CC BY
42
УДК [619:616.22/-002.6]:636.52/.58(477.75)
Ключевые слова: изолят вируса инфекционного ларинготрахеита, куриные эмбрионы, биологические свойства
Key words: infectious laryngotracheitis virus isolate, chick embryos, biological properties
Стегний Б. Т., Воротилова Н. Г.
ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ИЗОЛЯТА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО ЛАРИНГОТРАХЕИТА КУР, ВЫДЕЛЕННОГО НА ТЕРРИТОРИИ АР КРЫМ
THE STUDY OF BIOLOGICAL PROPERTIES OF INFECTIOUS LARYNGOTRACHEITIS VIRUS ISOLATES OBTAINED FROM CHICKENS IN THE AUTONOMOUS REPUBLIC OF CRIMEA
'Национальный научный центр «Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины» Адрес: 61000, Украина, г. Харьков, ул. Пушкинская, 83. Тел. +38 (057) 704-10-90
'National Scientific Center "Institute of Experimental and Clinical Veterinary Medicine" Address: 61000, Ukraine, Kharkov, Pushkinskaya street, 83. Tel. +38 (057) 704-10-90 2Крымская опытная станция Национального научного центра «Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины» Адрес: 95494, Украина, АР Крым, г. Симферополь, пос. Комсомольский, ул. Садовая, 12-а. Тел. +38 (0652) 61-89-06 2Crimean Experimental Station of the National Scientific Center "Institute of Experimental and Clinical Veterinary Medicine" Address: 95494, Ukraine, the Autonomous Republic of Crimea, Simferopol, Komsomolsky, Sadovaya str., '2-a. Tel. +38 (0652) 61-89-06
Стегний Борис Тимофеевич, д. в. н., проф., академик Национальной академии аграрных наук Украины, директор1
Stegnij Boris T., Doctor of Veterinary Science, Professor, Member of the National Academy of Agrarian Sciences of Ukraine, Director' Воротилова Надежда Григорьевна, зав. лабораторией изучения болезней птиц2 Vorotilova Nadezhda G., Head of the Avian Diseases Laboratory2
Аннотация. В статье приведены данные по определению биологических свойств изолята вируса инфекционного ларинготрахеита, выделенного от павших кур 150-162-суточного возраста в период вспышки заболевания в одном из птицехозяйств АР Крым. Установлено, что характер поражений хорион-аллантоисной оболочки инфицированных эмбрионов был не постоянным. Появление первых изменений на хорион-аллантоисной оболочке инфицированных эмбрионов регистрировали в 75 % случаев через 72 часа инкубации, в 100 % случаев - через 96 часов инкубации. Вирулентность изолята вируса инфекционного ларинготрахеита курица/«Южная-Холдинг»/09/11 составляла 6,5±0,81 lg ЭИД50/0,2см3.
Summary. The article presents data on the determination of biological properties of infectious laryngotracheitis virus isolates obtainedfrom dead '50-'62-day-old chickens during an outbreak in one of the poultry farms in the Autonomous Republic of Crimea. Found that the nature of the lesions of chorioallantoic membrane of infected embryos was not constant. The appearance of the first changes in the chorioallantoic membrane of the infected embryos were recorded in 75 % of cases after 72 hours of incubation, '00 % after 96 hours of incubation. Virulence of infectious laryngotracheitis virus isolate chicken/»South-Holding»/09/'' was 6,5±0,8' lg EID5(/0,2 cm3.
Введение
Инфекционный ларинготрахеит (ИЛТ) -острая контагиозная болезнь птицы, которая характеризуется катарально-геморрагиче-ским и фибринозным воспалением слизистых оболочек верхних дыхательных путей и конъюнктивы [1, 9].
Возбудитель болезни - ДНК-геномный вирус, который принадлежит к семейству Herpesviridae. Вирионы сферической фор-
мы, диаметром 87-97 нм, покрытые внешней гликопротеиновой оболочкой. Штаммы вируса ИЛТ различаются по вирулентности для птицы и куриных эмбрионов (КЭ), тропизмом, скоростью выделения из клеток в тканевой культуре, стойкостью к условиям хранения, аввидностью, молекулярно-струк-турными особенностями. Иммунологических отличий среди штаммов вируса ИЛТ не обнаружено, хотя некоторые отклонения
в способности нейтрализоваться гипериммунными сыворотками описаны у штаммов различной вирулентности [1].
Вирус ИЛТ хорошо культивируется на хорион-аллантоисной оболочке (ХАО) КЭ, в первичной культуре клеток куриных фи-бробластов или почек КЭ, эпителии почек цыплят и утят, не развивается в эмбрионах голубей и морской птицы. Лабораторные животные к этому вирусу не восприимчивы [1, 3].
Исследования по выделению вируса и изучению его биологических свойств с целью изготовления вакцин проводили многие ученые: О. А. Полякова [7], С. Т. Щенников, О. А. Петровская [11], M. Cover [12], З. Я. Чистова, В. Н. Сюрин [10], М. Т. