CC BY
21
УДК 577.21:635.142
ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА ОБРАЗЦОВ ПЕТРУШКИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ RAPD И ISSR МАРКЕРОВ
А.С. Домблидес, Е.А. Домблидес, В.А. Харченко, Г.А. Потехин
(Всероссийский научно-исследовательский институт селекции и семеноводства овощных культур; e-mail: arthurdom@inbox.ru)
RAPD и ISSR маркеры были использованы для классификации 32 образцов петрушки (Petroselinum crispum [Mill] Nym. ex A.W. Hill), включая корневые и листовые разновидности. 51 RAPD и 66 ISSR маркеров было амплифицировано с пятью RAPD и шестью SSR праймерами. Среднее количество полос в ISSR-спектрах составляло 11, а в RAPD-спект-рах 10,2. Матрица генетических расстояний между изучаемыми образцами была построена с применением коэффициента Жаккарда. Дендрограмма, построенная UPGMA методом, графически отражала значения генетических дистанций. Растояние между корневыми и листовыми формами петрушки составляло 0,292.
Ключевые слова: Petroselinum crispum [Mill.] Nym ex A.W. Hill, RAPD, ISSR, коэффициент Жаккарда.
Петрушка относится к роду Petroselinum Hill. семейства зонтичные Apiaceae. Вид Petroselinum crispum [Mill.] Nym. ex A.W. Hill, 2n = 22 представлен двулетними растениями, которые повсеместно выращивают и применяют в медицине и кулинарии. Центр происхождения петрушки расположен по берегам Средиземноморского бассейна, где она и сейчас встречается в диком виде. По внешним признакам среди культурных форм можно выделить три основные разновидности: листовая обыкновенная (var. vulgare (Nois.) Danert), кудрявая (var. crispum Gand.) Mazk.) и корневая, известная ранее как var. radicosum. (Alef) Danert, а сейчас часто упоминающаяся как var. tuberosum (Bernh.) Mart. Crov. Генетические взаимоотношения между различными разновидностями петрушки остаются пока не выясненными. Публикаций, посвященных изучению общего генетического разнообразия петрушки с использованием молекулярных маркеров, крайне мало. Методы, основанные на анализе полиморфизма амплифицированных ДНК фрагментов, широко используют для определения уровня генти-ческой изменчивости и для выявления филогенетических отношений между растениями. Методы, которые не требуют предварительной информации о последовательности ДНК, такие как RAPD [1, 2] и ISSR [3], по отдельности и в комбинации показали свою эффективность в филогенетических исследованиях растений.
Материалы и методы
Изучены 32 образца петрушки из коллекции лаборатории зеленных и пряно-вкусовых культур
ВНИИССОК, включающей семь образцов из Всероссийского института растениеводства имени Вавилова (ВИР) и коммерческие сорта семеноводческих компаний (таблица). При выделении суммарной ДНК применяли метод с использованием CTAB-буфера [4] и двукратной депротеинизацией хлороформом. Полимеразную цепную реакцию проводили с использованием реагентов и праймеров производства компании "СИНТОЛ", Москва. Процедура RAPD-анализа соответствовала стандартному протоколу [5]. Для проведения ISSR-анализа подбирали оптимальную температуру отжига мик-росателлитных праймеров на ДНК матрице в диапазоне от 4б до 52°. Продукты амплификации разделяли для RAPD-фрагментов в 1,7%-м агарозном геле в 1 X ТВЕ-буфере, а ISSR-фрагменты разделяли в 2%-м агарозном геле SFR высокого разрешения (Amresco, США) и окрашивали бромистым этидием. Размеры амплифицированных фрагментов определяли в сравнении с маркером молекулярных масс 100 bp DNA ladder (MBI FERMENTAS, Латвия). Учитывали только четкие ДНК-фрагменты, воспроизводимые в трех независимых экспериментах. Для классификации образцов петрушки использовали пять RAPD-праймеров (FPT12, OPD03, OPA10, FPT16, OPC19), отобранных из 20 и б микро-сателлитных праймеров ((ca)grc, (ca)gg, (ggat)4, (ac)gyt, (tg)grc, (ca)grg), отобранных из 13. Анализ результатов проводили с использованием программ GenStat ver. 6 [6] и TREECON [7]. Коэффициент Жаккарда [g] был использован для построения матрицы генетической схожести. Индексы бутстрепа представлены в процентах для 1000 реплик.
Исследованные образцы петрушки (Petroselinum crispum (Mill) Nym).
