CC BY
7УДК 577.21;601;633:631.52
О.А. Межнина, О.Ю. Урбанович
ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ЗЕМЛЯНИКИ САДОВОЙ (FRAGARIA ANANASSA), ВЫРАЩИВАЕМОЙ В РЕСПУБЛИКЕ БЕЛАРУСЬ
Институт генетики и цитологии НАН Беларуси Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Введение
Земляника (Fragaria L.) - род многолетних травянистых растений семейства розовых (Ro-saceae Juss., надпорядок Rosanae). Род Fragaria L. включает в себя 25 видов, различающихся по уровню плоидности: 13 диплоидов, 5 тетра-плоидов, 1 гексаплоид, 4 октоплоида и 1 дека-плоид [1]. Самым распространенным культивируемым видом является земляника садовая (Fragaria х ananassa), относящаяся к окто-плоидам (2n=8x=56). Размер ее генома составляет 708-720 Mb [2]. По данным ФАО, мировое производство земляники садовой за последние годы увеличилось и составляет более 59% валового производства всех ягод. Интенсификация ягодоводства требует использования новых сортов, отвечающих возрастающим современным требованиям, среди которых скороплодность и высокая урожайность, отзывчивость на агротехнику, устойчивость к вредителям и болезням, пригодность для механизированного возделывания и уборки урожая, высокие товарные и технологические качества ягод. Для успешной реализации селекционных программ большое значение имеет идентификация генотипов как сортов, так и гибридов и исходных форм. Сорта земляники имеют значительное внешнее сходство, что затрудняет их идентификацию по фенотипическим признакам. В связи с этим все большее значение приобретает разработка эффективных и надежных методов оценки генетического разнообразия сортов с использованием молекулярных маркеров.
Для изучения генетического разнообразия земляники садовой исследователями разных стран были предложены несколько вариантов молекулярных маркеров: RAPD [3, 4, 5], AFLP [6], ISSR [7]. В 2000 году на основе данных, полученных с помощью RAPD-анализа, в суде была подтверждена сортовая принадлежность
линий земляники садовой и защищены права селекционеров [8]. Однако каждая из этих систем имеет определенные проблемы с воспроизводимостью в различных лабораториях. Этого недостатка лишены SSR-маркеры. Результаты, полученные с их помощью, легко интерпретируются и воспроизводятся. Помимо этого, микросателлитные маркеры наследуются по кодоминантному принципу, и поэтому получили широкое применение для картирования генома и анализа генетической структуры популяции [9]. Первые работы в данном направлении проводились Sargent с сотрудниками, которые в 2003 году разработали и охарактеризовали набор SSR-маркеров для Fragaria viridis, диплоидного представителя рода Fragaria L. [10]. Позже эта же группа исследователей разработала генетическую карту для межвидового гибрида от скрещивания F. vesca х F. nubicola. В данном исследовании было картировано 78 маркеров, среди которых 68 SSR-маркеров [11].
В 2008 году Govan с сотрудниками разработали сет из 10 пар SSR-маркеров, характеризующихся высокой воспроизводимостью и информативностью. В исследовании этих авторов было охарактеризовано 60 различных генотипов земляники садовой селекции США, Канады, Японии, Германии, Англии и других европейских стран [12]. Дальнейшее изучение Brünings с сотрудниками генетического разнообразия элитных линий земляники садовой с использованием данного набора маркеров показало значительное снижение аллельного разнообразия селекционных линий по сравнению с родительскими формами [13]. В 2009 году Gil-Ariza с сотрудниками исследовали 92 сорта земляники садовой и показали, что сорта земляники, культивируемые в промышленных масштабах, обладают значительным генетическим сходством. Несмотря
на это, данный метод позволил достоверно различить каждый сорт, а также выявить 3 основные группы в рамках исследуемой выборки [14].
В последние годы в мировом научном сообществе активно ведутся работы, направленные на изучение генетического разнообразия земляники садовой, а также поиск ген-ассоциированных маркеров для селекции по хозяйственно-ценным признакам.
Однако к настоящему времени не существует универсальной методики ДНК-идентификации земляники садовой, на молекулярном уровне изучено ограниченное количество сортов. Сорта белорусской селекции остаются неисследованными. Не изучено, каким генетическим потенциалом они обладают, и какие наборы маркеров эффективны для их идентификации. В связи с этим данное исследование направлено на изучение генетического потенциала сортов земляники садовой, культивируемых в Республике Беларусь.
