CC BY
68
Биологий It
ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА НЕКОТОРЫХ СОРТОВ TRITICUM AESTIVUM L. С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ISSR-МАРКЕРОВ
И. В. БОБОШИНА, аспирант,
С В КОРОННИКОВА 614990, г. Пермь, ул. Букирева, д. 16, к. 226; тел. 89028011179;
D. DiJ£-unn*lM\ur>s±, е-mail: [email protected]
доктор биологических наук, профессор, Пермский государственный национальный исследовательский университет
Положительная рецензия представлена Л. Г. Переведенцевой, доктором биологических наук, профессором (Пермский государственный педагогический университет).
Ключевые слова: Triticum aestivum L., ISSR-метод, генетический полиморфизм, генетическое разнообразие. Keywords: Triticum aestivum L., ISSR-method, genetic polymorphism, genetic diversity.
Цель и методика исследований.
В связи с продовольственной проблемой актуально изучение геномов важнейших сельскохозяйственных культур, к числу которых относится пшеница мягкая (Triticum aestivum L.). Более трех четвертей населения использует в пищу продукты переработки ее зерна [1]. Как генетический объект пшеница (род Triticum) занимает особое положение среди злаков, что обусловлено ее широкой адаптацией в различных эколого-географи-ческих регионах мира [2].
На данный момент установлено, что генетические различия между различными организмами наиболее полно представлены на уровне ДНК. С помощью современных молекулярных методов эти различия можно обнаружить и использовать для идентификации отдельных сортов, линий и форм сельскохозяйственных растений. Методы, основанные на использовании ДНК-маркеров, обладают рядом преимуществ по сравнению с другими методами идентификации. Они позволяют в значительно большей степени выявить объективные различия между исследуемыми образцами и, следовательно, существенно повысить разрешающую силу анализа [3]. В качестве маркеров для оценки изменчивости ДНК растительного материала нами были выбраны широко распространенные в геноме повторяющиеся последовательности, обладающие высокой изменчивостью — микросателлиты. ISSR-метод (Inter-Simple Sequence Repeats) [4], или межмикросателлитный анализ, перспективен для изучения полиморфизма ДНК, этот метод позволил выявить высокий уровень генетического разнообразия у различных сельскохозяйственных культур [5, 6, 7, 8].
Для создания ISSR-маркеров не требуется предварительного знания нуклеотидной последовательности исследуемой ДНК. ISSR-маркеры являются стабильными и дают четко воспроизводимые результаты [9]. Среди полученных полиморфных фрагментов ДНК можно отыскать сцепленные с хозяйственно ценными признаками и разработать на их основе методы селекции, основанные на применении молекулярных маркеров [10].
Целью нашей работы являлся молекулярно-генетический анализ четырех сортов T. aestivum на основании полиморфизма ISSR-маркеров.
Сорта T. aestivum для изучения генетического полиморфизма были предоставлены ГНУ Пермский научно-исследовательский институт сельского хозяйства РАСХ (г. Пермь). Для молекулярно-генетического анализа была выделена ДНК из листьев T. aestivum по методике Торрес [11], с незначительными модификациями. Нами www.m-avu. narod. ru
проведен молекулярно-генетический анализ четырех сортов T. aestivum: Горноуральская, Иргина, Московская 39 и Штру.
После апробации 20 ISSR-праймеров, синтезированных в ЗАО «Синтол» (г. Москва), были отобрали пять наиболее информативных, в результате ПЦР с которыми амплифицировалось максимальное количество четких фрагментов ДНК. Реакционная смесь для полимеразной цепной реакции объемом 25 мкл содержала: 2 единицы Taq-полимеразы, 2,5 мкл стандартного 10х буфера для ПЦР, 25 пМ праймера, 2,5 мМ Mg2+, 0,25 мМ dNTP, 5 мкл геномной ДНК. Амплификацию проводили в термоциклере «Терцик» (НПФ «ДНК-Технология», Москва) по следующей программе: предварительная денатурация 94°C, 2 мин.; первые пять циклов 94°С, 20 сек.; t° отжига, 10 сек.; 72°С, 10 сек.; в последующих тридцати пяти циклах 94°С, 5 сек.; t отж., 5 сек.; 72°С, 5 сек. Последний цикл элонгации длился 2 мин. при 72°С. Температура отжига в зависимости от праймера варьировала от 55 до 60°С. Для проверки достоверности полученных ДНК-спектров, опыт повторяли не менее двух раз. В качестве отрицательного контроля (К-) в реакционную смесь для проверки чистоты реактивов добавляли вместо ДНК 5 мкл деионизированной воды. Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 1,7 %-м агарозном геле в 1х ТВЕ буфере. Гели окрашивали бромистым этидием и фотографировали в проходящем УФ-свете в системе гель-документации Gel Doc XR («Bio-Rad», USA). Определение длин фрагментов ДНК проводили с использованием программы «Quantity One» и маркера молекулярного веса (100 bp + 1.5 + 3 КЬ DNA Ladder, «ООО-СибЭнзим-М», Москва).
Результаты исследований.
При амплификации проб ДНК сорта Горноуральская выявлено 48 ISSR-фрагментов (табл. 1). Число амплико-нов варьировало от 7 (праймер Х10) до 12 (праймер М1). У сорта Иргина выявлено 35 ISSR-фрагментов. Число ампликонов варьировало от 6 (праймеры М27, Х10) до 9 (праймер М1). При ISSR-маркировании сорта Московская 39 выявлено 43 фрагмента. Число ампликонов варьировало от 6 (праймер Х10) до 11 (праймер М3). У сорта Штру выявлено 38 ISSR-фрагментов. Число ампликонов варьировало от 5 (праймер М3) до 10 (праймер М1). Амплифицированные фрагменты ДНК были отнесены к мономорфным, если частота их встречаемости была > 0,95. Фрагменты с меньшей частотой встречаемости были отнесены к полиморфным.