№ Ha3BaHHe Происхождение Разновидности
1 3cMepankfla/Esmerald "Гавриш" Кудрявая
2 MoocKpayçe/Moose krause "Модуль" Кудрявая
3 Frise Nain Mousse Франция Кудрявая
4 Variety 2 США Кудрявая
5 Bravour Великобритания Кудрявая
6 Afrodite Германия Кудрявая
7 Forest Green США Кудрявая
8 Starke США Кудрявая
9 Calito Frise Франция Кудрявая
10 Moss Curled B - Кудрявая
11 Vent Fonce Франция Кудрявая
12 Einfache Schnitts Германия Обыкновенная
13 Gigante d'Italia Италия Обыкновенная
14 Vallesona Германия Обыкновенная
15 Festival Германия Обыкновенная
16 Variety 1 США Обыкновенная
17 Eorartipt/Bogatir "Семена НК" Обыкновенная
18 HTaëLAHCKHH raraHT/Italian Giant "Престиж" Обыкновенная
19 ËHCTOBaa o6tiKHOBeHHa»/Listovaya "Поиск" Обыкновенная
20 U-521 ВИР Обыкновенная
21 K-512 ВИР Обыкновенная
22 Prezzemolo Giante ВИР Обыкновенная
23 Commun ВИР Обыкновенная
24 Friss 2260 ВИР Обыкновенная
25 Moss-Curled ВИР Обыкновенная
26 K-517 ВИР Обыкновенная
27 Atika Чехия "SEMO" корневая
28 Eagle "Enza Zaden" корневая
29 ®HHaë/Final "Гавриш" корневая
30 o6paçeu 97 ВНИИССОК корневая
31 o6paçeu 99 ВНИИССОК корневая
32 o6paçeu 93 ВНИИССОК корневая
Результаты и обсуждение
Среднее количество амплифицированных КАРБ-фрагментов составило 10,2, а КВЯ-фрагментов — 11. Образцы, которые отличались по КВЯ-спектрам, как правило, также выделялись и при КАРБ-ана-лизе, и общий процент полиморфизма составляет 95%. Наибольший полиморфизм был выявлен с использованием микросателлитного праймера с ТО повторами (до 100%). Нужно отметить, что из общего количества продуктов амплификации 23 ДНК-фрагмента были специфичны только для корневых
форм петрушки, а 22 присутствовали у листовых и отсутствовали у корневых образцов.
Дендрограмма, построенная методом иРОМА на основе совместного анализа КАРБ и КВЯ маркеров, отображает генетические взаимоотношения между изученными образцами (рисунок). Наиболее удаленные (0,292) друг от друга два больших кластера, имеющие максимальную поддержку, соответствуют листовым и корневым разновидностям петрушки. В кластере листовых образцов с большим значением генетической схожести (0,858) образовались два подкластера листовых кудрявых и листо-
Listo vaya ltalian_giartl — Gigante_d'Italia — k-517 -Bogatir — Festival Variety 1 Commuri Val I eso na k-512 Esmera Id Frise_Naln_Mousse ForestGreen Moss Curled S MossCurled U-521 Friss_N2260 Bravo ur EinfacheSchnitts CalitoFrise Vent_Fonoe Moose_krause Esmera Id Variety2 -Afrodite — Starke -Prezze mol o_Gigante -Eagle Final — Atika -93 -97 99 -
47
100
1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3
иРОМЛ дендрограмма генетических расстояний между разновидностями и сортами петрушки, построенная по результатам анализа ИЛРБ и маркеров
вых обыкновенных форм. В кладе листовой петрушки с обыкновенным типом листа диапазон генетической схожести варьирует от 0,873 до 0,921, в то время как у листовых кудрявых форм этот показатель составляет от 0,845—0,924. Два образца U-521 (ВИР) и Einfache Schnitts с обыкновенным типом листа попали в кластер с кудрявыми формами петрушки.