Материалы и методы
Объектом исследования служили сорта земляники садовой, возделываемой в Республике Беларусь. Материал предоставлен РУП «Институт плодоводства» (пос. Само-хваловичи). Выделение тотальной ДНК из фрагмента листа отдельного растения осуществляли с помощью набора Genomic DNA Purification Kit (Thermo Scientific, ЕС) согласно методике производителя. Для анализа полиморфизма по SSR-маркерам использовали
мультиплексную ПЦР, позволяющую проводить реакцию одновременно для 4 пар праймеров в одной микропробирке. Каждая пара имела специфическую флуоресцентную метку (FAM, R6G, TAMRA, ROX). В исследовании использовали SSR-маркеры, специфичные для геномов F. vesca [15] и F. nu-bicola [11]. Названия праймеров приведены в табл. 1. Праймеры синтезированы компанией Праймтех (Беларусь).
Состав реакционной смеси, конечным объемом 20 мкл, был следующий: 1хШЦР буфер с (NH4)2SO4, 1,5 мМ MgCl2 200 мкМ смеси dNTP, по 0,2 мкМ каждого из праймеров, 2050 нг ДНК и 1 ед. Taq-полимеразы (Thermo scientific, EC). Реакцию ПЦР проводили по следующей программе: 1 цикл продолжительностью 4 мин при 94 °С; 40 циклов, включающих: 40 с при 94 °С, 1 мин при 58 °С, 1 мин при 72 °С; заключительная элонгация - 7 мин при 72 °С.
Разделение фрагментов ПЦР выполняли на автоматическом секвенаторе 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Размер фрагментов рассчитывали с помощью компьютерной программы GeneMapper® Software v4.1 относительно стандартных образцов ДНК известной длины. В качестве стандарта молекулярного веса использовали внутренний стандарт S450 (Синтол, Россия).
Дискриминационная сила маркера (PD -Power of Discrimination) была рассчитана по формуле:
Таблица 1
Локус Последовательность праймера Повторяющийся мотив Число аллелей Размер фрагментов, п.н.
FG7ab F GCAGTGCTACATCGACTCAGGTCCAA R ACCAAGGAAGTGCCGAAGTGGGTTT TCAAATAG 7 136-181
FG7cd F AGGTGTCCAAAGAGGGTTGCTGTAGA R TCCCTCTCCCAATAACCCTTTGCTTC TAGGGA 8 228-312
FG2ab F TGAACTGGTCCATCGGTGCTGAAA R TGATCACACAATACGCATTACCAAGCCT TATG 9 316-374
UFFa3-D11 F GCCTTGATGTCTCGTTGAGTAG R TACCTTCTGCATTCACCATGAC AGA 12 181-219
EMFn002 F GGAACCCCAAATACCAACTTT R AAAGCCTGAAGTTGTTCAATAAA AC 1 247
EMFn017 F TTTTCAAATTGTTACCCCATCC R CTAAAAATCCCCCAAATTGTGA TC - -
Нуклеотидные последовательности праймеров, длина и количество аллелей
SSR-локусов в геноме Fragaria
PD = 1 - Шг)2,
где g. - частота встречаемости ього генотипа [16].
Дендрограмма генетического сходства сортов земляники садовой была получена с помощью программы Тгеесоп методом UPGMA, основываясь на коэффициенте генетического сходства Nei и Li [17, 18].
Результаты и обсуждение
Для анализа генетического разнообразия земляники садовой, выращиваемой в Республике Беларусь, была сформирована коллекция образцов, включающая различные сорта. В ней представлены как сорта белорусской селекции, так и сорта селекции России, Германии, Польши и других стран.
Для оценки генетического разнообразия 49 сортов земляники садовой было использовано 6 SSR-маркеров. Количество и длина аллелей, определенных в результате SSR-анализа, представлены в табл. 2. Как видно из таблицы, не все рассматриваемые локусы оказались полиморфны.
Так, в локусе EMFn002 выявлен только один аллель длиной 247 п.н. При анализе локуса EMFn017 не удалось получить четкие воспроизводимые результаты. При разделении продуктов амплификации с данным маркером на автоматическом секвенаторе было выявлено большее число аллелей, чем количество возможных вариантов для окто-плоидных организмов. Вероятно, это связано с тем, что для данного маркера выбран динуклеотидный повтор (ТС), что затрудняет интерпретацию результатов, особенно у полиплоидов. Данные маркеры были исключены из дальнейшего исследования.
