ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТОВ ЗОЛПИДЕМА И ПРОТОНОВ НА ГАМКИНДУЦИРУЕМЫЙ ТОК В ПИРАМИДНЫХ НЕЙРОНАХ ГИППОКАМПА В ПРИСУТСТВИИ ПЕНИЦИЛЛИНА Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

© Коллектив авторов, 2020

Изучение эффектов золпидема и протонов на ГАМК-индуцируемый ток в пирамидных нейронах гиппокампа в присутствии пенициллина

Е.И. Солнцева, Ю.В. Буканова, В.Г. Скребицкий

ФГБНУ«Научный центр неврологии», Москва, Россия

Введение. Рецепторы, активируемые гамма-аминомасляной кислотой и принадлежащие к А типу (ГАМКаР), выполняют функцию торможения в нервной системе благодаря генерации хлорного тока (I ). Антибиотик пенициллин является «последовательным» блокатором открытой поры ГАМКАР, который способен тормозить диссоциацию комплекса ГАМК-рецептор. Такая модуляция работы ГАМК-сайта позволяет предполагать, что эффекты конкурентных модуляторов ГАМКАР в присутствии пенициллина могут меняться.

Цель исследования — изучить воздействие на I положительного конкурентного модулятора ГАМКАР золпидема и негативного конкурентного модулятора ГАМКАР ионов водорода (протонов) в присутствии пенициллина.

Материалы и методы. I K измеряли на изолированных пирамидных нейронах гиппокампа крысы с помощью метода пэтч-клямп и системы быстрой аппликации. ГШК, пенициллин и золпидем апплицировали на нейрон в течение 600 мс через пипетку с латеральным сдвигом. Для изучения действия протонов на I раствор ГАМКв апплицирующей пипетке закисляли дорН = 6,0-7,0.

Результаты. Аппликацш 1 мМ пенициллина снижала амплитуду I до 67 ± 4% от контрольной величины. Золпидем в концентрации 0.5 мкМ повышал амплитуду 1ААШдо 167 ± 9% от контрольной величины. При ко-аппликации пенициллина и золпидема стимулирующий эффект золпидема не проявлялся, и амплитуда I составляла 68 ± 4%. Снижение рН раствора ААМК до рН = 7,0 или рН = 6,0 вызывало падение амплитуды I до 80 ± 4 и 35 ± 4% соответственно. В присутствии пенициллина эффект протонов на I не менялся.

Заключение. Впервые показано, что в присутствии пенициллина стимулирующий эффект золпидема на I отменяется, а ингибирующий эффект протонов на I сохраняется.

Ключевые слова: ААМК-рецепторы; пенициллин; золпидем; протоны.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии финансирования при проведении исследования. Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Адрес для корреспонденции: 105064, Москва, пер. Обуха, д. 5. ФГБНУ НЦН. E-mail: synaptology@mail.ru. Солнцева Е.И.

Для цитирования: Солнцева Е.И., Буканова Ю.В., Скребицкий В.Г. Изучение эффектов золпидема и протонов на ГАМК-индуцируемый ток в пирамидных нейронах гиппокампа в присутствии пенициллина. Анналы клинической и экспериментальной неврологии 2020; 14(4): 61—65.

DOI: 10.25692/ACEN.2020.4.8

Поступила 25.11.2019 / Принята в печать 08.10.2020

Effects of Zolpidem and protons on GABA-induced current in the hippocampal pyramidal neurons in the presence of penicillin

Elena I. Solntseva, Julia V. Bukanova, Vladimir G. Skrebitsky

Research Center of Neurology, Moscow, Russia

Introduction. Type A receptors activated by gamma-aminobutyric acid (GABBAR) play an inhibitory role in the nervous system due to the generation of chlorine current (IGABA). Penicillin is a "sequential blocker" of the GABAaR open channel, which can inhibit dissociation of the GABA-receptor complex. This GABA site modulation suggests that the effects of competitive GABAR modulators may change in the presence ofpenicillin.

The aim of the study was to evaluate the effect of Zolpidem, the positive competitive GABAaR modulator, and hydrogen ions (protons), the negative competitive GABAaR modulator, on IGABA in the presence of penicillin.

