CC BY
58Птицеводство
_ www.agroyug.ru
DOI: 10.24411/9999-007А-2020-10021 УДК: 619:579.62:579.833.1:575.174.4
Семина А.Н., Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства -
филиал ФНЦ «ВНИТИП» РАН (ВНИВИП), кандидат ветеринарных наук,
anna14.05@mail.ru
ИЗУЧЕНИЕ ГЕНОМА PASTEURELLA MULTOCIDA ДЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ В ПТИЦЕВОДСТВЕ
142
Аннотация. Такое заболевание как пастерел-лез продолжает оставаться одной из актуальных проблем продуктивного птицеводства. За частую это связано с молниеносным течением инфекции, что приводит к затруднению прижизненной диагностики пастереллеза. Целью нашей работы явилось изучение вопроса патогенности возбудителя P. multocida для дальнейшего усовершенствования и разработки более чувствительных и специфичных методов лабораторной диагностики, c использованием компьютерно-моделированных и синтезированных специфических праймеров.
Ключевые слова: пастереллёз, птица, белки, гены, диагностика.
Annotation. Such a disease as pasteurellosis continues to be one of the most pressing problems of productive poultry farming. This is often associated with a lightning-fast course of infection, which leads to difficulties in the lifetime diagnosis of pasteurellosis. The purpose of our work was to study the pathogenicity of the pathogen P. multocida for further improvement and development of more sensitive and specific methods of laboratory diagnostics, using computer-simulated and synthesized specific primers.
Key words: pasteurellosis, poultry, proteins, genes, diagnostics.
Возбудитель Р. multocida обладает достаточно высокими патогенными свойствами, которые способны вызывать инфекционные процессы у разных видов животных и птиц. Р. multocida присуще большое разнообразие факторов вирулентности из которых наиболее значимыми являются полисахариды капсулы, эндотоксины или липополисахариды, белки внешней мембраны, фимбрии и адгезины, экзотоксины, внеклеточные ферменты (липаза, гиалуронидаза) и др. [1].
Геном Pasteurella multocida (Рт70) - одинарная циркулярная хромосома, состоит из 2257487 пар оснований в длину, содержит 2014 потенциально кодирующих регионов, размером, в среднем, 998 п.о., которые составляют 89 % от всей хромосомы. Оставшиеся 11% последовательностей - 6 полных рРНК оперонов (16S-23S-5S); 57 тРНК генов представляют все 20 аминокислот и сравнительно
небольшое количество не кодирующих элементов. 26% кодирующих последовательностей белков с неизвестными функциями большей частью идентичны последовательностям белков, расшифрованным в других полных микробиологических геномах. В геноме Pasteurella multocida содержатся многие метаболические процессы ферментов, таких как цикл глюколизиса, глюконеогенезиса и трихлорацетило-вой кислоты [2].
После определения и анализа полной нуклео-тидной последовательности генома Р. multocida выявлено 104 гена, ассоциированных с вероятными факторами вирулентности данного микроорганизма, что составляет около 7% от всего генома Р. multocida. Данные гены осуществляют разнообразные функции: прилипание и проникновение в клетку хозяина, усвоение железа, бета-цилиндрические белки наружной мембраны, сиалидаза,
ЭФФЕКТИВНОЕ № 4 июнь ЖИВОТНОВОДСТВО 2020
супероксиддисмутазы, образование дерманекро-токсина и гиалуронидаза. Наличие капсулы является одним из факторов вирулентности. По капсуль-ному антигену пастереллы разделены на четыре серологические группы А, В, Д и Е. Отмечено, что чаще всего пастереллез у птиц вызывает типа А. К Pasteurella multocida относится более чем 16 се-роваров, многие из которых вызывают заболевания только у определенного вида животного или птицы. Так, например, серовары А:1 и А:3 - являются основными возбудителями пастереллеза птиц [3].
Совокупность генов этого вида пастерелл показаны одиночной циркулярной хромосомой длиной 2.257.487 пар нуклеотидов и содержит 2.014 кодирующих 4 регионов, средний размер которых 998 п.н. (в сумме 89% всей хромосомы). Оставшиеся 11% генома представлены шестью оперонами рибосо-мальной РНК (16S-23S-5S) и 57 генами тРНК, представляющими все 20 аминокислот, и относительно небольшим количеством не кодирующих элементов [4]. Сравнительный анализ первичной структуры микроорганизма выявил присутствие более двухсот кодирующих участков (11%), исключительных для этого вида Р. multocida. Проведение исследования генетической системы биосинтетического локуса капсулы были обнаружены зоны генома, отмеченные в настоящее время как гены hyaD, bcbD, dcbF, ecbJ и fcbD, высоко специфичные для любой из 5 серогрупп (А, В, D, Е и F) Р. multocida и ассоциированные с синтезом характерного для каждой серо-группы капсульного вещества, что обеспечивает генетическую основу для серологической дифференциации штаммов микроорганизма [5].
