CC BY
93
УДК: 615.011.5.32:582.341:631.445.122/.124
М. В. Гостищева, М. В. Белоусов, Р. Р. Исматова 1, К. Ю. Васильев, С. Е. Дмитрук, М. С. Юсубов
Изучение химико-токсикологических свойств гуминовых кислот низинного торфа Томской области
Сибирский государственный медицинский университет
634050, г. Томск, Московский тракт, 2 Башкирский государственный медицинский университет 450068, г. Уфа, ул. Ленина, 3, тел./факс (347) 2224173
В статье приводятся результаты исследования химического строения гуминовых кислот низинного древесно-травяного вида торфа Томской области методами элементного анализа и инфракрасной спектроскопии. В работе также описаны результаты токсикологического исследования гуминовых кислот: острой токсичности, патоморфологии и реологических свойств крови. Показано, что гуминовые кислоты низинного торфа представляют собой соединения с высокой долей алифатических фрагментов, представленных длинными сопряженными цепями, имеют малую степень бензоидности, содержат активные кислород- и азотсодержащие функциональные группы (карбоксильные, гид-роксильные, амидные, аминогруппы). Установлено, что гуминовые кислоты при внутрижелу-дочном введении являются малотоксичными веществами. При внутрибрюшинном введении летальных доз, гибель животных наступает от острой сердечной недостаточности, при этом причиной острого нарушения гемодинамики может быть негативное влияние гуминовых кислот на реологические свойства крови.
Ключевые слова: торф, гуминовые кислоты, элементный анализ, инфракрасная спектроскопия, острая токсичность, патоморфология, реологические свойства крови.
Введение
Гуминовые кислоты (ГК) торфа — это сложная смесь высокомолекулярных и полифункциональных соединений алициклической, гидроароматической, ароматической и гетероциклической природы, замещенных разной длины алкильны-ми цепями как нормального, так и изомерного строения, включающих предельные и непредельные связи с различными функциональными группами (карбоксильными, гидроксильными, метоксильными, амид- ными, аминогруппами) 1. ГК торфа представляют собой кислотно-основной комплекс и являются донорами и акцепторами анионов, катионов, протонов и электронов, они могут участвовать в различных окислительно-восстановительных реакциях, в ферментатив-
Дата поступления 18.03.08
но-субстратных взаимодействиях, в детоксика-ции ксенобиотиков, участвуют в действии на осмотическое давление, в образовании комплексных соединений, включая хелатные, с некоторыми биофильными элементами и других процессах 2 .
Перечисленные особенности обуславливают не только большое разнообразие химических свойств этих кислот, но и широкий спектр их биологической активности. При этом, несмотря на наличие большого количества общих элементов структуры, биологическая активность ГК, полученных из разных месторождений торфа, может существенно различаться, что обусловлено высокой степенью полиморфизма их химической структуры 8 9. Это делает практически невозможными попытки теоретического обобщения и внеэкспери-ментального прогнозирования особенностей их токсических и фармакологических свойств по общим элементам структуры и обуславливает необходимость биологической стандартизации образцов из каждого месторождения.
В настоящей работе мы провели исследование химического строения и токсических свойств гуминовых кислот, полученных из низинного древесно-травяного вида торфа месторождения «Клюквенное» Томского района Томской области.
Материалы и методы исследования
Для исследования ГК взят низинный торф древесно-травяного ботанического состава, со степенью разложения 25%, зольностью 8.1%, с глубины 10—30 см торфяного месторождения «Клюквенное» Томского района Томской области, содержание гуминовых кислот в котором составляет 43.6 % мас. на органическое вещество торфа.
Гуминовые кислоты выделяли 0.1 н NaOH по схеме, описанной в 1. Элементный состав определяли на C, H, N — анализаторе «Carlo
Erba Strumentazione» модель 1106 (Италия). Спектры инфракрасного поглощения записывали на ИК — Фурье-спектрометре Nicolet 5700 (Thermo Electron corp., США) в таблетках с KBr в соотношении 1 : 100 соответственно, в интервале значений частоты от 500 до 4000 см-1.