Materials and methods. I was measured on isolated pyramidal neurons of the rat hippocampus, using the patch damp technique andfast application system. GABA, penicillin, and Zolpidem were applied to the neuron for 600 msec via a lateral shift pipette. To study the effect ofprotons on I , the GABA solution in the application pipette was acidified to pH 6.0-7.0.

Results. The application of 1 mmol ofpenicillin reduced the I amplitude to 67 ± 4% of the control value. Zolpidem, with a concentration of 0.5 pmol, increased the If}AM amplitude to 167 ± 9% of the control value. When penicillin and Zolpidem were co-applied, the stimulating effect of Zolpidem was not observed, and the I' amplitude was 68 ± 4%. Reducing the pH of the GABA solution to 7.0 or 6.0 caused the IGABA amplitude to decrease to 80±4 and 35 ± 4%, respectively. The effect of protons on I did not change in the presence of penicillin.

Conclusion. For the first time, it has been shown that the stimulating effect of Zolpidem on I is cancelled out by penicillin, while the inhibitory effect ofprotons on IGABA is preserved. GABA

Keywords: GABA receptors; penicillin; Zolpidem; protons.

Acknowledgments. The study had no sponsorship.

Conflict of interest. The authors declare no apparent or potential conflicts of interest related to the publication of this article.

For correspondence: 105064, Russia, Moscow, Obukha per., 5. Research Center of Neurology. E-mail: synaptology@mail.ru. Solntseva E.I.

For citation: Solntseva E.I., Bukanova J.V., Skrebitsky V.G. [Effects of Zolpidem and protons on GABA-induced current in the hippocampal pyramidal neurons in the presence of penicillin]. Annals of clinical and experimental neurology 2020; 14(4): 61-65. (In Russ.)

DOI: 10.25692/ACEN.2020.4.8

Received 25.11.2019 / Accepted 08.10.2020

Введение

ГАМКА-рецепторы (ГАМКаР) выполняют функцию торможения в нервной системе, благодаря способности инициировать хлорный ток (/ГАМк), который гиперполяризует мембрану и тормозит импульсацию. ГАМКаР являются мишенью для разнообразных модуляторов эндогенной и экзогенной природы [1, 2], которые способны изменять 1ГАМК посредством конкурентных или неконкурентных механизмов. Антибиотик пенициллин G способен тормозить 1ГАМК неконкурентным образом, блокируя открытую пору ГАМКаР [3]. Показано, что механизм ингибирования ГАМКаР пенициллином соответствует модели так называемого последовательного блока [4]. Согласно этой модели блокатор способен препятствовать закрыванию активаци-онных ворот канала (эффект «нога-в-дверь») и канал приобретает статус «блокирован-открыт». В связи с нарушением цикличности работы воротных структур нарушается цикличность работы и рецепторного сайта (цикл ассоциация-диссоциация комплекса агонист-рецептор), и сайт фиксируется в состоянии связывания молекулы ГАМК. После удаления из внешнего раствора агониста и блока-тора, т.е. ГАМК и пеницилина, канал остается некоторое время открытым, благодаря чему генерируется так называемый «хвостовой» ток. В связи с тем, что в присутствии «последовательного» блокатора диссоциация комплекса ГАМК-рецептор нарушена, нарушаются также эффекты конкурентных модуляторов. Показано, что конкурентный антагонист ГАМКаР бикукуллин не влияет на 1ГАМК в присутствии пенициллина [5]. Вопрос об изменении эффектов других конкурентных модуляторов ГАМКаР в присутствии пенициллина только предстоит изучить. Настоящая работа посвящена исследованию эффектов двух конкурентных модуляторов ГАМКаР — позитивного модулятора золпиде-ма и негативного модулятора ионов водорода (протонов) на 1ГАМК в присутствии пенициллина.

Золпидем широко применяется для лечения ряда неврологических заболеваний, таких как бессонница [6], дис-кинезии и расстройства сознания [7]. Считается, что механизмы лечебного действия золпидема определяются его способностью связываться с бензодиазепиновым сайтом

на ГАМКаР и увеличивать амплитуду /ГАМК. Золпидем, связываясь с бензодиазепиновым сайтом в интерфейсе а1/у2-субъединиц ГАМКАР, способен влиять на работу ГАМК-связывающего сайта, локализованного в интерфейсе а1/р2-субъединиц, и усиливать влияние последнего на воротный механизм хлорного канала [8].

