CC BY
175
МІКРОБІОЛОГІЯ
© С. И. Доан, Л. Г. Мироненко*, А. И. Савчук, Е. А. Гладкая**, Е. И. Мотыка УДК 616. 931575. 2 - 576. 16
С. И. Доан, Л. Г. Мироненко*, А. И. Савчук, Е. А. Гладкая**, Е. И. Мотыка**
ИЗУЧЕНИЕ ГЕТЕРОГЕННОСТИ ПО ПРИЗНАКУ Т0КСИН00БРА30ВАНИЯ МУЗЕЙНЫХ ШТАММОВ СОРУМЕВАСТЕРШМ 0!РНТНЕР!АЕ
ГУ «Институт эпидемиологии и инфекционных болезней им. Л. В. Громашевского НАМН Украины» (г. Киев)
*ГУ «Институт микробиологии и иммунологии им. И. И. Мечникова НАМН Украины»
(г. Харьков)
**ГУ «Львовский научно-исследовательский институт эпидемиологии и гигиены М3
Украины» (г. Львов)
Данная работа является фрагментом НИР ««Разработка методов диагностики и оценки эффективности фармакотерапии специфических и неспецифических заболеваний на основе молекулярно-генетических и биофизических технологий» (№ госрегистрации НИР 019911000262).
Вступление. Высокая изменчивость вида СогупеЬас1епит С1рИ1Иег1ае облегчает адаптацию возбудителя к постоянно меняющимся условиям существования, что определяет трудность борьбы с дифтерией в условиях массовой вакцинопрофи-лактики. На фоне напряженного популяционного иммунитета циркуляция коринебактерий дифтерии осуществляется в виде бактерионосительства с преобладанием нетоксигенных вариантов возбудителя [3]. Изучение взаимоотношений токсигенных и нетоксигенных вариантов возбудителя в динамике эпидемического процесса является одним из важных аспектов слежения за популяцией коринебактерий дифтерии [6]. Исследования показали, что в очагах дифтерии наряду с токсигенными циркулируют и нетоксигенные штаммы С. С1рИ1Иег1ае [8]. Кроме того, в литературе описаны случаи выделения нетоксигенных штаммов коринебактерий от больных с клиникой дифтерии [9, 14]. В связи с этим значительный интерес представляет изучение внутриштаммовой гетерогенности коринебактерий дифтерии по признаку токсинообразования с использованием как классических микробиологических, так и современных молекулярно-генетических методов.
Целью настоящего исследования явилось из-учение_внутриштаммовой гетерогенности музейных штаммов С. С1рИ1Иег1ае по признаку токсинообразования с применением метода иммунопреципитации в геле, а также генетической внутриштаммовой гетерогенности коринебактерий в ПЦР со специфическими и универсальным праймерами.
Объект и методы исследования. Объектом исследования были 32 штамма С. С1рИ1Ие-
riae, выделенные в разных регионах: 4 штамма - в г. Москва в 1954-1959 гг, 1 штамм - в г. Горловка Донецкой области в 1961 г., 5 штаммов - в г. Харьков в 1963 г. (3 штамма) и 1991 г. (2 штамма), 22 штамма - в Львовской области в 1986-2000 гг. Среди исследованных штаммов 14 принадлежали к варианту gravis, 17 - к варианту mitis и 1 штамм - к варианту intermedius. С целью сравнения изучался производственный штамм PW-8 и эталонный штамм NCTC 10648 gravis tox+. Коринебактерии для исследования были получены из Музея микроорганизмов ГУ «Институт микробиологии и иммунологии им. И. И. Мечникова НАМН Украины» и ГУ «Львовский научно-исследовательский институт эпидемиологии и гигиены М3 Украины».
