CC BY
48
Лекарственные растения
© ПАРЬЕВА К.В., НИКОЛАЕВА Г.Г., НИКОЛАЕВА И.Г., ВЕРЕЩАГИН А.Л., ГОРШКОВ А.Г. -
ИЗУЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА МНОГОКОМПОНЕНТНОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СБОРА "ТАНТОН" ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ
К.В. Паръева, Г.Г. Николаева, И.Г. Николаева, А. А. Верещагин, А.Г. Горшков.
(Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, г.Улан-Удэ, директор - проф. В.М. Кор-супов)
Резюме. Разработан многокомпонентный препарат растительного происхождения. С целью дальнейшей стандартизации изучен компонентный состав эфирного масла, полученного путем перегонки с водяным паром из растительного сбора ''тантон'', с помощью ГЖХ идентифицировано более 40 соединений. Методом ВЭЖХ изучен водно-спиртовый экстракт из сбора, обна-
ружен ряд соединений фенольной природы. Ключевые слова: растительный сбор "тантон" вещества, газохромотография.
Одним из важных вопросов при разработке многокомпонентных спиртосодержащих фитопрепаратов является их стандартизация. Они требуют необходимости проведения целого комплекса исследований по определению отдельных биологически активных веществ и их характеристики. [1, 2,4]. Нами разработан многокомпонентный сбор (условно названный "тантон"), состоящий из 17 лекарственных растений. В его состав входят растительные адаптогены и иммуномодуляторы - ро-диола розовая, левзея сафлоровидная, солодка уральская, пятилистник кустарниковый, календула и др., а также растения с широким спектром фармакологической активности - боярышник кровавокрасный, аир болотный, бадан толстолистный, крапива двудомная и др. [3].
Целью нашей работы явилось определение химического состава эфирного масла, полученного путем перегонки с водяным паром из исходного растительного сбора, с помощью ГЖХ и разработанного водно-спиртового экстракта (эликсира) с использованием метода ВЭЖХ.
Материалы и методы
В состав сбора "тантон" входят растения, богатые по компонентному составу экстрактивных веществ. Часть растений содержит эфирные масла (мускатный орех, имбирь, кардамон, аир болотный и др.), действующим началом которых являются терпены и ароматические углеводороды.
С учетом этого проведен газохроматографический анализ с масс-спектральным детектированием эфирного масла из растительного сбора, полученного путем перегонки с водяным паром. Хроматограмма представлена на рисунке 1, наиболее характерные соединения приведены в таблице 1.
Условия GC-MS анализа: прибор Agilent 5973N+ GC6890, колонка Ultra-2 (5% фенилметилсилок-сан) 50 м, внутренний диаметр 320 мкм, поток гелия 1 мл/мин, температура 2 мин. - 70, далее 5 гр/ мин до 310 и еще 20 мин при этой температуре. Температура инжектора 260. Температура ионно-
, химический состав, биологически активные
го источника 230, температура квадруиоля 150, сканирование в диапазоне масс - 42-500. Идентификация по базам данных РВМ и N1ST на 150 000 соединений. Образец разбавляли хлороформом и автосамплером вводили в колонку. Количества веществ и разбавления не контролировали, т.к. анализ выполнялся качественный.
Таблица 1.
Летучие компоненты эфирного масла из растительного сбора "Тантон ". идентифицированные методом хромато-масс-спектрометрии
№ п/п Наименование компонента Время удерживания, мин.
1 а-пинен 9,84
2 Камфен 10,33
3 Бензальдегид 10,56
4 3-карен 12,04
5 Лимонен 12,56
6 Эвкалиптол 12,69
7 Борнеол 16,81
8 Борнилацетат 20,23
9 2,4-декадиепаль 20,87
10 а-кубебен 22,86
11 Кариофилен 24,15
12 Цедрен 24,27
13 Гекеадекан 28,13
14 Кариофилленоксид 28,33
16 Азарон 28,61
17 Дигидрокси-изокаламендиол 29,43
18 а-кадинол 29,88
19 Тетрадекановая кислота 31,9
20 Этиловый эфир тетрадека-новой кислоты 32,33
21 Диизобутилфталат 34,19
22 Дибутилфталат 36,10
23 Этиллинолеат 39,66
24 Трикозан 41,98
Для изучения группы малолетучих соединений и их количественного определения в составе вод-но-сииртового извлечения из растительного сбора использовались методы хроматографии на бумаге, в тонком слое сорбента и ВЭЖХ.