Маркеры FG7ab, FG7cd, FG2ab и UFFa3-D11 показали стабильно воспроизводимые результаты. При этом количество аллелей, идентифицированных у сортов К ananassa в каждом локусе, различалось. Наименее полиморфным оказался локус FG7ab. Количество обнаруженных в нем аллелей составило 7. В локусах FG7cd и FG2ab выявлено 8 и 9 аллелей соответственно. Наибольшее количество аллелей (12) было выявлено в локусе UFFa3-D11.
Частота распространения аллелей в локусах была разная. Диаграмма распределения частот встречаемости аллелей в отдельных локусах представлена на рис. 1. Так, в локусе FG7ab аллель 136 п.н. встречался у всех проанализированных образцов. С высокой частотой встречался аллель 148 п.н. (0,8). Частота встречаемости других аллелей составляла от 0,04 до 0,59.
В локусе FG7cd 2 аллеля - 240 п.н. и 249 п.н. - встречались с частотой 0,96 и 0,98 соответственно. Аллель 258 п.н. встречался с частотой 0,78. Наиболее редким явился аллель 299 п.н. (0,06). В локусе FG2ab с наибольшей частотой (0,98) встречались 2 ал-леля - 316 п.н. и 334 п.н. Аллели 322 п.н., 342 п.н. и 328 п.н. встречались с частотой 0,76, 0,9 и 0,57 соответственно. В данном локусе также выявлен редкий аллель 374 п.н., встречающийся с частотой 0,02. В локусе UFFa3-D11 аллель 193 п.н. встречался с частотой 0,96. Частота встречаемости аллелей 199 п.н., 205 п.н., 196 п.н., 211 п.н., 181 п.н. также была достаточно высокой и составила 0,9, 0,86, 0,84, 0,63 и 0,67 соответственно. Аллели 186 п.н. (0,25) и 215 п.н. (0,53) встречались реже. Редко встречались аллели 201 п.н. (0,06) и 217 п.н. (0,02).
Таблица 2
Количество и длина SSR-аллелей в геноме Fragaria х ananassa
Праймер Детектируемые ББК-аллели в геноме земляники садовой, п.н.
EMFn002 247
EMFn017 -
FG7ab 136, 148, 155, 164, 166, 173, 181
FG7cd 228, 240, 249, 257, 270, 294, 299, 312
FG2ab 316, 320, 322, 328, 334, 338, 342, 362, 374
UFFa3-D11 181, 186, 193, 196, 199, 201, 205, 207, 211, 215, 217, 219
Рис. 1. Диаграмма распределения частот встречаемости аллелей в исследованных локусах
Частота встречаемости аллелей в локусе FG7ab
155 164 Длина я
Частота встречаемости аллелей в локусе FG7cd
А __ ¿=D
—
— —
у — —
\ т \ Й п
я Я U г* CL
229 240 249 257 ЭН 299 312
Длина агшелей. п.н.
Частота встречаемости аллелей в локусе FG2ab
Частота встречаемости аллелей в локусе UFFa3-D11
и
_ _
=п= — — тг -О-^г
0.9
о.в 0.7 0.6 0.6 0.4 0,3 0,2 0.1 о
- г
Ii
ít -_ -а-.
Длина аллегмй, п.н.
191 1» 193 1» i» 201 205 207
Длина аллелей, п.н.
215 217 215
В связи с тем, что земляника садовая является октоплоидом, при исследовании ее генома нельзя использовать ряд показателей, успешно применяемых для характеристики диплоидных видов. Поэтому в представленном исследовании каждый маркер был оценен с помощью такого показателя, как дискриминационная сила маркера (PD). Значение PD, рассчитанное для каждого локуса, колебалось от 0,77 для локуса FG7ab до 0,87 для локуса UFFa3-D11. Среднее значение PD для 4 SSR-локусов составило 0,82.
В общей сложности при анализе 4 локусов микросателлитных последовательностей среди 49 сортов земляники садовой было выявлено 49 различных генотипов. Это свидетельствует о достаточно высоком полиморфизме отобранных SSR-маркеров.