Исследование острой токсичности проведено на половозрелых белых беспородных мышах-самцах массой 18-22 г и половозрелых белых беспородных крысах-самцах массой 180-200 г. Острую токсичность оценивали при однократном внутрижелудочном и внутрибрю-шинном способах введения. Изучаемый препарат гуминовых кислот торфа (ГКТ) вводили мышам и крысам внутрибрюшинно и внутри-желудочно в виде 3% водного раствора (рН = 7.4), в максимально возможном для данного вида животных и способа введения объеме. В течение 14 сут. после введения препарата вели наблюдение за животными. В случае летальных исходов фиксировали клиническую картину отравления: гибель, изменения двигательной активности и мышечного тонуса, состояние кожных покровов и слизистых оболочек, наличие судорог, птоз, саливацию, наличие выделений, способность животных сохранять правильное положение тела. Расчет ЛД50 проводился по методу Литчфилда-Уилкоксона 10' 11, с расчетом параметров частично смертельной (ЛД1б), среднесмертельной (ЛД50), абсолютно смертельной (ЛД100) и близкой к абсолютно смертельной доз (ЛД84). Рассчитывали стандартное отклонение величины средней смертельной дозы (SD лд50).
Патоморфологические исследования на крысах проведены совместно с кафедрой оперативной хирургии и патологической анатомии СибГМУ (г. Томск). Для установления причины гибели и выявления органов-мишеней проводили вскрытие погибших животных (крыс - самцов) и проводили макроскопическое исследование внутренних органов. Для микроскопического исследования были взяты следующие органы: головной мозг, мозжечок, гипофиз, сердце, легкое, печень, почка, желудок, тонкая и толстая кишка, поджелудочная и щитовидная железы, селезенка, тимус, надпочечник, семенник. Кусочки органов фиксиро-
вали в формалине и заливали в парафин. Де-
парафинированные срезы окрашивали гема-
12
токсилином и эозином .
Исследование влияния на реологические свойства крови проводили по влиянию ГК на показатели обратимой агрегации эритроцитов (ОАЭ) крыс при внесении исследуемого препарата in vitro в пробу цельной крови крыс. Регистрацию показателей ОАЭ осуществляли фотометрическим вибрационным ме-13
тодом с помощью специального микроскопа и самописца. Принцип метода основан на измерении оптической плотности пробы сопровождающей процессы дезагрегации и агрегации эритроцитов под воздействием вибрации. Определяли скорость спонтанной агрегации эритроцитов, величину полупериода агрегации эритроцитов — т. На основании измеренных показателей ОАЭ расчетным путем определялся индекс агрегации — Ja = Ud/т, характеризующий соотношение агрегационных и дезаг-
13
регационных процессов 13.
Результаты и обсуждение
Анализируя данные элементного состава (табл. 1), следует отметить довольно невысокое содержание углерода в исследуемых ГК (47.0% мас.). Согласно разработанным Д. С. Орловым 14 диагностическим признакам отнесения выделенных из природных объектов веществ к гуминовым кислотам, данные результаты составляют нижний предел содержания в них углерода (46—62% мас.), что весьма характерно для торфяных ГК 8'14'15. Содержание кислорода косвенно характеризует содержание кислородсодержащих функциональных групп 16, для исследуемых ГК отмечены высокие значения (43.5% мас.), согласно атомному отношению О/С, они обладают высокой степенью окисленности молекулы, что может быть связано с большим содержанием в их структуре карбоксильных и гидроксильных групп 9 и др'. О высоком количестве амидных и аминогрупп могут свидетельствовать данные атомного отношения С/N 17' 9. Анализируя содержание азота в исследуемых ГК (3.8% мас.) можно отметить, что они удовлетворяют вышеупомянутым требованиям диагностических
Таблица 1
Элементный состав и атомное отношение в гуминовых кислотах торфа
Тип, вид торфа Элементный состав, мае. % на беззольную навеску Атомное отношение
С Н N О S Н/С С/N О/С
Низинный дре-весно-травяной 47.00 5.50 3.80 43.50 0.20 1.40 14.43 0.69
признаков ГК по Д. С. Орлову 14, согласно которым содержание азота должно быть от 3 до 6 % мас.