Объектом изучения был водно-спиртовый экстракт из растительного сбора "тантон". С помощью хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента с использованием стандартных образцов, в водно-спиртовом экстракте были обнаружены флавоноиды (рутин, кверцетин, пшерозид), фенолкарбоновые и органические кислоты. Исследование компонентного состава фенольных соединений экстракта проводили с помощью ВЭЖХ но следующей методике.
Подготовка образца для анализа. При определении флавоноидных гликозидов и их агликонов, органических кислот, водно-сииртовый экстракт анализировали без дополнительной подготовки с прямым вводом образца в аналитическую колонку хроматографа.
Условия хроматографии. Разделения проводили на жидкостном хроматографе "Милих-ром А-02" (ЗАО "Эконова" Новосибирск, Россия) на колонке (1=75 мм, 0 2 мм), упакованной сорбентом "Nucleosil, 100-5, С18", с эффективностью равной 5000 т.т. но пику хрнзена (к'= 10).
Флавоноидные гликозиды и их агликопы (апи-генин, кверцетин, лютеолин, лютеолин-7-глюко-зид, мирицетин, пшерозид, рутин, кемиферол, на-ренгенин) определяли при градиентном режиме хроматографии. Элюент А - смесь водного раствора калия фосфата (КН2РО4, 0,05 М, рН=3,0) и метанола при соотношении = 95:5 (об/об); элюент В - метанол. Градиент элюента В от 15% до 60% за 24 мин., при расходе элюентов 0,15 мл/ мин. Температура колонки 50°С. Элюируемые соединения детектировали при 258, 278, 290, 318 и 350 нм, одновременно.
Органические и фенолкарбоновые кислоты определяли в градиентном режиме элюирования: градиент элюента В от 0% до 45% за 13 мин., при
П1« : C:\MSDCHeM\l\DATA\MICft01\OODe3.D
operator :
Acquired 1 Si Jul 2003 10i99 ualng AoqNcthod 0_UDC
Inatiumant 1 In«tru«wn
nwnpl* Nanai Eater oil "Tonten" 21.04.U3 Hi.sc info I Vial Nurabaxi S
расходе элюентов 0,2 мл/мин. Элюент А - смесь водного раствора калия фосфата (КН2РО4, 0,05 М, рН=3,0) и ацетонитрила при соотношении раствор фосфата калия: ацетонитрил = 95:5 (об/об). Элюент В - ацетонитрил. Элюируемые кислоты детектировали при 218, 236, 260, 274 и 320 нм, одновременно. Температура колонки 40°С.
Пики на хроматограммах идентифицировали но двум параметрам: время удерживания (1к) и интегральное спектральное отношение (Я). Значения Я рассчитывали как отношения площадей пиков, зарегистрированных на использованных длинах волн детектирования. Доверительные интервалы для ииков при градиентном и изократиче-ском разделениях не превышали 2% (и=1, Р=0,95), для II - 5,6% (и=1, Р=0,95).
Количественное определение проводили методом внешнего стандарта. В качестве внешних стандартов использовали растворы индивидуальных соединений с известной концентрацией. Чистота соединений по данным ВЭЖХ составляла не менее 95%. Суммарная погрешность измерений не превышала 5%.
Результаты и обсуждение
Методом ГЖХ обнаружено более 40 соединений, хроматограмма летучих компонентов эфирного масла представлена на рисунке 1, идентифицированные соединения в таблице 1.
Из анализа хроматограмм, полученных методом ВЭЖХ, видно, что исследованный образец водно-спиртового извлечения из сбора "тантон", является очень сложной смесью, а многие определяемые действующие вещества относятся к минорным компонентам в химическом составе водно-спиртового экстракта, что характерно для подобных многокомпонентных фитопрепаратов. Из-за низкой концентрации многих, даже важных с позиции фармакологического действия индивидуальных веществ, теряется возможность их количественной оценки, поскольку их концентрация лежит за пределами возможностей аналитического метода (однако, это не означает снижения ак-
тшшости препарата, поскольку оно обеспечивается суммой очень большого числа компонентов). Их идентификация в условиях серийного анализа практически весьма затруднена, т.к. требует индивидуальной оптимизации условий разделения для каждого- искомого соединения, что представляет сложную аналитическую задачу, решение которой возможно путем выделения узких фракций и их последующего анализа.
