CC BY
20
From Abroad
За рубежом
© Коллектив авторов,2020 УДК 614.2
Смагулова К. К., Кайдарова Д. Р., Насрытдинов Т. С.
ИЗУЧЕНИЕ ЧАСТОТЫ И СПЕКТРА ВСТРЕЧАЕМОСТИ МУТАЦИЙ ГЕНА KRAS У БОЛЬНЫХ КОЛОРЕКТАЛЬНЫМ
РАКОМ В РЕСПУБЛИКЕ КАЗАХСТАН
Казахский научно-исследовательский институт онкологии и радиологии, 050000 г. Алматы, Казахстан
Колоректальный рак является одним из наиболее распространенных злокачественным заболеваний в мире. В последнее десятилетие проблема стала особенно актуальной, что обусловлено не только увеличением числа метастатических форм опухолей толстой и прямой кишки, но и внедрением высокотехнологичных методов лечения, которые значительно улучшили результаты 5-летней выживаемости. Наряду с успехами терапии, понимание геномики кололректального рака, благодаря широкому использованию секвенирования следующего поколения, предоставило возможность оптимального выбора терапевтических опций.
Изучен опухолевый материал, фиксированный в формалине, заключенный в парафин, 332 пациентов с диагнозом колоректального рака, проходивших лечение в онкологических диспансерах, онкологических центрах и в Казахском научно-исследовательском институте онкологии и радиологии в 2010—2014 гг. После морфологической оценки качества исследуемого материала в лаборатории молекулярной генетики было проведено моле-кулярно-генетическое исследование по определению мутации гена KRAS методом полимеразной цепной реакции.
Результаты показали, что не отмечено четкой зависимости частоты мутации гена KRAS у больных от региона их проживания, так как при статистическом анализе для пары «регион проживания — все KRAS-мута-ции» значение коэффициента корреляции rp=0,1 (р=0,05). Высокая частота встречаемости мутированного типа гена выявлена в Кызыл-Ординской, Северо-Казахстанской и Алматинской областях. Дикий тип гена KRAS наиболее часто обнаруживался в Карагандинской, Южно-Казахстанской областях и г. Алматы. При оценке частоты случаев встречаемости дикого типа установлено, что число больных нуждающихся в тар-гетной терапии с ТКИ EGFR (метастатические формы), составило 55,1%. Ключевые слова: колоректальный рак; генетические мутации; мутация KRAS.
Для цитирования: Смагулова К. К., Кайдарова Д. Р., Насрытдинов Т. С. Изучение частоты и спектра встречаемости мутаций гена KRAS у больных колоректальным раком в Республике Казахстан. Проблемы социальной гигиены, здравоохранения и истории медицины. 2020;28(1):134—138. DOI: http://dx.doi.org/10.32687/0869-866X-2020-28-1-134-138 Для корреспонденции: Смагулова Калдыгуль Кабаковна, кандидат медицинских наук, заведующая отделением химиотерапии Казахского НИИ онкологии и радиологии, e-mail: akaldygul@mail.ru
Smagulova K. K., Kaydarova D. R., Nasrytdinov T. S. THE STUDY OF RATE AND SPECTRUM OF FREQUENCY OF MUTATIONS OF GENE KRAS IN PATIENTS WITH COLORECTAL CANCER IN THE REPUBLIC OF KAZAKHSTAN
The Kazakhstan Research Institute of Oncology and Radiology, 050000 Almaty, the Republic of Kazakhstan
The colorectal cancer is considered as the third most common malignant disease in the world. During last decade, the problem of colorectal cancer became especially urgent conditioned not only by increasing of number of metastatic tumors of colon and rectum, but also by implementation of high-tech methods of treatment that significantly improved the results of five-year survival period. Along with success of therapy, understanding of genomics of colorectal cancer and owing to extensive application of next generation sequencing, the opportunity of optimal choice of treatment options was offered. Methods. The sampling included tumor material of332 patients diagnosed with colorectal cancer, fixed in formalin and enclosed in paraffin, and treated in oncology dispensaries and centers and in the Kazakh Research Institute of Oncology and Radiology in 2010—2014. After morphological evaluation of the material quality, the molecular genetic analysis was applied to establish mutation of the KRAS gene using polymerase chain reaction in real-time.