Перед проведением ПЦР проводилась реидентификация штаммов с изучением функции токсинообразования методом иммунопреципитации в геле. Штаммы дифтерийной палочки разсевали на кровяно-телуритовом агаре таким образом, чтобы получить изолированные колонии, выдерживая их в термостате 40-48 часов. Синхронизацию культур проводили действием фактора «холодового шока». Токсинообразование, токсигенность и молекулярно-генетическое типирование изучали у 50 колоний каждого штамма. Для выделения хромосомной ДНК использовали коммерческий набор «ДНК-экспресс» фирмы «Литех» (Россия). ПЦР с парой специфических праймеров на ген дифтерийного токсина проводили при помощи коммерческой тест-системы «Ампли-Сенс» (Россия). Амплифи-цировался фрагмент ДНК молекулярной массой 360 п. н. Генотипирование проводили при помощи ПЦР с универсальным праймером № 45 (5’- GGATC-CAAAACGACGGCCAGT-3’) [2], которое заключалось в аплификации нескольких фрагментов ДНК из разных частей генома микроорганизма. ПЦР проводили в модификации Saiki et al. [17] в объеме 25 мкл на амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Россия). Использовались коммерческий ПЦР-буфер
и раствор dNTP фирмы «Ампли-Сенс» (Россия). После начальной денатурации при 92° С на протяжении 3 мин, проводили 35 циклов амплификации согласно следующим параметрам: 92° С - 50 с, 54° С - 60 с, 70° С - 60 с; заключительный синтез на протяжении 3 мин при температуре 70° С. Продукты амплификации фракционировали при помощи электрофореза в 2 % агарозном геле с добавлением 1 % раствора бромистого этидия при постоянном напряжении 180 V на протяжении 3-3,5 часов в аппарате для горизонтального гель-электрофореза “Helicon” (Россия) с последующим просмотром в ультрафиолетовом свете и фотографированием. Для оценки размеров амплифицированных фрагментов использовали маркер молекулярного веса “Bioline” (США).
Результаты исследований и их обсуждение. Результаты изучения функции токсинообразования представлены в табл.
У всех токсигенных в реакции иммунопреципитации штаммов С. diphtheriae был обнаружен А-фрагмент tox-гена. При исследовании в ПЦР с парой специфических праймеров на ген дифтерийного токсина штаммов, нетоксигенных в реакции иммунопреципитации, А-фрагмент tox-гена не определялся у 9, а остальные 8 штаммов имели в своем геноме неэкспрессирующийся ген токсигенности.
Из изученных 15 токсигенных штаммов, только 7 (46,7 %) были однородными по признаку токсинообразования. При пассажах на элективных питательных средах потеря функции токсинообразования отмечалась у 8 (53,3 %). Токсигенные в реакции иммунопреципитации производственный штамм РШ-8 и эталонный штамм ЫСТС 10648 были стойкими продуцентами токсина и при пассажах на элективных питательных средах полностью сохраняли токсинообразующую функцию. Из 8 штаммов, несуших неэкспрессирующийся 1ох-ген, функцию токсинообразования при пассажах на питательных средах восстановили часть колоний 1 (12,5%) штамма.
При изучении в ПЦР со специфическими праймерами ДНК колоний коринебактерий, полученных при пассажах на элективных питательных средах, установлено, что утрата функции токсинообразования не сопровождалась элиминацией из генома 1ох-гена. Колонии, нетоксигенные в реакции иммунопреципитации, сохраняли способность к продукции токсина и были потенциально опасными.