Закисление внеклеточной среды с соответствующим увеличением концентрации протонов приводит к активации мозга, одной из причин которой является ингибирование активности ГАМКАР. Снижение амплитуды 1ГАМК под влиянием протонов описано на разных клетках [9, 10], в том числе на нейронах гиппокампа [11]. Предполагается, что механизмы этого эффекта связаны с прямым или алло-стерическим влиянием протонов на ГАМК-связывающий сайт на ГАМКАР.

Цель исследования — изучить воздействие на 1ГАМК положительного конкурентного модулятора ГАМКАР золпидема и негативного конкурентного модулятора ГАМКАР ионов водорода (протонов) в присутствии пенициллина.

Материалы и методы_

Эксперименты проводились на изолированных пирамидных нейронах области СА3 гиппокампа 11-14-дневных крыс линии Вистар. ГАМК апплицировали на нейрон в концентрации 5 мкМ через стеклянную пипетку диаметром 0.1 мм при ее быстром латеральном смещении. Длительность аппликации составляла 600 мс, интервалы между аппликациями — 30-40 с. Трансмембранные токи регистрировали методом «пэтч-клямп» в конфигурации «целая клетка». Удерживаемый потенциал был равен -70 мВ. Раствор в регистрирующей пипетке содержал (в мМ): 40 CsF, 100 CsCl, 5 ЭГТА, 4 MgCl2, 4 №АТФ, 5 HEPES, pH 7,3. Экстраклеточный проточный раствор содержал (в мМ): 140 NaCl, 3 KCl, 3 CaCl2, 3 MgCl2, 10 D-глюкозы, 10 HEPES hemisodium, pH 7,4. При изучении действия протонов на 1ГАМК раствор ГАМК закисляли с помощью HCl до рН 7,0 и рН 6,0. Для блокады протон-активируемо-го ионного тока в раствор добавляли амилорид в концентрации 100 мкМ [12]. Препараты пенициллин и золпидем

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ. Фундаментальная неврология Изучение эффектов золпидема и протонов

ко-апплицировали с ГАМК. Скорость протока составляла 0,6 мл/мин. Реактивы — компании «Sigma».

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы «Prism Graphpad» с использованием теста ANOVA (пост тест Dunnett) и непарного t-теста Стьюдента. Полученные результаты представлены в виде средней величины и ошибки средней (M±m).

Результаты_

Короткая (600 мс) аппликация ГАМК на изолированные пирамидные нейроны гиппокампа крысы вызывала хлорный ток (1ГАМК), амплитуда которого зависела от концентрации ГАМК с ЕС50 = 8 ± 3 мкМ. Среднее значение потенциала реверсии 1ГАМК составляло -9,8 ± 0,9 мВ и было близко к значению хлорного равновесного потенциала, рассчитанного по уравнению Нернста с учетом используемых концентраций хлора в регистрирующей пипетке и внешнем растворе (-9,5 мВ). Все дальнейшие эксперименты проведены с концентрацией ГАМК 5 мкМ.

A

1+2

1+3

1+2+3

600 мс / msec

150

100

50

*** *** JUT

1

1+2

1+3

1+2+3

Рис. 1. Отмена стимулирующего эффекта золпидема на /ГАМК в присутствии пенициллина.

1 — 5 мкМ ГАМК (контроль); 2 — 0,5 мкМ золпидема; 3 — 1 мМ пенициллина. Запись тока (А) и средние значения амплитуды 1ГАМК (В) в различных экспериментальных условиях. ***р < 0,001 по сравнению с контролем.

Fig. 1. Suppression of Zolpidem's stimulating effect on IGABA in the presence of penicillin.

1 — 5 |imol of GABA (control); 2 — 0.5 |imol of Zolpidem; 3 — 1 mmol of penicillin. Current recording (A) and the average I™ amplitude (B) under different experimental conditions. ***p < 0.001 compared to the control.