Results. The study established that KRAS mutation rate in patients with colorectal cancer had no reliable dependency with the region of their residence, since statistical analysis of pair "region of residence — all KRAS mutations" had value of correlation coefficient rp = 0.1 (p = 0.05).
Conclusions. colorectal cancer It was established that there is no reliable dependence of rate of KRAS gene mutation in patients with colorectal cancer in the region of their residence. The high rate of occurrence of mutated type of gene was detected in 3 regions (Kyzyl-Orda, North Kazakhstan and Almaty) within the range of58.3—76.5% of cases. The wild type of KRAS gene was most frequently detected in patients from the Karaganda region (65.5%), South Kazakhstan (71.4%) and Almaty (60.7%).
Keywords: colorectal cancer; genetic mutation; KRAS mutation.
For citation: Smagulova K. K., Kaydarova D. R., Nasrytdinov T. S. The study of rate and spectrum of frequency of mutations of gene KRAS in patients with colorectal cancer in the Republic of Kazakhstan. Problemi socialnoi gigieni, zdravookhranenia i istorii meditsini. 2020;28(1):134—138 (In Russ.). DOI: http://dx.doi.org/10.32687/0869-866X-2020-28-1-134-138 For correspondence: Smagulova K. K., candidate of medical sciences, the Head of the Department of Сhemotherapy of the Kazakhstan Research Institute of Oncology and Radiology. e-mail: akaldygul@mail.ru Conflict of interests. The authors declare absence of conflict of interests. Acknowledgment. The study had no sponsor support
Received 08.09.2019 Accepted 28.11.2019
За рубежом
Введение
Колоректальный рак (КРР) является одним из наиболее распространенных онкологических заболеваний в мире, занимающим 3-е место в структуре смертности от злокачественных новообразований [1]. Ежегодно в мире регистрируется около 1 361 000 новых случаев КРР и около 694 600 пациентов ежегодно погибают от данной патологии. В экономически развитых странах на КРР приходится примерно 9—14% случаев онкологических заболеваний.
В 2016 г. в Республике Казахстан зарегистрировано 3158 больных КРР, 1484 умерли. В структуре смертности рак прямой кишки и рак ободочной кишки заняли 8-е и 5-е ранговые места соответственно [2].
Одним из наиболее значимых событий в молекулярном патогенезе КРР является активирующая мутация в онкогене КИАБ. Встречаемость мутации КИАБ в опухолях толстой кишки, по данным разных авторов, колеблется от 30 до 50% [3—6]. Вариации частоты мутаций КИАБ принято объяснять популя-ционными различиями образа жизни, характера питания, проживания в различных регионах мира [7].
При IV стадии или метастатической форме КРР основным методом лечения является химиотерапия в сочетании с таргетной терапией в зависимости от статуса КИАБ, назначение которой, по данным последних рандомизированных исследований, приводит к улучшению результатов лечения и увеличению выживаемости больных на 8—10 мес, по сравнению с только химиотерапией. Для определения контингента больных, нуждающихся в таргетной терапии, необходимым условием является определение статуса КИАБ. Наличие у пациентов с КРР дикого типа КИАБ служит основанием для проведения таргетной терапии ингибиторами тирозинкиназного домена (ТК1) рецептора ЕСТИ.
Целью исследования стала оценка частоты встречаемости дикого и мутированного типа гена КИАБ в различных регионах республики для определения пациентов, нуждающихся в таргетной терапии.
Материалы и методы
Материалом исследования явился фиксированный в формалине, заключенный в парафин опухолевый материал 332 пациентов с диагнозом КРР, проходивших лечение в онкологических диспансерах, онкологических центрах и в Казахском научно-исследовательском институте онкологии и радиологии (КазНИИОиР) за период 2010—2014 гг.
После морфологической оценки качества исследуемого материала в лаборатории молекулярной генетики было проведено молекулярно-генетическое исследование по определению мутации гена КИАБ методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). В зависимости от процентного содержания опухолевых клеток в образце для экстракции ДНК проводили 3—5 макродиссекций и депарафинизацию. Во избежание получения ложноотрицательных результатов
образцы, содержащие менее 20% опухолевых клеток, подвергали микродиссекции по заранее отмеченной морфологом зоне слайдов. Экстракцию ДНК проводили, используя коммерческие наборы (FFPE DNA extraction kit, Qiagen). Концентрацию экстрагированной ДНК определяли на спектрофотометре NanoDrop, качество ДНК оценивали с помощью постановки контрольной ПЦР в режиме реального времени, сравнивая с контрольной ДНК (входит в состав в коммерческого набора). KRAS-тест проводили, используя коммерческие наборы BioLink (Россия) для выявления мутаций в 12-м и 13-м кодонах экзона 2 аллель-специфичным ПЦР-методом.