Согласно паспортным данным, штаммы №№ 14006, 14012, 14015, 14017, нетоксигенные в реакции иммунопреципитации, но имеющие 1ох-ген, обладали слабой гемолитической активностью в отношении эритроцитов человека и кролика и при введении морским свинкам 100 и 500 млн живых
Таблица
Результаты изучения гетерогенности штаммов C. diphtheriae по признаку
токсинообразования
№ п/п BuoBap № в коллекции Год выделения Регион Токсино-образование в Flec-тесте Токсиген-ность по данным ПІ ІР Удельный вес нетоксигенных колоний, %
1 mitis 14006 1955 Москва tox- tox+ 100
2 intermedius 14012 1955 Москва tox- tox+ 100
3 mitis 14015 1954 Москва tox- tox+ 100
4 mitis 14017 1956 Москва tox- tox+ 100
S gravis 14081 1961 Горловка tox- tox- 100
б gravis 1409? 1963 Харьков tox+ tox+ 0
7 gravis 14093 1963 Харьков tox+ tox+ 8,0
В gravis 14094 1963 Харьков tox+ tox+ 14,0
9 gravis 14065 1991 Харьков tox+ tox+ 10,0
10 mitis 14068 1991 Харьков tox- tox+ 100
11 PW-8 14001 производ- ственный штамм tox+ tox+ 0
12 mitis 23 1986 Львов tox+ tox+ 18,0
13 mitis 24 1987 Львов tox- tox+ 100
14 mitis 25 1989 Львов tox+ tox+ 0
1S mitis 26 1989 Львов tox+ tox+ 22,0
1б gravis 29 1989 Львов tox- tox- 100
17 mitis 32 1992 Львов tox- tox- 100
1В mitis 38 1992 Львов tox- tox+ 100
19 mitis 41 1992 Львов tox- tox+ 100
20 gravis 61 1993 Львов tox+ tox+ 0
21 gravis 77 1994 Львов tox+ tox+ 16,0
22 gravis 80 1994 Львов tox+ tox+ 16,0
23 gravis 126 1995 Львов tox+ tox+ 20,0
24 gravis 280 2000 Львов tox+ tox+ 0
2S mitis 281 2000 Львов tox- tox- 100
2б mitis 282 2000 Львов tox- tox- 100
27 mitis 283 2000 Львов tox- tox- 100
2В gravis 284 2000 Львов tox- tox- 100
29 mitis 270 2000 Львов tox+ tox+ 14,0
30 gravis 272 2000 Львов tox+ tox+ 0
31 gravis 273 2000 Львов tox+ tox+ 0
32 mitis 277 2000 Львов tox- tox- 100
33 mitis 279 2000 Львов tox- tox- 100
34 NCTC 10648 1 эталонный штамм tox+ tox+ 0
Рис. 1. Электрофореграмма продуктов асплиыикации ДНК колоний штамма С. diphtheriae gravis tox + 126
Дорожки 2-б, В-12 С. diphtheriae gravis tox + 12б; Дорожка 1,7,13 - маркер молекулярного веса.
Рис. 2. Электрофореграмма продуктов асплиыикации ДНК колоний штамма С. diphtheriae gravis tox + № 14093
Дорожки 2-11 С. diphtheriae gravis tox + № 14093 Дорожка 1,12 - маркер молекулярного веса.
Рис 3. Электрофореграмма продуктов амплификации ДНК колоний штамма C. diphtheriae gravis tox - № 14081 Дорожки 1-10 C. diphtheriae gravis tox - № 14081;
Дорожка 11 - маркер молекулярного веса.
Дорожка 11 - маркер молекулярного веса.
микробных тел реакции и смерти лабораторных животных не наблюдалось. То есть при пассажах на животных функция токсиноо-бразования у этих штаммов не восстанавливалась, несмотря на наличие гена токсиген-ности. Так как проба на животных является наиболее достоверным тестом для определения токсинообразования, можно предположить, что эти штаммы не способны синтезировать токсин и, следовательно, вызывать заболевание.
По данным российских исследователей 13,8 % нетоксигенных штаммов C. diphtheriae, обладающих геном дифтерийного токсина, не способны к синтезу последнего, вследствие мутации; все они принадлежали к биовару mitis [10]. Факты обнаружения дифтерийного токсина у штаммов, ранее считавшихся нетоксигенными, объясняется тем, что такие штаммы обладают сниженной или отсроченной продукцией токсина, способной восстанавливаться после культивирования на «обогащенных» средах или пассирования через организм животного [5, 11]. Непостоянная продукция токсина может быть связана как с условиями среды обитания (например, уровнем содержания железа в питательных средах) [1], так и с явлениями полилизогении, когда вследствие заражения бактериальной клетки несколькими умеренными фагами продукция токсина блокируется [13].
При изучении штаммов в ПЦР с универсальным праймером установлено, что колонии 24 штаммов имели полностью идентичные профили продуктов амплификации (рис. 1). У остальных 8 штаммов профили ампликонов исследуемых колоний отличались по количеству фрагментов, то есть имел место ПЦР-полиморфизм. Отмечалось появление дополнительных низкомолекулярных фрагментов массой 350, 300, 250 п. н. (рис. 2), реже - исчезновение высокомолекулярных фрагментов (рис. 3). Число колоний одного штамма с признаками ПЦР-полиморфизма могло варьировать от одного - двух до десятка. Вариант gravis отличался большей генетической стабильностью, чем вариант mitis. Также генетически гомогенными были колонии производственного штамма PW-8 и эталонного NCTC 10648.
