изучаемых культур. Наиболее выраженный цитотоксический эффект наблюдается при действии токсина на линию клеток HSF, для которой величина IC50 составила 121,05 ± 22,1 нМ (рис.1).
Рис. 1. Цитотоксическая активность Т-2 токсина в отношении линии клеток фибробластов кожи (HSF).
Влияние Т-2 токсина в отношении линий клеток фибробластов кожи человека (ИБР) отчетливо наблюдается на микрофотографиях (рис. 2).
Исследование морфологии клеточных культур после совместной инкубации исследуемых клеток с Т-2 токсином показало, что в более низких концентрациях токсина большинство изучаемых клеток начинают конденсироваться, уменьшаться в размерах, приобретая округлую форму, обособляться,
теряя контакты между собой. При увеличении концентрации токсина происходит разрушение клеточных мембран, количество погибших клеток увеличивается, клетки начинают лизировать, наблюдается наличие неоформленных клеточных агрегатов и апоптозных тел.
Показатель 1С50 Т-2 токсина на исследуемые тест-культуры представлен в приведенной ниже таблице.
Рис. 2. Действие Т-2 токсина в отношении линии клеток фибробластов кожи человека ИБР. Слева направо: клетки ИБР, выращенные без добавления (контроль); ИБР + Т-2 токсин (156 мМ);
ИБР + Т-2 токсин (1250 мМ).
Таблица
Величина 1С50 Т-2 токсина в отношении линий клеток фибробластов кожи человека (ИБР) и клеток эпителия легкого эмбриона крупного рогатого скота (ЬБК).
Тест - культура Соединения, IC50, нM ■ LEK HSF
Т-2 токсин >2500 121,05 ± 22,1
Как видно из таблицы, для клеток эпителия легкого эмбриона крупного рогатого скота (1.БК), в тех же условиях, 50%-ное подавление роста линии клеток токсином составляла выше 2500 нМ.
Полученные данные согласуются с результатами зарубежных исследований, в которых обнаружено, что Т-2 токсин проявляет цитотоксическое действие в отношении большинства линий клеток, в том числе клеток фибробластов человека, с диапазоном 1С50 4-120 нМ и вызывает их апоптоз [12, 13]. Исследование Кима с соавторами [13] цитотоксической активности токсина на линиях нормальных клеток фибробластов методом МТТ-теста показало, что !С„ токсина составляет 122,0 нМ.
Заключение. Изучение чувствительности культур клеток in vitro к действию Т-2 токсина методом МТТ-теста показало, что токсин оказывает дозо-зависимый цитоксический эффект в отношении линий клеток фибробластов кожи человека (HSF). Наиболее выраженное цитотоксическое действие токсин проявляет на линию клеток фибробластов кожи человека HSF (1С50 121,05 ± 22,1 нМ). Концентрация токсина, при которой наблюдалось 50%-ное ингибирование роста линии клеток эпителия легкого эмбриона крупного рогатого скота (LEK), составляла выше 2500 нМ.
Литература
1. Bennett, J.W. Mycotoxins/ J.W.Bennett, M.Klich // Clin Microbiol Rev. - 2003. - Vol. 16. - P. 497-516.
2. Schlatter, J. Toxicity data relevant for hazard characterization / J.Schlatter // Toxicol Lett. - 2004. - Vol. 153.
- P. 83-89.
3. Metabolic pathways of trichothecenes / Q.Wu, V.Dohnal, L.Huang [et al.] // Drug Metab Rev. - 2010. - Vol. 42.
- P. 250-267.
4. Cytotoxicity and related effects of T-2 toxin on cultured Vero cells / C.Bouaziz, S.Abid-Essefi, A.Bouslimi [et al.] // Toxicon. - 2006. - Vol. 48. - P. 343-352.
5. Pestka, J.J. Mechanisms of deoxynivalenol-induced gene expression and apoptosis / J.J.Pestka // Food Addit. Contam. Part A Chem. Anal. Control Expo. Risk Assess. -2008. - Vol. 25. - P. 1128-1140.
6. Li, D.T. Evaluation of deoxynivalenol-induced toxic effects on DF-1 cells in vitro: Cell-cycle arrest, oxidative stress, and apoptosis / D.T.Li // Environ Toxicol Phar. - 2014. - Vol. 37. - P. 141-149.
7. Fang, H. T-2 toxin induces apoptosis in differentiated murine embryonic stem cells through reactive oxygen species-mediated mitochondrial pathway / H.Fang // Apoptosis. - 2012. - Vol. 17. - P. 895-907.
8. T-2 Toxin, a Trichothecene Mycotoxin: Review of Toxicity, Metabolism, and Analytical Methods. / YLi, Z.Wang, R.C.Beier [et al.] // Agric. Food Chem. - 2011. - Vol. 59. - P. 3441-3453.
9. Mycotoxins: Occurrence, toxicology, and exposure assessment / S.Marin, A.J.Ramos, G.Cano-Sancho, V.Sanchis // Food and Chemical Toxicology. - 2013. - Vol. 60. - P. 218-237.
НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ ЖУРНАЛ № 5/2018
ВЕТЕРИНАРНАЯ ФАРМАКОЛОГИЯ С ТОКСИКОЛОГИЕЙ
10. Mather, J.P. Introduction to cell and tissue culture. Theory and technique / J.P.Mather, P.E.Roberts. - New York: Plenum Press, 1998. - 200 p.