Полученные спектры инфракрасного поглощения (рис. 1) исследуемых ГК свидетельствуют о том, что для них характерны типичные для ГК торфов полосы поглощения 8' 9' и' 15, 18' 19. Отмечается широкая интенсивная полоса поглощения с максимумом при 3500—3300 см-1, которая обусловлена валентными колебаниями гидроксильных групп (vOH) различного характера, преимущественно связанных водородными связями. На длинноволновом крыле главной полосы около 32503200 см-1 обнаруживается поглощение средней интенсивности, имеющее вид уступа (перегиба) и отвечающее валентным колебаниям N-H (vNH) в структуре амида, аминов, связанным водородными связями. При 2926-2920 см-1 и 2852 см-1 хорошо видны полосы средней интенсивности, поглощающие за счет валентных колебаний -СН3 и -СН2 групп боковых цепей в молекулах ГК, и вызваны преимущественно метиленовыми группировками, на что указывает и полоса асимметричных и симметричных деформационных колебаний в области 1480-1380 см-1.
На спектрах исследуемых ГК отмечается слабое поглощение при 2600-2500 см-1, которое характерно для карбоновых кислот. Эта широкая полоса считается очень характерной для валентных колебаний гидроксильных групп (vOH), участвующих в образовании сильных водородных связей в димерных формах карбоновых кислот. Отчетливый макси-
Рис. 1. ИК-спектр гуминовъх кислот низинного
в интервале от 1725 до 1650 см-1, что свойственно валентным колебаниям карбонильных групп (уС=О), которые могут быть представлены кетонами, альдегидами, карбоновыми кислотами и их функциональными производными 14, 15, 18, 19. Интенсивная полоса поглощения в области 1650-1600 см-1 обусловлена плоскостными колебаниями сопряженных углерод-углеродных (ароматические, ^>С) и углерод-кислородных связей (карбонилы, связанные водородными связями, карбоксилат-ионы, vС=О), в ароматическом скелете и хинонах. Некоторые авторы считают 14, 18, что именно ароматические vС=С ответственны за данную полосу, максимум которой приходится на 1610 см-1. В исследуемых ГК максимум наблюдается также при 1630 см-1, что может быть обусловлено наложением полосы амид-ной группы (5КН2, амид II). Полоса поглощения около 1513 см-1 ^С-С) указывает на наличие неконденсированных ароматических соединений в составе ГК, связанных с атомами азота и кислорода.
Колебания в области 1264-1225 см-1 определяются в основном валентными ^С-О) и деформационными колебаниями (5О-Н) связей. За поглощения излучения в коротковолновой части спектра в области 1150-1000 см-1 ответственны валентные колебания спиртовых и углеводных гидроксильных групп (^)Н). В интервале около 1050 см-1 (^-0) поглощают излучение первичные спирты, при 1100 см-1 ^С-0) - вторичные спирты и при 1150 см-1 ^С-0) - третичные спирты. Поглощение в данной области может быть также обусловлено валентными колебаниями (^-0-С) глико-
1500 " 1000 500
См-1
зидных связей углеводов, С—О—С-связями циклических и алифатических простых эфиров. В области волновых чисел от 1000 до 600 см-1 наблюдаются слабые полосы поглощения, возможно, обусловленные внеплоскостными деформационными колебаниями (5С_Н) в ароматических кольцах, имеющих два и более незамещенных атомов водорода.
Таким образом, максимальная интенсивность полос поглощения в спектрах гуминовых кислот низинного древесно-травяного торфа отмечена для гидроксильных, карбонильных (карбоксильных) групп, алифатических и ароматических фрагментов.
При внутрижелудочном введении мышам ГК в виде 3% водного раствора в диапазоне доз 3750-7500 мг/кг наблюдалась дозозависимая гибель животных (табл. 2). Средняя летальная доза (ЛД50) исследуемого препарата гумино-вых кислот составила 4658.40 мг/кг. Таким образом, исследуемый препарат ГК при введении внутрь мышам следует отнести к III классу опасности _ вещества умеренно опасные. При этом величина ЛД50 исследованного препарата приближается к IV классу опасности _ вещества мало опасные (ЛД50 > 5000 мг/кг).
Таблица 2 Параметры острой токсичности ГК при внутрижелудочном введении мышам-самцам
Дозы, мг/кг Процент гибели Показатели острой токсичности
2800 0 ЛД16 = 3399.50 мг/кг ЛД50 = 4658.40 мг/кг ЛД84 = 5917.30 мг/кг ЛД100 = 6546.70 мг/кг 30Лд50 = 445.08 мг/кг
3750 13
4400 40
5000 100
7500 100
При внутрибрюшинном введении мышам ГК проявляют более выраженные токсические свойства _ дозозависимая гибель животных наблюдалась в диапазоне доз 238.7-974.1 мг/кг (табл. 3). Средняя летальная доза (ЛД50) исследуемого препарата гуминовых кислот при внутрибрюшинном введении составила 532.89 мг/кг.