Статистическая обработка материала производилась на персональном компьютере, в программе математической обработки данных пакета IBM SPSS Statistics 20 (trial-версия).
Результаты исследования
При исследовании 332 образцов опухолей больных КРР в 183 (55,1%) случаях выявлен дикий тип, а у 149 (44,9%) больных обнаружена мутация гена KRAS в экзонах 12 и 13 (табл. 1).
Из выявленных 149 мутаций наиболее часто (80,5%) мутации гена KRAS обнаруживались в кодо-не 12 в экзоне 2, в 29 (19,5%) образцах мутации выявлялись в кодоне 13 в экзоне 2 (табл. 2).
Из табл. 2 следует, что четкой зависимости частоты мутации гена KRAS у больных КРР от региона их проживания не установлено. Для пары «регион проживания — все KRAS-мутации» значение коэффициента корреляции rp = 0,1 (р = 0,05).
Для пары «регион проживания — GOA-мутация» значение коэффициента корреляции rp = 0,1 (р = 0,05), отмечается связь очень слабой силы между этими переменными. Для пары «регион проживания — G^C-мутация» значение коэффициента корреляции rp = 0,093 (р = 0,05). Корреляционная связь слабой силы отмечена между этими переменными. Для пары «регион проживания — G12D-мутация» значение коэффициента корреляции rp = 0,098 (р = 0,06), отмечена также связь очень слабой силы между переменными. Для пары «регион прожива-
Таблица 1 Статус гена KRAS в опухолевых образцах
Мутация Дикий тип KRAS-мутация
KRAS абс. % абс. %
Нет 183 55,1 0 0
Есть 0 0 149 44,9
Таблица 2
Спектр обнаруженных соматических мутаций в гене КЯАв и оценка связи с регионом проживания
Кодон G12A G12C G12D G12S G12V G13D Все мутации
Абс. число 20 7 48 8 37 29 149
% 13,4 4,7 32,2 5,4 24,8 19,5 100
rp 0,1 0,093 0,098 0,103 0,116 0,072 0,1
p-value 0,05 0,05 0,06 0,06 0,05 0,05 0,05
From Abroad
ния — G12S-мутация» значение коэффициента корреляции ^ = 0,103 (р = 0,06), получены схожие результаты корреляции с вышеуказанными данными. Для пары «регион проживания — G12V-мутация» значение коэффициента корреляции гр = 0,116 (р = 0,05), для пары «регион проживания — G13D-мутация» значение коэффициента корреляции гр = 0,072 (р = 0,05). Практически для всех видов мутации не установлено зависимости от места проживания.
Среди выявленных мутаций наиболее частой (48 из 149 больных) оказалась замена аминокислоты глицина на аспартат в 12-м кодоне (Gly12Asp). Далее по частоте мутации расположились следующим образом: Gly12Val — 37 (24,8%), Gly13Asp — 29 (19,5%), Gly12Ala — 20 (13,4%), Gly12Ser — 8 (5,4%) и Gly12Сys — 7 (4,7%).
В исследовании из 332 образцов опухолей в 183 случаях (55,1%) выявлен дикий тип гена КИАБ. Последние результаты исследований показали, что мутация является причиной резистентности к анти-EGFR терапии приблизительно в 35—40% случаев КРР. Определение дикого типа гена позволяет выделить новую подгруппу больных КРР, которым показано проведение таргетной терапии препаратами ан-ти-EGFR.
При изучении встречаемости дикого типа гена КИАБ у больных в различных областях республики показано, что наиболее часто (более 50%) дикий тип гена обнаружен в Южно-Казахстанской (71,4%), Карагандинской (65,5%), Восточно-Казахстанской (55,3%), Павлодарской (55,6%) областях и в г. Алма-ты (60,7%).