Время, МИН
Образец 1
Рис.2.
Время, МИН
Рис.З.
В результате исследования пиков на хроматограмме, полученной с помощью ВЭЖХ (рис.2, 3), выявлено, что многие из них соответствуют соединениям флавоноидной природы, поскольку, в основном проявлялось специфическое поглощение с максимумом при длинах волн 240-260 нм и 320-380 нм, характерное для флавоноидов и фе-нолкарбоновых кислот. Идентифицированы фла-воноиды: гииерозид, кверцетин и мирицетин.
Также дополнительно было установлено, что идентификация лютеолин-7-глюкозида и рутина
затруднена их практически идентичными спектральными характеристиками и хроматографическим поведением. В результате для указанных соединений не удалось однозначно отнести пики на полученных хроматограммах и провести их количественное определение. В таблице 2, для лютео-лин-7-глюкозида и рутина дана лишь оценка возможных концентраций. В образце не были обнаружены, при концентрациях выше предела определения использованного метода, аиигенин, лю-теолин, нарингенин, кемпферол. Поиск органических и фенолкарбоновых кислот показал присутствие галловой кислоты в образце. Результаты анализа водно-сииртового экстракта "тантон" представлены в таблице 2.
Таблица 2.
Результаты идентификации соединений
водно-спиртового извлечения "тантон "
Стандарт ВС И "тантон"
tR, мин tR, мин С, мкг/мл
1 Аиигенин 10,02±0,20 <5
2 Г ииерозид 11,60±0,23 11,42 11,3 ±0,6
3 Лютеолин-7- глюкозид 11,89+0,24 11,80 не более 80
4 Рутин 11,89±0,24 11,80 не более 100
5 Мирицетин 13,02±0,26 13,00 не более 10
6 Нарингенин 16,3±0,3 16,5 <5
7 Кверцетин 16,5±0,3 16,5 5,0±0,2
8 Лютеолин 17,8±0,4 <5
9 Кемпферол 19,7±0,4 <5
10 Галловая кислота 1,56+0,03 1,55 59,0±3
Таким образом, установлен состав летучих компонентов водно-сииртового экстракта из растительного сбора "тантон" с помощью хромато-масс-сиектрометрического анализа. Зарегистрировано свыше 40 соединений, главные из которых относятся к монотериеноидам (борнеол, борнил-ацетат и др.), сложным эфирам высших жирных кислот (этиллинолеат и др.), сесквитериеноидам (а-кадинол, кариофиллен и др.). Изучен состав малолетучих соединений в составе водно-сииртового извлечения из сбора "тантон", установлено наличие веществ фенольной природы: флавонои-ды, фенолокислота. Полученные данные использованы для разработки методики стандартизации водно-сииртового экстракта "тантон".
STUDY OF THE CHEMICAL COMPOSITION OF MULTICOMPONENT VEGETABLE SPECIES "TANTON" WITH H R O M ATO G R A FIC METHODS
K.V. Parjeva, G.G. Nikolaeva, I.G. Nikolaeva, A.G. Gorshkov, A.L. Vereschagin (Institute of General and Experimental Biology, Siberian branch of Russian Academy of Sciences, g. Ulan-Ude)
It has been designed the multicomponent preparation of vegetable origin, for the reason of further standardization. The composition of the essential oil, obtained by distillations with water steam from vegetable collection "Tanton". By means of chromatographic gas analyzer there have been identified more than 40 compounds with. The method of high-performance water chromatographic analyzer there was studied water-ethanolic extract from collection: a number of compounds of phenolic nature has been revealed.
Литература
1. Зенкевич ИТ. Косман В.М. Методы количественного хроматографического анализа лекарственных веществ: Пособие для фармацевтических работников. - СПб.: С11XФА. - 1999. - 80 с.
2. Настойки, экстракты, :>ликсиры и их стандартизация / Под ред. проф. В Л. Багировой, проф. В.А. Се-верцева. - СПб.: СпецЛит, 2001. -223 с.
3. Растения для нас. Справочное издание / К.Ф. Блинова, В.В. Вандышев, М.П. Комарова и др.; Под
ред. Г.II. Яковлева и К.Ф. Блиновой. - СПб.: Учебная книга, 1996. - 654 с.