11. Валидация ХТТ-теста для оценки антипролиферативной активности препаратов на основе моноклональ-ных антител / И.В.Лягоскин, М.А.Берестовой, Д.А.Потеряев [и др.] // Биопрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. - 2015. - Том 1, № 53. - С. 45-50.
12. Metabolism and cytotoxic effects of T-2 toxin and its metabolites on human cells in primary culture / M.Konigs, D.Mulac, G.Schwerdt [et al.] // Toxicology. - 2009. - Vol. 258. - P. 106-115.
13. Kim, YW. Effects of T-2 toxin and its congeners on membrane functions of cultured human fibroblasts / YW.Kim, R.PSharma, YElsner // Mycotoxin Res. - 1991. - Vol. 7. - P. 19-28.
INVESTIGATION OF THE SELECTIVE SENSITIVITY OF CELL CULTURES IN VITRO TO THE EFFECT OF T-2 TOXIN
1Mukhammadiev Rin.S. - Candidate of Biological Sciences; 1Mukhammadiev Rish.S. - Junior Researcher;
1Birulya V.V. - Candidate of Biological Sciences; 2Zalyalyutdinova L.M. - postgraduate student;
1Idiyatov I.I. - Candidate of Biological Sciences; 1Gallyamova S.R. - Junior Researcher;
1Valiullin L.R. - Candidate of Biological Sciences.
1Federal Center for Toxicological, Radiation and Biological Safety, Kazan (e-mail: vnivi@mail.ru).
2Kazan Federal University, Kazan (e-mail:public.mail@kpfu.ru).
3Volga Region State Academy of Physical Culture, Sport and Tourism, Kazan (e-mail: info@sportacadem.ru).
4Kazan State Medical Academy, Kazan (e-mail: ksma.rf@tatar.ru)
A study of the cytotoxicity of the T-2 toxin against human skin fibroblast (HSF) and cow embryo lung epithelial cell lines (LEK) was made. The cytotoxic effect of the toxin was determined by the survival of cell cultures using the standard MTT assay and expressed as IC50 values (the least concentration which produces 50% inhibition of growth). The combined incubation of T-2 toxin at concentrations of 2500-1.2 nM with human skin fibroblast (HSF) and cow embryo lung epithelial cell lines (LEK) led to inhibition of cell growth in culture. The most pronounced cytotoxic effect of the toxin was observed on HSF cells. T-2 toxin in the concentration range of2500-1.2 nM exhibited a dose-dependent toxic effect against human skin fibroblast cell lines (IC50121.05 ± 22.1 nM). A study of the morphology of the cultures after their combined incubation with T-2 toxin showed 0hat lower doses of the toxin led to a change in the size, shape of the human skin fibroblast cells, their condensation, their isolation and loss of contact between them. High doses of the toxin led to the cell membrane degradation, prevented the cells to form a monolayer, the formation of unshaped cellular aggregates and the dying of the studied cells by high level of apoptosis. The toxin concentration at which the inhibition of growth of 50% of the cow embryo lung epithelial cell lines (LEK) was observed was above 2500 nM.
KEYWORDS: T-2 toxin, cell culture, human skin fibroblast, cow embryo lung epithelial cell lines, morphology, survival, cytotoxicity.
References
1. Bennett, J.W. Mycotoxins / J.W.Bennett, M.Klich // Clin Microbiol Rev. - 2003. - Vol. 16. - P. 497-516.
2. Schlatter, J. Toxicity data relevant for hazard characterization / J.Schlatter // Toxicol Lett. - 2004. - Vol. 153.
- P. 83-89.
3. Metabolic pathways of trichothecenes / Q.Wu, V.Dohnal, L.Huang [et al.] // Drug Metab Rev. - 2010. - Vol. 42.
- P. 250-267.
4. Cytotoxicity and related effects of T-2 toxin on cultured Vero cells / C.Bouaziz, S.Abid-Essefi, A.Bouslimi [et al.] // Toxicon. - 2006. - Vol. 48. - P. 343-352.
5. Pestka, J.J. Mechanisms of deoxynivalenol-induced gene expression and apoptosis / J.J.Pestka // Food Addit. Contam. Part A Chem. Anal. Control Expo. Risk Assess. -2008. - Vol. 25. - P. 1128-1140.
6. Li, D.T. Evaluation of deoxynivalenol-induced toxic effects on DF-1 cells in vitro: Cell-cycle arrest, oxidative stress, and apoptosis / D.T.Li // Environ Toxicol Phar. - 2014. - Vol. 37. - P. 141-149.
7. Fang, H. T-2 toxin induces apoptosis in differentiated murine embryonic stem cells through reactive oxygen species-mediated mitochondrial pathway / H.Fang // Apoptosis. - 2012. - Vol. 17. - P. 895-907.
8. T-2 Toxin, a Trichothecene Mycotoxin: Review of Toxicity, Metabolism, and Analytical Methods. / YLi, Z.Wang, R.C.Beier [et al.] // Agric. Food Chem. - 2011. - Vol. 59. - P. 3441-3453.
9. Mycotoxins: Occurrence, toxicology, and exposure assessment / S.Marin, A.J.Ramos, G.Cano-Sancho, V.Sanchis // Food and Chemical Toxicology. - 2013. - Vol. 60. - P. 218-237.