Нами оценена встречаемость мутации в 12-м и 13-м кодонах гена КИАБ у больных КРР по различным областям Республики Казахстан. Наибольшие значения этого показателя установлены в Алматин-ской (76,5%), Кызыл-Ординской (60%), Костанай-ской (52,4%) и Северо-Казахстанской (58,3%) областях. Низкая частота мутированного типа встречалась в Южно-Казахстанской (28,6%) и Карагандинской (34,5%) областях.
Установлено, что при КРР почти 90% всех нарушений представляют собой точечные замены одного нуклеотида на другой во втором экзоне генов КИАБ и ЫИАЗ, в последовательностях, кодирующих 12-ю и 13-ю аминокислоты. В норме в обеих позициях располагается глицин, единственная аминокислота, не имеющая боковой цепи. Любое изменение этой последовательности приводит к замене глицина на разветвленные аминокислоты, что ведет к нарушению пространственной конформации протеина. Нами проведено определение наиболее распространенных мутаций по областям Республики в 12-м и 13-м кодонах: G12C, G12S, G12V, G12D, G12A и G13D.
Изучение частоты встречаемости мутации G12A показало, что этот показатель в г. Алматы составил 35% случаев, в Алматинской области — 30%, в Карагандинской — 10%, в Северо-Казахстанской — 10%, в г. Астане, Восточно-Казахстанской и Мангыстау-ской областях — в 5% случаях.
Мутация G12C встречалась реже, и по разным областям Республики этот показатель составил в г. Ал-маты — 42,9% случаев, Костанайской области — 28,6%, Северо-Казахстанской — 14,3%, Южно-Казахстанской — 14,3% случаев. Среди всех изученных мутаций гена КИАБ наиболее часто встречаемая в кодоне 12 — G12D. При анализе встречаемости наибольшие показатели мутации гена G12D зафиксированы в г. Алматы в 17 (35,4%) случаях, в Восточно-Казахстанской области — в 6 (12,5%), в г. Астана — в 5 (10,4%), в Алматинской области — в 5 (10,4%); по частоте до 10% случаев — в Костанайской области (4; 8,3%), Карагандинской (4; 3%), Северо-Казахстан-ской (3; 6,3%), Павлодарской (2; 4,2%), Южно-Казахстанской (1; 2,1%) и Актюбинской (1; 2,1%).
Наиболее редкой мутацией явилась G12S, она встречалась у больных КРР следующих регионов: г. Алматы (3; 37,5%), Восточно-Казахстанской области (2; 25,0%), г. Астаны (1; 12,5%), Карагандинской области (1; 12,5%) и Павлодарской области (1; 12,5%).
Мутация G12V, т. е. замена аминокислоты глицин на валин, встречалась чаще, чем другие замены в аминокислотном составе. Наличие данной мутации отмечено во всех областях республики: в г. Алматы (22; 59,5%) случаев, г. Астана (2; 5,4%), в Алматин-ской (2; 5,4%), Костанайской (2; 5,4 %), Карагандинской (2; 5,4%), Жамбылской (2; 5,4%), Восточно-Казахстанской (1; 2,7%), Северо-Казахстанской (1; 2,7%), Кызыл-Ординской (1; 2,7%), Актюбинской (1; 2,7%) и Мангыстауской (1; 2,7%) областях.
Несмотря на то что мутация в 13-м кодоне встречается реже (в 4 раза), чем в 12-м кодоне, нашей целью также было изучение ее встречаемости у больных КРР Республики Казахстан. Наибольшие показатели мутации G13D обнаружены в г. Астана (8; 27,6%) случаев, Восточно-Казахстанской области (7; 24,1%), г. Алматы (5; 17,2%), Костанайской (3; 10,3%), Южно-Казахстанской (2; 6,9%), Кызыл-Ординской (2; 6,9%) и Павлодарской (4; 2,7%) областях.
Согласно данным разных клинических исследований, мутации гена КИАБ в опухолях КРР различных популяций вариабельны и встречаются в 30— 60% случаев [8—10]. Например, у афроамериканцев частота мутаций в гене КИАБ составляет 30,9% (п=222), у японцев — 37,6% (п=5790), у немцев — 49% (п=820).
Нами установлено, что частота мутации гена КИАБ в Республике Казахстан составила 44,9% (п=332). Полученные данные указывают на то, что частота встречаемости мутации гена КИАБ у больных КРР в различных областях республики была неравнозначной: в Алматинской, Кызыл-Ординской, Северно-Казахстанской областях частота мутации встречалась более чем в 50% случаях, тогда как дикий тип гена КИАБ наиболее часто обнаруживался в Карагандинской (65,5%), Южно-Казахстанской (71,4%) областях и г. Алматы (60,7%).