4. Ткжавкина П.А., Самылина И.А., Багирова В.Л. К вопросу методологии стандартизации жидких спиртосодержащих многокомпонентных фитопрепаратов // Первый международный съезд "Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения", 11-13 июля 1997 года: Материалы съезда. - СПб., 1997. -С.71-85.
© ДАШИНАМЖИЛОВ Ж.Б., ДИЛЬ А.А., ЛОНШАКОВА КС., НИКОЛАЕВ С.М. -
ФАРМАКОТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ФИТОСРЕДСТВА "АЛКОФОБ” ПРИ ПОВРЕЖДЕНИИ ПЕЧЕНИ ЭТАНОЛОМ
Ж. Б. Даишнамжилов, А.А. Диль, К.С. Лонишкова, С.М. Николаев.
(Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, г. Улан-Удэ, директор - проф. В.М. Кор-сунов)
Резюме. Экспериментально показано гепатозащитное и антиоксидантное действие комплексного фитосредства "алкофоб" при гепатите, вызванном этанолом. Выявлено, что курсовое введение отвара "алкофоб" ингибирует процессы перекисного окисления липидов, стимулирует желчеобразовательную и желчевыделительную функции печени, способствует активации внутриклеточных регенераторных процессов и нормализует морфофункциональное состояние печени.
Ключевые слова: фотосредство "алкофоб", гепатопротектор, желчегонное, протектор, анти-
оксидант, этаноловое повреждение печени.
Известно, что этанол существенным образом влияет на течение биохимических и биофизических процессов в организме, активно вмешивается в процессы биотрансформации эндо- и экзогенных соединений, оказывая повреждающее действие на гепатобилиарную систему [8,15]. С учетом указанного действия этилового спирта проведены исследования по определению фармакотерапевти-ческой эффективности комплексного фитосредства "алкофоб", состоящего из травы тысячелистника обыкновенного, травы чабреца, травы полыни горькой, листьев крапивы двудомной, соцветий пижмы обыкновенной и корня аира болотного, назначаемого как гепатозащитное средство при заболеваниях гепатобилиарной системы.
Задачей настоящих исследований явилось определение гепатозащитного и желчегонного действия фитосредства "алкофоб" при этаноловом повреждении печени.
Материалы и методы
Эксперименты проведены на белых крысах обоего пола с исходной массой 140-160 г. Алкогольный гепатит вызывали у животных введением в желудок 40% этилового спирта по 0,7 мл на 100 1' массы животных один раз в сутки в течение 21 дня [1,6]. Животным 1 опытной группы внут-рижелудочно вводили фитосредство "алкофоб" в виде отвара. Отвар готовили по ГФ XI [14], исходя из соотношения сырья: вода 1:10, и вводили в желудок белым крысам в объеме 1 мл на 100 г массы животных 1 раз в сутки на протяжении 21 дня. Животным 2 опытной группы по анало-
гичной схеме вводили препарат сравнения - водный раствор сиропа холосаса в объеме 0,1 мл на 100 г массы животного (доза, проявляющая оптимальный фармакотерапевтический эффект). В контроле по аналогичной схеме вводили дистиллированную воду в эквивалентном объеме. Интервалы между введениями этанола, лекарственных средств и дистиллированной воды соответствовал 6 ч. О фармакотерапевтической эффективности лекарственных средств судили по активности ферментов в сыворотке крови: аланинами-
нотрансферазы (Ал Т) и аспартатаминотрансфера-зы (АсТ), которые определяли по Райтману и Френкелю, содержанию общего билирубина - по Ендрашику-Клегорну-Грофу, р-липопротеидов -по Бурштейну и Самай, активности щелочной фосфатазы - по Боданскому, а также по показателю тимоловой пробы - по Хуэрго и Поппер [5]. Интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали по содержанию малонового диальдегида (МДА) в гомогенате печени [13]. Желчь для исследования получали в условиях острых опытов по методике Н.П. Скакуна и А.Н. Олейник [15]. Оценку желчеобразовательной и желчевыделительной функции печени проводили по скорости секреции и общему количеству выделенной желчи, концентрации желчных кислот [3], а концентрацию холестерина в желчи определяли по методу С.М. Дроговоз [2], билирубина - по методу Ван ден Берга в модификации Н.П. Скакуна [10]. Для патоморфологических исследований кусочки печени животных фиксировали в 10% раст-