Описанные изменения, возможно, связаны с феноменом спонтанной генной конверсии [7], зависящей от условий клеточного метаболизма. Процесс генетической рекомбинации обеспечивает основу генетической изменчивости и лекарственной устойчивости многих микроорганизмов [15, 16], направленных на самосохранение и самовоспроизведение популяции.
Таким образом, возбудитель дифтерии обладает выраженной внутриштаммовой
гетерогенностью, свидетельствующей о его высо- по признаку токсинообразования, которая заключа-
ких адаптационных возможностях. Утрата функции ется в угнетении функции без элиминации из гено-
токсиноообразования при сохранении ее генети- магена токсигенности.
ческой детерминанты можно рассматривать как 2. Фено- и генотипическая изменчивость возбу-
адаптационный механизм в ответ на изменяющи- дителя создают широкие адаптационные возмож-
еся условия существования. Циркуляция нетокси- ности для изменяющихся условий существования,
генных вариантов C. diphtheriae на фоне высокого обеспечивая приспособление популяции к различ-
уровня популяционного антитоксического иммуни- ным условиям среды обитания.
тета является оптимальным способом сохранения Перспективы дальнейших исследований.
возбудителя как вида, так как гибели хозяина при Планируется продолжение исследований по изуче-
бактериосительстве и легких формах дифтерии не нию генетического разнообразия коринебактерий
происходит и это «выгодно» возбудителю в силу со- дифтерии, циркулирующих на территории Украины,
хранения паразитарной системы [12]. и изучение корреляции биохимических, токсиген-
Выводы. ных свойств и молекулярно-генетических характе-
1. У токсигенных штаммов коринебактерий диф- ристик возбудителя с клиническими проявлениями
терии отмечается внутриштаммовая гетерогенность заболевания.
Литература
1. 1. Гаврилова Н. А. Влияние лизогенной конверсии нетоксиганного штамма и спектр кпеточніх белков / Н. А. Гаврилова, И. М. Грубер, Т. Н. Филатова // Журн. микробиол. - 2001-№ 4 - С. 74 - 7б
2. Генетическое типирование штаммов Corynebacterium diphtheriae методом полимеразной цепной реакции с универсальными праймерами / И. В. Мокроусов, О. В. Нарвская, Г. Я. Ценева // Журн. микробиологии. - 199б - № S. -С.73-7S.
3. Гладка О. А. Епідеміологічні аспекти носійства збудника дифтерії в пост епідемічний період / О. А. Гладка // Профілактична медицина - 200В, № 1. - С. 24-2В
4. Комбарова С. Ю. Микробиологический и молекулярно-генетический мониторинг возбудителя дифтерийной инфекции: автореф. дис. . . . докт. мед. наук 03. 00. 07 / Комбарова Светлана Юрьевна - М., 2007. - 3б с.
5. Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции / И. К. Мазурова, В. Г. Мельников, С. Ю. Комбарова [и др] // Метод. Рекомендации МУ 4. 2. б9В-9В, Минздрав РФ, 199В - 72 с.
6. Мироненко Л. Г. Популяційна характеристика коринебактерій дифтерії, циркулюючих в періоди різної інтенсивності епідемічного процесу: автореф. дис. ...канд. мед. наук: 03. 00. 07 / Мироненко Людмила Григорівна. - Харків, 199В-1В с.
7. Николаевский В. В. Фармакогенетические особенности изменчивости возбудителя дифтерии: дис. .канд. биол. наук 14. 03. 0S / Николаевский Владислав Владленович - Одесса, 199 В - 140 с.
В. Новий погляд на нетоксигенне носійство у вогнищах дифтерії / О. А. Гладка, О. П. Загарян, М. Б. Пурська, О. I. Мотика // Матеріали XIII з’їзду українського наукового товариства епідеміологів та паразитологів - Київ-Вінниця, 199б. -С. 9S - 9б.