Таблица 3 Параметры острой токсичности ГК при внутрибрюшинном введении мышам-самцам
Дозы, мг/кг Процент гибели Показатели острой токсичности
200 0 ЛД16 = 238.73 мг/кг ЛД50 = 532.89 мг/кг ЛД84 = 827.05 мг/кг ЛД100 = 974.14 мг/кг лд50= 78.62 мг/кг
400 40
559 60
780 75
1055 100
При внутрижелудочном введении исследуемого препарата крысам в аналогичном диапазоне доз не наблюдалось гибели животных и картины острого отравления в течение двух недель наблюдения (табл. 4), что, возможно, связано с более медленным всасыванием гуми-новых кислот в желудочно-кишечном тракте. Таким образом, исследуемый препарат ГК при введении внутрь крысам соответствует IV классу опасности _ вещества малоопасные. При внутрибрюшинном ведении крысам величина ЛД50 исследованного препарата составила 480.12 мг/кг (табл. 5).
Таблица 4
Показатели выживаемости крыс-самцов при
внутрижелудочном введении ГК
Дозы, мг/кг Процент гибели
2800 0
3750 0
4400 0
5000 0
7500 0
Таблица 5 Параметры острой токсичности ГК при внутрибрюшинном введении крысам-самцам
Дозы, мг/кг Процент гибели Показатели острой токсичности
200 0 ЛД16 = 232.24 мг/кг ЛД50 = 480.12 мг/кг ЛД84 = 750.43 мг/кг ЛД100 = 867.32 мг/кг ЗО лд50= 48.63 мг/кг
400 40
559 60
780 75
1055 100
Для предварительной оценки возможных кумулятивных свойств ГК при внутрибрюшин-ном введении мы провели дробное введение препарата. Гуминовые кислоты торфа внутри-брюшинно вводили каждые 6 ч мышам и крысам в дозах, составляющих приблизительно 1/10 ЛД50 (50 мг/кг) при данном способе введения. В данных условиях эксперимента картина острого отравления и гибель животных отмечалась уже с 4_5 инъекции, что может прямо указывать на выраженную кумуляцию ГК в организме.
Необходимо отметить, что при введении летальных доз препарата ГК и у мышей, и у крыс наблюдалась сходная картина острого отравления: резкое снижение двигательной активности, ослабление мышечного тонуса, нарушение координации движений, выраженный цианоз (конечностей, семенников, ушей и мордочки). Для установления причин летальности и выявления возможных органов-мишеней, поражаемых при остром токсическом воздействии, мы провели патоморфологи-ческое исследование трупов крыс, погибших
при внутрибрюшинном введении заведомо летальных доз препарата ГК. При макроскопическом исследовании трупов животных отмечается выраженное полнокровие всех внутренних органов, другой патологии не выявлено. При микроскопическом исследовании было выявлено выраженное полнокровие внутренних органов со стазом форменных элементов. Наблюдается умеренно выраженный перивас-кулярный и перицеллюлярный отек головного мозга, геморрагический отек легких, острая коронарная недостаточность, острая почечная недостаточность. Обнаруживаются дистрофические изменения коры надпочечников. Смерть животных наступает от острой сердечной недостаточности, возникшей в результате ишемической дистрофии миокарда. Острые нарушения сердечной деятельности повлекли за собой застойные явления в малом круге кровообращения с развитием геморрагического отека легких. Общее острое нарушение гемодинамики явилось шоковым раздражителем для почек и стало причиной острой почечной недостаточности.
Одним из возможных механизмов подобного кардиотоксического действия ГК может быть их негативное влияние на реологические свойства крови, влекущее острое нарушение гемодинамики. Мы исследовали влияние на реологические свойства крови фотометрическим вибрационным методом 17. Судя по полученным результатам, ГК in vitro вызывают существенное (в 2.26 раза) в сравнении с показателями интактной пробы (увеличение показателя индекса обратимой агрегации эритроцитов (ОАЭ) (табл. 6).