На рисунке 1 изображено циклическое представление генома Pasteurella multocida (Рт70), на котором по внешнему кругу расположены пары базовых нуклеотидов. Наружные стрелки ориентируют на 57 оперонов tRNA, а внутренние стрелы показывают 6 оперонов rRNA (16S-23S-5S). В центральном круге представлено процентное соотношение пары ГЦ к паре АТ: наиболее яркий розоватый фрагмент предполагает собою соответствие ГЦ вплоть до 26-31% в то время как самый темный фрагмент обозначает 44-51%. Данные были получены в базе genescene программного обеспечения (DNAstar).
Пастереллез встречается повсюду, однако больше фиксируется в странах с тропическим и субтропическим климатом. Диагноз пастереллеза ставится комплексно, с учетом данных эпизоотологии, клинической картины заболевания, данных патолого-анатомических изменений и бактериологического исследования. Любой из способов диагностики обладает значимостью только вместе с остальными методами диагностики с обязательным учетом результатов патологоморфологических и лабораторных исследований. С целью бактериологического изучения в лабораторию посылают отдельные органы. Получение культуры пастерелл путем бактериологического исследования без учета результатов, полученных другими диагностическими методами, также не дает оснований для постановки диагноза на это заболевание, так как при пастерел-лезе наблюдается широкое бактерионосительство как среди переболевших, так и среди клинически здоровых животных, контактировавших, иногда и
неконтактировавших с животными неблагополучных хозяйств. Совокупность сведений по эпизоотологии, клинической и патологоанатомической картине дает право на постановку предварительного диагноза, результаты же бактериологических и биологических исследований позволяют поставить диагноз окончательно.
ПЦР-диагностирование дает возможность устанавливать напрямую возбудителя болезни. Значительная особенность метода ПЦР определена тем, что в исследуемом материале обнаруживается оригинальный, типичный только лишь для данного возбудителя участок ДНК. Существенная чувствительность данного метода дает возможность обнаруживать даже незначительное количество микроорганизмов. Так же одним из преимущества этого метода является его достаточно быстрая скорость в получении результатов исследования, что позволяет в свою очередь выявлять и диагностировать бактерионосительство.
Анализ проведенных исследований учеными разных стран показывает, что молекулярные методы выявления и типирования Pasteurella multocida превосходят обычные методы в случае необходимости быстрых эпизоотологических исследований геморрагической септицемии и могут использоваться в эпизоотологических исследованиях как программа мониторинга.
Сопоставляя молекулярно-биологические методы генотипирования на основе ПЦР методам классическим можно отметить, что данные метод отличается универсальностью, наиболее полной степенью дифференциации, перспективой применения количественных способов с целью оценки идентичности штаммов также существенной воспроизводимостью.
Анализируя литературные данные по изучению генома Pasteurella multocida можно отметить следующие гены для дальнейшего изучения: ген папН, гены lpp\-5 (pip А-Е), локус генов cap, гены IpsA и galE. Последующие исследования этих генов позволят получит специфические праймеры для амплификации участка геномной ДНК возбудителя пастереллеза птиц.
Статья написана по госзаданию 0599-2019-0025
ЛИТЕРАТУРА
1. Новикова О.Б. Актуальные и новые болезни птиц бактериальной этиологии / Новикова О.Б., Павлова М.А. // Актуальные вопросы сельскохозяйственной биологии. - 2017. - № 4 (6). - С. 40-44.
2. Чужебаева Г.Д. Диагностика пастереллеза крупного рогатого скота методом ПЦР / Монография Г. Д. Чужебаевой // Костанай:Костанайский государственный университет имени Ахмета Байтурсыно-ва. - 2017. - 106с.
3. Peng 2, Liang W., Wang Y. et al. Experimental pathogenicity and complete genome characterization of a pig origin Pasteurella multocida serogroup F isolate HN07 // Vet. Microbiol. - 2017. - Vol. 198. - P. 23-33.
4. Adhikary S., Bisgaard M., Foster G. et al. Comparative study of PCR methods to detect Pasteurella multocida // Berl. Munch. Tierarztl. Woch-enschr. - 2013. - Vol. 126.
- P. 415422.
5. Wilkie I.W., Harper M., Boyce J.D., Adler B. Pasteurella multocida: diseases and pathogenesis // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2012. - Vol. 361. - P. 1-22.