9. Печінка А. М. Токсигенність коринебактерій дифтерії та клінічні прояви дифтерійної інфекції: автореф. дис. .канд. мед. наук:14. 01. 12 / Печінка Анатолій Михайлович - Київ, 1999. - 23 с.
10. Характеристика нетоксигенных штаммов Corynebacterium diphtheriae, несущих ген дифтерийного токсина / В. Г. Мельников, С. Ю. Комбарова, О. Ю. Борисова, Н. В. Волжанцев [и др] // Журн. микробиол. - 2004 - № 1 - С. 3 - 7.
11. Ценева Г. Я. Применение полимеразной цепной реакции в диагностике дифтерийной инфекции / Г. Я. Ценева, Е. Е. Щедеркина // Журн. микробиол. - 2000 - № S - С. 72 - 74.
12. Черкасский Б. Л. Системный подход в эпидемиологии / Б. Л. Черкасский. - М.: Медицина, 19ВВ. - 2В5 с.
13. Чистякова И. В. Лизогенная и фаговая конверсия токсигенности у Corynebacterium diphtheriae: автореф. дис. ... докт. мед. наук: 03. 00. 07 / Чистякова Инна Васильевна - Ростов-на-Дону, 1972 - 32 с.
14. Шестакова И. В. Может ли выделение нетоксигенных штаммов служить основанием для постановки диагноза дифтерии? / И. В. Шестакова // Лікарська справа. - 1993 - № 1 - С. 117 - 119.
15. Efficient and Optimized PCR Method with High Fidelity for Site-directed Mutagenesis / Q. Liang, L. Chen, A. Fulko [et al] //
PCR Methods and Appl. - 199S - V. 4 - № 4 - P. 2б9 - 273
16. Improved Heteroduplex Detection of Single-base Substitutions in PCR-amplified DNA / A. Peeters, Kotze M. [et al] // PCR Methods and Appl. - 1994 - V. 3 - № 4 - P. 1ВВ - 190
17. Primer-detected enzymatic amplification of DNA with a termostable DNA polymerase / R. K. Saiki, D. N. Gelfend, S. Stoffel et al. // Science. - 19ВВ. - Vol. 239. - P. 4В7-491.
УДК 616. 931575. 2 - 576. 16
ИЗУЧЕНИЕ ГЕТЕРОГЕННОСТИ ПО ПРИЗНАКУ ТОКСИНООБРАЗОВАНИЯ МУЗЕЙНЫХ ШТАММОВ СОРУЫЕВАСТЕЯШМ ОІРНТНЕЯІАЕ
Доан С. И., Мироненко Л. Г., Савчук А. И, Гладкая Е. А., Мотыка Е. И.
Резюме. Дана оценка гетерогенности на внутриштаммовом уровне по признаку токсинообразования 34 музейных штаммов коринебактерий дифтерии. Установлено, что утрата функции токсинообразования при пассажах на питательных средах не сопровождалась элиминацией гена токсигенности из генома.
Генотипирование с использованием ПЦР с универсальным праймером выявило значительную внутриштаммовую гетерогенность у В исследуемых штаммов, что свидетельствовало о значительной генетической неоднородности циркулирующих C. diphtheriae и, возможно, о существовании спонтанной генной конверсии.
Ключевые слова: Corynebacterium diphtheriae, внутриштаммовая гетерогенность, ПЦР со специфическими и универсальными праймерами.
УДК б1б. 931575. 2 - 57б. 1б
ВИВЧЕННЯ ГЕТЕРОГЕННОСТІ ЗА ОЗНАКОЮ ТОКСИНОУТВОРЕННЯ МУЗЕЙНИХ ШТАМІВ CORYNE-BACTERIUM DIPHTHERIAE
Доан С. І., Мироненко Л. Г., Савчук А. І., Гладка О. А., Мотика О. І.
Резюме. Дана оцінка гетерогенності на внутрішньоштамовому рівні за ознакою токсиноутворення 34 музейних штамів коринебактерій дифтерії. Встановлено, що втрата функції токсиноутворення при пассажах на живильному середовищі не супроводжувалась елімінацією гена токсигенності із генома. Застосування ПЛР з універсальним праймером виявило значну внутрішньоштамову гетерогенність у В досліджуваних штамів, що свідчить про значну генетичну неоднорідність циркулюючих C. diphtheriae та, можливо, про існування спонтанної генної конверсії.