Количество выявляемых аллелей в локусе зависит от состава выборки исследуемых образцов и значительно увеличивается при анализе обширных коллекций. В исследованиях Govan (2008) при изучении генетического разнообразия 60 представителей рода Fragaria с применением 10 SSR-маркеров было выявлено 166 аллей [12]. В исследованиях Brunings при уменьшении выборки до 25 образцов при использовании тех же маркеров было обнаружено 74 аллеля [13]. В данном исследовании использовалась выборка из 49
сортов земляники садовой, которая при анализе по 4 SSR-маркерам позволила выявить 36 аллелей, в среднем 9 аллелей на маркер.
Данные о составе аллелей, выявляемых с помощью 4 SSR-маркеров, были использованы для построения дендрограммы филогенетического сходства сортов земляники садовой. Результаты представлены на рис. 2.
Как видно из дендрограммы, сорта земляники садовой генетически разнородны, однако расположены на относительно небольшом генетическом расстоянии друг от друга. Так, генетическая близость наблюдается между сортами Альфа и Соловушка, что согласуется с данными о происхождении сорта Альфа от скрещивания Соловушка х Индук. Сорта Красный берег и Купава также генетически близки, т.к. сорт Купава получен при скрещивании Red Gountlet х Красный берег. В целом, сорта белорусской селекции на данном этапе исследования не образуют отдельного кластера и генетически тесно связаны с сортами иностранной селекции. Полученные данные согласуются с предыдущими исследованиями Brunings и Gil-Ariza, показавшими, что сорта земляники садовой, культивируемые в промышленных масштабах, обладают значительным генетическим сходством. Сорта культур, обладающих низким генетическим разнообразием, требуют большего количества маркеров для того,
i-Витязь
'-Кокинская заря
-Росинка
_i-Славутич
__I-Урожайная ЦГЛ
-Любава
-Сюрприз Олимпиаде
--I-Фестивальная ромашка
I-Дукат
-Деснянка кокинская
___I-Альфа
Соловушка
___I-Красный берег
Купава Фестивальная
I-Берегиня
Данге
__'-Мишутка
Кармен Русич Гейзер Русаковка
|_1-Vikat
I-Vima Zanta
-Queen
Фейерверк Референта
_I-Darselect
Гирлянда
_i-Florens
L _ '-Чебурашка
- Таврическая
i-Kimberli
_ L I-Царица
-Мицце Шиндлер
Кокинская поздняя
- -Ostara
- -Королева Елизавета
---i-Vikoda
Тамара
Кокинская ранняя
--i-Купчиха
Славяночка Классика
-Pink Panda
Десна Pandora
_i-Дуэт
1-Senga Sengana
Рис. 2. Дендрограмма генетического сходства образцов земляники, построенная на основе результатов
SSR-анализа
чтобы получить уникальную молекулярно-генетическую формулу. Так, количество маркеров, необходимых для ДНК-типирования пшеницы равно 24 [19]. Для идентификации плодовых культур, обладающих высоким генетическим разнообразием, достаточно набора из 6-9 маркеров [9]. В данном исследовании удалось выявить 49 различных генотипов среди 49 сортов земляники садовой. Однако дендро-грамма генетического сходства, построенная на основе результатов SSR-анализа, показала небольшие генетические расстояния между сортами. Для более детальной характеристики
генотипов земляники садовой планируется привлечь дополнительные молекулярные маркеры и оценить их эффективность для целей ДНК-идентификации.
Заключение
Молекулярное исследование геномов сортов земляники садовой, выращиваемых в Беларуси, показало, что они характеризуются невысоким генетическим разнообразием. SSR-анализ показал тесную генетическую связь изученных сортов селекции Беларуси, России, Германии, Польши и других стран. Тем не менее, анализ
4 локусов микросателлитных последовательностей среди 49 сортов земляники садовой позволил выявить 49 различных генотипов. Для более детальной характеристики генотипов земляники садовой планируется привлечь дополнительные молекулярные маркеры и оценить их эффективность для целей ДНК-идентификации.
Авторы выражают благодарность руководителю отдела ягодных культур Михайловой Алле Михайловне (РУП «Институт плодоводства», Самохваловичи) за предоставленный сортовой материал земляники садовой.