Изучали влияние «последовательного» блокатора поры ГАМКаР пенициллина на проявление эффектов конкурентных модуляторов ГАМКАР. В работе использовали два конкурентных модулятора ГАМКАР: положительный модулятор золпидем [8] и негативный модулятор — протоны (Н+) [9, 11]. Учитывая данные литературы о нарушении «последовательными» блокаторами поры, в том числе пенициллином [5], диссоциации комплекса ГАМК-рецеп-тор, можно было ожидать, что эффекты этих двух препаратов на /ГАМК в присутствии пенициллина будут ниже, чем в контроле.

В первой серии экспериментов мы изучали, как меняется стимулирующий эффект золпидема на 1ГАМК в присутствии пенициллина (рис. 1). При добавлении в апплицирующую пипетку 0,5 мкМ золпидема амплитуда 1ГАМК увеличивалась в среднем до 167 ± 9% (п = 6; р < 0,001). Ко-аппликация 5 мкМ ГАМК и 1 мМ пенициллина вызывала характерные для последовательного блокатора изменения [5], а именно

A

1+2

pH ^ 7.0

Г

pH

0.5 нА / nA

300 мс / msec

1

с о п.

100

80

60

40

20

pH

pH

Рис. 2. Отсутствие влияния пенициллина на ингибирующий эффект протонов на /ГАМК.

1 — 5 мкМ ГАМК; 2 — 1 мМ пенициллина. Запись тока (А) и средние значения амплитуды !ГАМК (В) в различных экспериментальных условиях. **р < 0,01 по сравнению с контролем (рН 7,4) в группе 1 без пенициллина. ++p < 0,01 по сравнению с контролем (рН 7,4) в группе 1 + 2 с пенициллином.

Fig. 2. No effect of penicillin on the protons' inhibitory effect on IGABA. 1 — 5 imol of GABA; 2 — 1 mmol of penicillin. Current recording (A) and average IGABA amplitude (B) under different experimental conditions. **p < 0.01 compared to the control (pH 7.4) in group 1 without penicillin. ++p < 0.01 compared to the control (pH 7.4) in group 1 + 2 with penicillin.

B

'ГАМК / 'GABA

B

200 1 'ГАМК / 'GABA

0

0

снижение амплитуды тока в присутствии блокатора и генерацию «хвостового» тока после прекращения действия агониста и блокатора. Амплитуда /ГАМК в присутствии 1 мМ пенициллина снижалась до 67 ± 4% (n = 7; р < 0,001). При одновременном присутствии в пипетке 1 мМ пенициллина и 0.5 мкМ золпидема стимулирующий эффект золпи-дема на 1ГАМК не проявлялся, и амплитуда тока составляла 68 ± 4% (n = 7). Таким образом, результаты с золпиде-мом подтвердили предположение о влиянии блокатора поры пенициллина на эффект конкурентного модулятора золпидема.

Вторая серия экспериментов была посвящена изучению влияния «последовательного» блокатора поры ГАМКаР пенициллина на ингибиторный эффект Н+ на 1ГАМК (рис. 2). При изучении влияния протонов на 1ГАМК мы столкнулись с проблемой суммации 1ГАМК с током, текущим по протон-чувствительным ионным каналам (ASICs). В наших экспериментах короткая аппликация (600 мс) кислого (рН 6,0) физиологического раствора на изолированный нейрон гиппокампа активировала входящий ток, амплитуда которого варьировалась в пределах 0,1-2,0 нА. Чтобы избежать вмешательства ASICs в изучаемый 1ГАМК, мы добавляли в апплицирующую пипетку 100 мкМ амило-рида — блокатора ASICs [12]. Для изучения действия Н+ на 1ГАМК мы меняли рН раствора ГАМК от нейтрального (рН 7,4) до кислого со значением рН 7,0 или 6,0. Обнаружено, что закисление раствора ГАМК приводит к быстрому, обратимому и дозозависимому снижению амплитуды 1ГАМК на пирамидных нейронах гиппокампа. При значениях рН 7,0 и 6,0 амплитуда 1ГАМК уменьшалась в среднем до 80 ± 4 и 35 ± 4% соответственно (n = 7; р < 0,01) при сравнении с контрольным током, измеренным при нейтральном рН 7,4. Добавление в апплицирующую пипетку 1мМ пенициллина приводило к уменьшению амплитуды 1ГАМК до 65 ± 5% при нейтральном рН, 40 ± 3% при рН 7,0 и 20 ± 4% при рН 6,0 (n = 7; p < 0,01). Результаты показывают, что пенициллин не меняет ингибирующего эффекта Н+ на Тгамк.

Обсуждение_

В работе впервые показано, что пенициллин, обладающий свойствами «последовательного» блокатора хлорного канала ГАМКаР, способен устранять стимулирующий эффект золпидема на 1ГАМК, но не меняет ингибирующего

эффекта протонов на 1ГАМК. Препарат золпидем является известным транквилизатором, и его широко используют для лечения ряда неврологических заболеваний [6, 7]. Стимулирующий эффект золпидема на 1ГАМК объясняют его связыванием с бензодиазепиновым сайтом на ГАМКаР и аллостерическим положительным влиянием на работу ГАМК-связывающего сайта через усиление влияния последнего на воротный механизм хлорного канала [8]. Наиболее вероятным объяснением полученного в наших экспериментах исчезновения стимулирующего эффекта золпидема на 1ГАМК в присутствии пенициллина является, на наш взгляд, изменение свойств ГАМК-связывающего сайта ГАМКаР под влиянием пенициллина. Известно, что блокатор хлорного канала ГАМКаР пенициллин взаимодействует в канале с активационными воротами, мешая им закрываться (эффект «нога-в-дверь»). Пока ворота открыты, молекулы ГАМК остаются связанными со своим сайтом, и поэтому ГАМК-сайт перестает реагировать на изменение конформации бензодиазепинового сайта, вызванное связыванием с ним молекул золпидема. Полученные нами результаты о негативном влияния пенициллина на эффект золпидема позволяют предположить, что золпидем вряд ли можно рекомендовать в качестве терапевтического средства для устранения судорожных припадков, которые иногда наблюдаются при применении пенициллина [13].

Предполагается, что на ГАМКаР существует несколько сайтов, связывающих протоны [10, 14], и по крайней мере два из них (а^64 и p2Y205) принадлежат центру, связывающему ГАМК [10]. Факт взаимодействия протонов с ГАМК-сайтом позволял предполагать, что изменение свойств ГАМК-сайта в присутствии пенициллина отразится на эффекте кислого рН на 1ГАМК. Однако это предположение не нашло подтверждения в наших экспериментах. Нами не обнаружено достоверного изменения ингибирующего эффекта Н+ (рН 7,0-6,0) на амплитуду 1ГАМК в присутствии 1 мМ пенициллина. Сохранение эффекта Н+ на 1ГАМК в условиях, когда работа ГАМК-сайта нарушена пенициллином, заставляет искать другие объяснения этому эффекту, кроме конкуренции с ГАМК за место связывания. Описание неконкурентных механизмов эффектов Н+ на 1ГАМК можно найти в работах [10, 14, 15], где обсуждаются места связывания Н+ с ГАМКаР, отличные от ГАМК-сайта, и индуцирующие изменения в работе активационных ворот и процессах десенситизации хлорного канала

Список литературы / References

1. Sigel E., Steinmann M.E. Structure, function, and modulation of GABA(A) receptors. J Biol Chem 2012; 287: 40224-40231. DOI: 10.1074/jbc.R112.386664. PMID: 23038269.

2. Sieghart W Allosteric modulation of GABAA receptors via multiple drug-binding sites. Adv Pharmacol 2015; 72: 53-96. DOI: 10.1016/bs.apha.2014.10.002. PMID: 25600367.

3. Klinger F., Bajric M., Salzer I. et al. 8 Subunit-containing GABAA receptors are preferred targets for the centrally acting analgesic flupirtine. Br J Pharmacol 2015; 172: 4946-4958. DOI: 10.1111/bph.13262. PMID: 26211808.

4. Benveniste M., Mayer M.L. Trapping of glutamate and glycine during open channel block of rat hippocampal neuron NMDA receptors by 9-aminoacridine. J Physiol 1995; 483: 367-384. DOI: 10.1113/jphysiol.1995.sp020591. PMID: 7650609.