Низкие значения бутстрепа показывают невысокую степень надежности разделения в кластере
листовых форм. Нечеткое разделение между листовыми формами может быть объясненно мультилокус-ной природой наследования признака формы листа. Также не было отмечено высокоспецифичных фрагментов для каждой из листовых форм петрушки в амплифицирован-ных ДНК-спектрах. Только итальянский генотип с темно-зеленым, большим и гладким листом Prezze-molo Gigante d'Italia отделился от других форм петрушки, что может подтвердить в данном случае его отношение к часто отдельно выделяемой листовой разновидности neapolitanum Darnet. В под-кластере корневых разновидностей коэффициент Жаккарда составляет 0,889—0,989. Об определенном разделении листовых и корневых форм петрушки с помощью молекулярных, биохимических и морфологических данных сообщалось ранее [9], тем не менее информации о ДНК-маркерах, позволяющих дифференцировать разновидности листовых кудрявых и обыкновенных форм петрушки, не было дано. Эти листовые разновидности в нашем исследовании оказались генетически очень близкими. Впервые проведенный ISSR-анализ петрушки выявил достаточное количество микросателлитных повторов для филогенетических исследований Petroseli-num crispum [Mill.] Nym. ex A.W. Hill. Комбинированное использование двух типов маркеров позволяет успешно применять их в филогенетических исследованиях растений.
Т
Т
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J, Rafals-ky J.A., Tingey S.V. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucleic Acids Res. 1990. N 18. P. 6531-6535.
2. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers // Nucleic Acids Res. 1990. N 18. P. 7213-7218.
3. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeats (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification // Genomics. 1994. N 20. P. 176-183.
4. Dellaporta S.L., Wood J., Hicks J.B. A plant DNA minipreparation: Version II // Plant Mol. Biol. Rep. 1983. N 1(4). P. 19-21.
5. Waugh R. RAPD Analysis: use for genome characterization, tagging traits and mapping // Plant Molecular Bio-
logy — A Laboratory Manual / Ed. S. Melody. Clark. Berlin; Heidelberg: Springer-Verlag, 1997. P. 305-333.
6. GenStat 6 Committee. The guide to GenStat release 6.1. VSN. Oxford: International Ltd., 2002.
7. Van de Peer Y, De Wachter R.. TREECON for Windows: A software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment // Comput. Appl. Biosci. 1994. Vol. 10. P. 569-570.
8. Jaccard P. Nouvelles researches sur la distribution florale // Bull. Soc. Vaud. Sci. Nat. 1908. Vol. 44. P. 223-270.
9. Lohwasser U., Dittbrenner A., Marthe F., Borner A. Taxonomy of plant genetic resources - an interaction of morphological, molecular and phytochemical data // Eucarpia 19 Genetic Recourses Section/Ljubljana: Kmetijski ins titut Slovenije, 2009. P. 36.
Поступила в редакцию 14.04.10
RAPD AND ISSR MARKERS FOR STUDY OF GENETIC VARIATION AMONG
PARSLEY (PETROSELINUM CRISPUM (MILL.) NYM.) ACCESSIONS
A.S. Domblides, E.A. Domblides, V.A. Kharchenko, G.A. Potekhin
Five RAPD primers out of 20 and 6 SSR primers out of 13 were selected to discriminate 33 accessions of parsley (Petroselinum crispum [Mill] Nym. ex A.W. Hill). In the total, 51 RAPD and 66 ISSR bands were generated with these primers. The UPGMA dendrogram based on the Jaccard's coefficients was constructed. The two clusters of leaf and root plant forms were the most distant at similarity 0,292 from each other. Consequently, root form-specific markers were observed. Not all flat leaf and curly-leaf forms have been clearly separated, but some of curly-leaf accessions formed their own sub-cluster.
Key words: Petroselinum crispum [Mill] Nym. ex A.W. Hill., RAPD, ISSR, Jaccard's coefficient.
Сведения об авторах
Домблидес Артур Сергеевич — канд. с.-х. наук, зав. сектором ПЦР диагностики Всероссийского научно-исследовательского института селекции и семеноводства овощных культур. Тел. (495)780-91-78; 8-916-836-27-01; e-mail: arthurdom@inbox.ru
Домблидес Елена Алексеевна — канд. с.-х. наук, ст. науч. сотр., сектор ПЦР диагностики Всероссийского научно-исследовательского института селекции и семеноводства овощных культур. Тел. (495)780-91-78; 8-916-593-22-32; e-mail: Edomblides@mail.ru
Харченко Виктор Александрович — канд. с.-х. наук, зав. лабораторией зеленных и пряно-вкусовых культур Всероссийского научно-исследовательского института селекции и семеноводства овощных культур. Тел. (495)780-91-78; 8-916-187-17-56; e-mail: kharchenkovik-tor777@gmail.com
Потехин Григорий Анатольевич — аспирант, лаборатория зеленных и пряно-вкусовых культур Всероссийского научно-исследовательского института селекции и семеноводства овощных культур. Тел. (495)780-91-78.