Список использованных источников
1. Staudt, G. Strawberry biogeography, genetics and systematics / G. Staudt // Acta Hort. -2009. - Vol. 842. - P. 71-84.
2. Estimation of the nuclear DNA content of strawberries (Fragaria spp.) compared with Arabidopsis thaliana by using dual system flow cytometry / Y. Akiyama [et al.] // Cytolo-gia. - 2001. - Vol. 66. - P. 431-436.
3. DNA fingerprinting of strawberry (Fragaria x ananassa) cultivars using randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) markers / C. De-gani [et al.] // Euphytica. - 1998. - Vol. 102, № 2. - P. 247-253.
4. Morphological traits and high resolution RAPD markers for the identification of the main strawberry varieties cultivated in Argentina / M. Garcia [et al.] // Plant Breed. - 2002. -Vol. 122, № 1. - P. 76-80.
5. Hancock, J. Randomly amplified polymorphic DNAs in the cultivated strawberry Fragaria* ananassa / J. Hancock, P. Callow, D.V. Shaw // J. Am. Soc. Hortic. Sci. - 1994. -Vol. 119, № 4. - P. 862-864.
6. Characterization of mixed disomic and polysomic inheritance in the octoploid strawberry (Fragaria x ananassa) using AFLP mapping / E. Lerceteau-Kohler [et al.] // Theor. Appl. Genet. - 2003. - Vol. 107. - P. 619-628.
7. Arnau, G. Fast and reliable strawberry cultivar identification using inter simple sequence repeat (ISSR) amplification / G. Arnau, J. Lal-lemand, M. Bourgoin // Euphytica. - 2002. -Vol. 129. - P. 69-79.
8. The use of random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers to identify strawberry varieties: a forensic application / L. Congiu [et al.] // Mol. Ecol. - 2000. - Vol. 9, № 2. - P. 229-232.
9. Урбанович, О.Ю. Молекулярные маркеры идентификации и генотипирования яблони и груши / О.Ю. Урбанович; Институт генетики и цитологии НАН Беларуси. -Минск: Право и экономика, 2013. - 210 с.
10. Sargent, D. Development and characterisation of polymorphic microsatellite markers-from Fragaria viridis, a wild diploid strawberry / D. Sargent, A. Hadonou, D. Simpson // Mol. Ecol. Notes. - 2003. - Vol. 3, № 4. - P. 550-552.
11. A genetic linkage map of microsatellite, gene-specific and morphological markers in diploid Fragaria /D. Sargent [et al.] // Theor Appl Genet. - 2004. - Vol. 109, № 7. - P. 1385-1391.
12. A reliable multiplexed microsatellite set for genotyping Fragaria and its use in a survey of 60 F. x ananassa cultivars / C. Govan [et al.] // Mol. Breed. - 2008. - Vol. 22, № 4. - P. 649-661.
13. Implementation of simple sequence repeat markers to genotype Florida strawberry varieties / A.M. Brunings [et al.] // Euphytica. - 2010. -Vol. 173. - P. 63-75.
14. Impact of plant breeding on the genetic diversity of cultivated strawberry as revealed by expressed sequence tag-derived simple sequence repeat markers / D.J. Gil-Ariza [et al.] // J. Am. Soc. Hortic. Sci. - 2009. - Vol. 134, № 3. - P. 337-347.
15. A genome-enabled, high-throughput, and multiplexed fingerprinting platform for strawberry (Fragaria L.) / A. Chambers [et al.] // Mol. Breeding. - 2013. - Vol. 31. - P. 615-629.
16. PCR-amplification and detection of the human DIS80 VNTR locus. Amplification condition, population genetics and application in forensic analysis / A.D. Kloosterman, B. Budowle, P. Daselaar // Int. J. Leg. Med. - 1993. - Vol. 105, № 257-264.
17. Nei, M. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endo-nucleases / M. Nei, W.H. Li // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1979. - Vol. 76. - P. 5269-5273.
18. Van de Peer, Y. TREECON: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees / Y. Van de Peer, R. De Wachter // Comput. Applic. Biosci. - 1993. - Vol. 9. - P. 177-182.
19. Assesing genetic diversity of wheat (Triti-cum aestivum L.) germplasm using microsatellite markers / X.Q. Huang [et al.] // Theor Appl Genet. - 2002. - Vol. 105, № 5. - P. 699-707.
Дата поступления статьи 15 августа 2015 г.