Таблица 6 Влияние гуминовых кислот торфов и препаратов сравнения (трентала и декстрана) на показатели ОАЭ крови крыс (% от показателей интактной пробы)
Объект Uo, В Ud, В А, мм т, сек. I
ГКТ 108.1 166.1 94.6 73.5 226.8
Трентал 126.5 91.7 80.1 95.8 94.6
Декстран 144.6 78.0 47.0 133.5 58.5
Это может приводить к значительному увеличению вязкости крови, нарушению кровоснабжения миокарда и обусловливать негативное кардиотропное воздействие препарата ГК в летальных дозах.
Литература
1. Попов А. И. Гуминовые вещества: свойства, строение, образование. СПб.: Изд-во С.-Пе-терб. ун-та, 2004.— 248 с.
2. Аввакумова Н. П. Гуминовые пелоидопрепара-ты: перспективы использования в медицинской практике. // Материалы пятой научной школы
«Болота и биосфера». Томск: ЦHТИ, 2006.— С. 63-72.
3. Бамбалов H. H., Беленькая Т. Я. Фракционно-групповой состав органического вещества целинных и мелиорированных торфяных почв. // Почвоведение.- 1998.- № 12.- С. 1431-1437.
4. Лотош Т. Д. Механизм действия гуминовых веществ торфа. // Комплексное использование торфа в народном хозяйстве.— Мн., 1981. — С. 100-101.
5. Смирнова Ю. В., Виноградова В. С. Механизм действия и функции гуминовых препаратов. // Агрохимический вестник.— 2004.— № 1.— С. 22.
6. Flaig W. Chemische Untersuchungen an Humin Stoffen. // Zeitschrift fur Chemie. 4 Yahrgang.— 1964.- Heft 7.- S. 253-265.
7. Ziechmann W. Humic substances and their Medical Effectiveness. // 10th International Peat Congress.— 1996.— Volume 2.— Stuttgart.— Pp. 546-554.
8. Комиссаров И. Д. Гуминовые препараты.— Тюмень, 1974.- 267 с.
9. Лиштван И. И., Капуцкий Ф. H., Янута Ю. Г., Абрамец А. М., Швоша Ю. Ю., Стригуцкий В. П. Спектральные исследования фракций гумино-вых кислот. // Химия твердого топлива.— 2006.- № 4.- С. 3-11.
10. Ларионов Л. Ф. Методы экспериментальной химиотерапии.— М.: «Медицина», 1991.— С. 524.
11. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. / Под общей редакцией член-корр. РАМ^ проф. Р. У. Хабриева.— 2-изд., пере-раб. и доп.— М.:ОАО Издательство «Медицина», 2005.- 832 с.
12. Меркулов Г. А. Курс патогистологической техники. Медицина, Ленинградское отд., 1969.— 422 с.
13. Тухватулин Р. Т., Левтов В. А., Шуваева В. H., Шадрина H. Х. Агрегация эритроцитов в крови, помещенной в макро- и микрокюветы. // Физиологический журнал.— 1986.— № 6.— С. 775.
14. Орлов Д. С. Гумусовые кислоты почв и общая теория гумификации.— М.: МГУ, 1990.— 325 с.
15. Лукошко Е. С., Пигулевская Л. В., Хоружик А. В., Янковская H. С. Изменение химического состава гуминовых кислот в процессе торфообразова-ния и диагенеза торфа. // Химия твердого топлива.- 1980.- № 1.- С. 54-59.
16. Лиштван И. И., Бамбалов H. H., Тишкович А. В. и др. ГВ торфа и их практическое использование. // Химия твердого топлива.— 1990.— № 6.- С. 14-20.
17. Кирейчева Л. В., Хохлова О. Б. Элементный состав гуминовых веществ сапропелевых отложений. // Вестник РАСХ^- 2000.- № 4.-С. 59-62.
18. Орлов Д. С., Осипова H. H. Инфракрасные спектры почв и почвенных компонентов.— М.: МГУ, 1988.- 89 с.
19. Stevenson F. J. Humic Chemistry: Genesis, Composition, Reactions, second ed. // John Wiley & Sons.- New York.- 1994.- pp. 34-41.
20. Грибан В. К. К механизму действия препаратов гумусовой природы на организм животных. // Органическое вещество торфа.— Минск, 1995.— С. 120.