Длины фрагментов у сорта Горноуральская варьировали от 200 пн (праймер Х10) до 1130 пн (праймеры М1, М3, М27), у сорта Иргина — от 130 пн (праймер М1)
Биология It
Таблица 1
Характеристика ISSR-фрагментов четырех сортов T. aestivum
Праймер Нуклеотидная последовательность (5'- 3') Размеры фрагментов, пн Число фрагментов ДНК
Горноуральская Иргина Московская 39 Штру
М1 (AC)8CG 130-1130 12 (0,92) 9 (0,89) 10 (0,80) 10 (0,80)
М3 (AC)8CT 130-1130 9 (0,78) 7 (0,43) 11 (0,91) 5 (0,80)
М27 (ga)8c 200-1130 11 (0,91) 6 (1,00) 9 (0,67) 8 (0,88)
Х10 (agc)6c 140-800 7 (1,00) 6 (0,33) 6 (0,67) 6 (0,83)
Х11 (AGC)6G 270-1130 9 (1,00) 7 (1,00) 7 (1,00) 9 (0,67)
Всего: 48 (0,92) 35 (0,74) 43 (0,81) 38 (0,79)
Примечание: в скобках указаны доли полиморфных фрагментов ДНК.
до 910 пн (праймер М1), у сорта Московская 39 — от 130 (праймеры М1, М3) до 1130 (праймер Х11), а у сорта Штру — от 250 (праймер М3) до 920 (праймер М1).
Процент полиморфизма ДНК Т. aestivum, выявленный ISSR-методом, у сорта Горноуральская составил 91,7 %, у сорта Московская 39 — 81,4 %, у сорта Штру — 78,9 %, у сорта Иргина — 74,3 %.
Сравнительный анализ полиморфизма спектров продуктов амплификации, полученных с праймерами М1, М3, М27, Х10 и Х11, позволил обнаружить группы фрагментов ДНК, дифференцирующие сорта. Совокупность данных фрагментов может использоваться как для описания генофонда вида, так и для его внутрисортового разнообразия.
Выводы. Рекомендации.
Молекулярно-генетический анализ 4-х сортов Т. aestivum с 5 ISSR-праймерами показал, что сорт Горноуральская характеризуется более высоким уровнем генетического полиморфизма, чем сорта Иргина, Московская 39 и Штру. Результаты данной работы подтвердили возможность использования ISSR-метода для оценки генетического разнообразия различных сортов пшеницы мягкой. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что полилокусность ISSR-маркеров удобна и оптимальна для выявления межсортовых различий.
Выражаем искреннюю благодарность ГНУ Пермский научно-исследовательский институт сельского хозяйства РАСХ за предоставление сортов пшеницы мягкой, районированных в Пермском крае.
Работа выполнена при частичном финансировании АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы» (номер государственной регистрации темы 01201054037) и проекта Национального исследовательского университета.
Литература
1. Мельникова Н. В. Мировое разнообразие твердой пшеницы (Triticum durum Desf.) по аллелям глиадинкодиру-ющих локусов : автореф. дис. ... канд. биол. наук. М., 2010. 24 с.
2. Салина Е. А. Структура и эволюция геномов полиплоидных пшениц и их дикорастущих сородичей: исследование с использованием макро- и микросателлитов : дис. ... докт. биол. наук. Новосибирск, 2006. 331 с.
3. Малышев С. В. Идентификация и паспортизация сортов сельскохозяйственных культур (мягкой пшеницы, картофеля, томата, льна и свеклы) на основе ДНК-маркеров : метод. реком. Минск, 2006. 27 с.
4. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification // Genomics. 1994. V. 20. P. 176-183.
5. Nagaoka T, Ogihara Y Applicability of inter-simple sequence repeat polymorphisms in wheat for use as DNA markers in comparison to RFLP and RAPD markers // Theor Appl Genet. 1997. № 94. P. 597-602.
6. Liu L. W., Zhao L. P., Gong Y Q., Wang M. X., Chen L. M., Yang J. L., Wang Y., Yu F. M., Wang L. Z. DNA fingerprinting and genetic diversity analysis of late-bolting radish cultivars with RAPD, ISSR and SRAP markers // Sci. Hortic. 2008. № 116. P. 240-247.
7. Chen Y Y., Zhou R. C., Lin X. D., Wu K. Q., Qian X., Huang S. Z. ISSR analysis of genetic diversity in sacred lotus cultivars // Aquat. Bot. 2008. № 89. P. 311-316.
8. Behera T. K., Singh A. K., Staub J. E. Comparative analysis of genetic diversity in Indian bitter gourd (Momordica charantia L.) using RAPD and ISSR markers for developing crop improvement strategies // Sci. Hortic. 2008. № 115. P. 209-217.
9. Zhu Y., Hu J., Han R., Wang Y., Zhu S. Fingerprinting and identification of closely related wheat (Triticum aestivum L.) cultivars using ISSR and fluorescence-labeled TP-M13-SSR markers // Australian journal of crop science. 2011. AJCS 5 (7). P. 846-850.
10. Артюхова А. В., Гришин С. Ю., Князькина М. С., Лукашевич М. И., Заякин В. В., Нам И. Я. Разработка метода паспортизации сортов люпина // Вестник Брянского госуниверситета. 2010. 4. С. 81-84.
11. Torres A. M, Weeden N. F., Martin A. Linkage among sozyme, RFLP and RAPD markers in Vicia faba // Theor Appl. Genet. 1993. V. 5. P. 937-945.
20
www. m-avu. narod. ru