Ключові слова: Corynebacterium diphtheriae, внутрішньоштамова гетерогенність, ПЛР із специфічними та універсальними праймерами.
UDC б1б. 931575. 2 - 57б. 1б
Investigation of the Heterogeneity of the Toxigenic Signs on the Inside Straining Level of C. diphtheriae Museum Strains
Doan S. I., Mironenko L. G., Savchuk A. I., Hladka O. A., Motyka O. I.
Summary. The heterogeneity of toxigenic signs on the inside straining level of 32 museum strains of C. diphtheriae have been studied by Flec-test and PCR with the pair of specific primers for tox-gene. Four strains were isolated in Moscow in 1954-1959, one strain was isolated in Horlovka of the Donetsk region in 19б1, other 5 strains - in Kharkiw in 19б3 (3 strains) and in 1991 (2 strains), and 22 strains - in Lviv region in 19Вб - 2000. Fourteen strains belong to gravis variant, 17 strains to mitis variant and one strain - intermedius variant. The PW-В industrial strain and NCTC 10б4В gravis tox+ standart strain have been studied as well the purpose of comparison. Fifteen strains were toxigenic and 17 strains were non-toxigenic. The В non-toxigenic strains contain non-expression tox-gene.
The strains for investigation were received from 2 sources: 1) the Museum of Microorganisms (State Institution) belonging to the I. I. Mechnikov Microbiological and Immunological Institute of the NAMSciences of Ukraine and 2) Lviv Research Institute of Fpidemiology and Hygiene belonging to the Ministry of Health of Ukraine.
Before PCR test we have reindentified the strains with the aim of stydying the toxin formation using Flec-test. The strains of C. diphtheriae have been replated in selective medium so as to have isolated colonies in a thermostate for 40-4В hrs. Synchronization of cultures has been achieved by means of “cold shock”. Toxin formation, toxinogenicity and molecular genetic typing has been studied in 50 colonies of each strain. A commercial kit “DNA- express” (“Lytex”, Russia) has been used to express the chromosomal DNA.
PCR with 2 specific primers for the gene of diphtheria toxin has been conducted using a commercial test system manufactured by “Amply-Sens” (Russia). A DNA-fragment has been amplified by 3б0 nucleotide pairs. Genotyping has been performed by PCR with arbitrary primer № 45 (5’- GGATCCAAAACGACGGCCAGT-3’) (Mokrousov I. V et al, 199б) (random amplification of polymorphic DNA PCR). PCR has been performed by Saiki et al. (19ВВ) modification method, volume 25 mcl. Amplification has been conducted in the following parameters: t° 92°C for 3 mins, then 35 cycles at 92°C for 50 secs, 54°C for б0 secs, and 70°C for б0 secs, synthesis at 70°C for 3 mins. The obtained material has undergone by electrophoresis in a 2 % agarose gel with 1 % solution ethidium bromide with DC of 1В0 V for 3 - 3,5 hrs in a horizontal electrophoresis device.
Only 7 (4б,7 %) toxigenic strains were stable as to the toxigenic signs. Other В (53,3%) strains lost their toxigenic function in the replating on the elective mediums. One in eight non - toxigenic strains with tox-gene had toxigenic function.
It was determined that loss of toxigenic signs was not accompanied by a loss tox-gene by PCR with the pair of specific primers. These strains can restore toxigenic signs and cause disease.
The inside straining level heterogeneity was determined due to genotyping by PCR with the arbitrary primers (random amplification of polymorphic DNA PCR). It has been found that В C. diphtheriae strains have genetic polymorphism. Probably, spontaneous genic conversion occurs.
Key words: Corynebacterium diphtheriae, heterogeneity, toxinogenicity, inside straining level, PCR, specific and arbitrary primers (random amplification of polymorphic DNA PCR).
Рецензент - проф. Гайдей В. P.
Стаття надійшла 10. 06. 2013 р.