В проведенном исследовании опухолей с мутированным типом гена КИАБ (п=149) преобладающим
За рубежом
типом точечной мутаций оказались G12D (32,2%), О^ (24,8%) и G13D (19,5%) в 12-м и 13-м кодонах.
Точечная мутация — это тип мутации в ДНК или РНК, для которого характерна замена одного азотистого основания другим. Точечные мутации замены оснований классифицируют на транзиции и трансверсии. Транзиция — это замена одного пуринового основания на другое (аденин на гуанин или наоборот) либо аналогичная замена пиримидиновых оснований (тимин с цитозином). Трансверсия — это замена пуринового основания на пиримидиновое или наоборот. В точечной мутации транзиции происходят чаще, чем трансверсии [11].
Результатами многих исследований доказано, что наиболее часто встречающимися точечными мутациями при КРР являются транзиции (мутации G12D и G13D) с результирующей заменой глицина на аспа-рагиновую кислоту в белковой последовательности.
В Республики Казахстан среди больных КРР мутации G12D и G13D также встречаются чаще других, но, в отличие от установленных данных, нами обнаружена частая мутация G12V, т. е. замена глицина на валин. Известный факт, что транзиции могут происходить спонтанно в результате ошибок репликации ДНК под действием пищевых, генотоксических агентов и химических модификаций азотистых оснований [9]. В настоящее время проводится ряд исследований для определения факторов, влияющих на возникновение точечной мутации.
В нашем исследовании не прослеживается четкой зависимости частоты мутации гена KRAS у больных КРР в зависимости от региона проживания.
На основании данных ряда источников литературы, подтверждающих высокую частоту мутации гена KRAS при КРР в зависимости от локализации опухоли (чаще в дистальных отделах толстой кишки и прямой кишке) и наличия метастатических пораженных лимфатических узлов, можно предположить, что в указанных областях превалировали больные именно с такими же характеристиками.
По данным клинических исследований показано, что наличие мутации KRAS является причиной резистентности к анти-EGFR терапии приблизительно в 35—40% случаев заболевания. Определение дикого типа гена позволяет выделить новую подгруппу пациентов, которым показано проведение таргетной терапии препаратами анти-EGFR.
При проведении подсчета случаев встречаемости дикого типа по Республике Казахстан установлено, что число больных, нуждающихся в таргетной анти-EGFR терапии (метастатические формы) составило 55,1%, что не противоречит данным, полученным исследователями других стран.
Заключение
На основании проведенного исследования установлено, что четкой зависимости частоты мутации гена KRAS у больных КРР от региона их проживания нет.
Высокая частота встречаемости мутированного типа гена (58,3—76,5% случаев) выявлена в трех об-
ластях Республики: Кызыл-Ординской, Северо-Ка-захстанской и Алматинской. Дикий тип гена KRAS наиболее часто обнаруживали у больных Карагандинской области (65,5%), Южно-Казахстанской (71,4%) и г. Алматы (60,7%).
При оценке частоты случаев встречаемости дикого типа в Республике Казахстан показано, что число больных, нуждающихся в таргетной терапии с ТКИ EGFR (метастатические формы) составило 55,1%.
В Республике Казахстан нами впервые определена частота мутаций гена KRAS у больных КРР (44,9%), которая близка по своему значению к мировым показателям (~40%). Из этого следует, что такие пациенты нуждаются в определении статуса мутаций гена KRAS, играющего важную роль в определении стратегии лекарственного лечения.
Исследование не имело спонсорской поддержки. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА
1. World Health Organization. International agency for research on Cancer. GLOBOCAN 2012. Режим доступа: http://gco.iarc.fr/ (дата обращения 27.03.2019).
2. Кайдарова Д. Р., Чингисова Ж. К., Шатковская О. В. Показатели онкологической службы Республики Казахстан за 2016 г. (статистические материалы). Алматы; 2017.