5. Rossokhin A.V., Sharonova I.N., Bukanova J.V. et al. Block of GABA(A) receptor ion channel by penicillin: electrophysiological and modeling insights toward the mechanism. Mol Cell Neurosci 2014; 63: 72-82. DOI: 10.1016/j. mcn.2014.10.001. PMID: 25305478.

6. Wisden W, Yu X., Franks N.P. GABA receptors and the pharmacology of sleep. Handb Exp Pharmacol 2019; 253: 279-304. DOI: 10.1007/164_2017_56. PMID: 28993837.

7. Bomalaski M.N., Claflin E.S., Townsend W., Peterson M.D. Zolpidem for the treatment of neurologic disorders: a systematic review. JAMA Neurol 2017; 74: 1130-1139. DOI: 10.1001/jamaneurol.2017.1133. PMID: 28655027.

8. Hanson S.M., Czajkowski C. Disulphide trapping of the GABA(A) receptor reveals the importance of the coupling interface in the action of benzodiazepines. Br J Pharmacol 2011; 162: 673-687. DOI: 10.1111/j.1476-5381.2010.01073.x. PMID: 20942818.

9. Chen Z.L., Huang R.Q. Extracellular pH modulates GABAergic neurotransmission in rat hypothalamus. Neuroscience 2014; 271: 64-76. DOI: 10.1016/j.neuroscience.2014.04.028. PMID: 24780768.

10. Huang R.Q., Chen Z., Dillon G.H. Molecular basis for modulation of recombinant alpha1beta2gamma2 GABAA receptors by protons. J Neurophysiol 2004; 92: 883-894. DOI: 10.1152/jn.01040.2003. PMID: 15028749.

11. Zhou C., Xiao C., Deng C., Hong Ye J. Extracellular proton modulates GABAergic synaptic transmission in rat hippocampal CA3 neurons. Brain Res 2007; 1145: 213-220. DOI: 10.1016/j.brainres.2007.01.121. PMID: 17321506.

12. Leng T.D., Si H.F., Li J. et al. Amiloride analogs as ASIC1a inhibitors. CNS Neurosci Ther 2016; 22: 468-476. DOI: 10.1111/cns.12524. PMID: 26890278.

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ. Фундаментальная неврология

Изучение эффектов золпидема и протонов

13. Chow K.M., Hui A.C., Szeto C.C. Neurotoxicity induced by beta-lactam antibiotics: from bench to bedside. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2005; 24: 649— 653. DOI: 10.1007/s10096-005-0021-y. PMID: 16261307.

14. Wilkins M.E., Hosie A.M., Smart T.G. Identification of a beta subunit TM2 residue mediating proton modulation of GABA type A receptors. J Neurosci 2002; 22: 5328-5333. DOI: 10.1523/JNEUR0SCI.22-13-05328.2002. PMID: 12097484.

15. Kisiel M., Jatczak-Sliwa M., Mozrzymas J.W. Protons modulate gating of recombinant aA^ GABAa receptor by affecting desensitization and opening transitions. Neuropharmacology 2019; 146: 300-315. DOI: 10.1016/j. neuropharm.2018.10.016. PMID: 30326242.

Информация об авторах

Солнцева Елена Ивановна — д.б.н., в.н.с. лаб. функциональной синаптоло-гии отдела исследований мозга ФГБНУ НЦН, Москва, Россия Буканова Юлия Викторовна — к.б.н., с.н.с. лаб. функциональной синапто-логии отдела исследований мозга ФГБНУ НЦН, Москва, Россия Скребицкий Владимир Георгиевич — член-корр. РАН, д.б.н., проф., зав. лаб. функциональной синаптологии отдела исследований мозга ФГБНУ НЦН, Москва, Россия

Information about the authors

Elena I. Solntseva — D. Sci. (Biol.), leading researcher, Laboratory of functional synaptology, Department of brain research, Research Center of Neurology, Moscow, Russia

Julia V. Bukanova — PhD (Biol.), senior researcher, Laboratory of functional synaptology, Department of brain research, Research Center of Neurology, Moscow, Russia

Vladimir G. Skrebitsky — D. Sci. (Biol.), Prof., Corr. Member of the Russian Academy of Sciences, Head, Laboratory of functional synaptology, Department of brain research, Research Center of Neurology, Moscow, Russia