3. Andreyev H. J., Norman A. R., Cunningham D., Oates J., Dix B. R., Iacopetta B. J. Kirsten ras mutations in patients with colorectal cancer: the 'RASCAL II' study. Br. J. Cancer. 2001;85:692—6. doi: 10.1054/bjoc.2001.1964
4. Brink M., de Goeij A. F., Weijenberg M. P., Roemen G. M., Lent-jes M. H., Pachen M. M. K-ras oncogene mutations in sporadic colorectal cancer in The Netherlands Cohort Study. Carcinogenesis. 2003;24:703—10. doi: 10.1093/carcin/bgg009
5. Jan-Sing H. APC, K-ras, and p53 gene mutations in colorectal cancer patients: correlation to clinicopathologic features and postoperative surveillance. Am. Surg. 2005;71(4):336—43.
6. Kaji E. Externalization of saw-tooth architecture in small-serrated polyps implies the presence of methylation of IGFBP7. Dig. Dis. Sci. 2012;57(5):1261—70. doi: 10.1007/s10620-011-2008-0
7. Мартынюк В. В. Рак ободочной кишки (заболеваемость, смертность, факторы риска, скрининг). Проблемы туберкулеза. 2000;1(1):3—9.
8. Samowitz W. S., Curtin K., Schaffer D. Relationship of Ki-ras mutations in colon cancers to tumour location, stage, and survival: a population-based study. Cancer Epidemiol. Biomark. Prev. 2010;(9):1193—7.
9. Hughes R. Dosedependent effect of dietary meat on endogenous colonic N-nitrosation. Carcinogenesis. 2001;22:199—202.
10. Wang D., Liang W., Duan X., Liu L., Shen H., Peng Y., Li B. Detection of KRAS gene mutations in colorectal carcinoma: a study of 6 364 patients. Zhonghua BingLi Xue Za Zhi. 2014;43(9):583—7.
11. Knipe D. M., Howley P. M. Fields Virology. Lippincott Williams & Wilkins; 2007.
Поступила 08.09.2019 Принята в печать 28.11.2019
REFERENCES
1. World Health Organization. International agency for research on Cancer. GLOBOCAN 2012. Available at: http://gco.iarc.fr/ (accessed 27.03.2019).
2. Kaydarova D. R., Chingisova Zh. K., Shatkovskaya O. V. Indicators of the oncological service of the Republic of Kazakhstan for 2016 [Po-kazateli onkologicheskoy sluzhby Respubliki Kazakhstan za 2016g.]. Statistical materials. Almaty; 2017 (in Russian).
3. Andreyev H. J., Norman A. R., Cunningham D., Oates J., Dix B. R., Iacopetta B. J. Kirsten ras mutations in patients with colorectal cancer: the 'RASCAL II' study. Br. J. Cancer. 2001;85:692—6. doi: 10.1054/bjoc.2001.1964
4. Brink M., de Goeij A. F., Weijenberg M. P., Roemen G. M., Lent-jes M. H., Pachen M. M. K-ras oncogene mutations in sporadic
From Abroad
colorectal cancer in The Netherlands Cohort Study. Carcinogenesis. 2003;24:703—10. doi: 10.1093/carcin/bgg009
5. Jan-Sing H. APC, K-ras, and p53 gene mutations in colorectal cancer patients: correlation to clinicopathologic features and postoperative surveillance. Am. Surg. 2005;71(4):336—43.
6. Kaji E. Externalization of saw-tooth architecture in small-serrated polyps implies the presence of methylation of IGFBP7. Dig. Dis. Sci. 2012;57(5):1261—70. doi: 10.1007/s10620-011-2008-0
7. Martynyuk V. V. Colon cancer (morbidity, mortality, risk factors, screening) Tuberculosis problems. 2000;4(1):3—9 (in Russian).
8. Samowitz W. S., Curtin K., Schaffer D. Relationship of Ki-ras mutations in colon cancers to tumour location, stage, and survival: a population-based study. Cancer Epidemiol. Biomark. Prev. 2010;(9):1193—7.
9. Hughes R. Dosedependent effect of dietary meat on endogenous co-lonic N-nitrosation. Carcinogenesis. 2001;22:199—202.
10. Wang D., Liang W., Duan X., Liu L., Shen H., Peng Y., Li B. Detection of KRAS gene mutations in colorectal carcinoma: a study of 6 364 patients. Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi. 2014;43(9):583—7.
11. Knipe D. M., Howley P. M. Fields Virology. Lippincott Williams & Wilkins; 2007.
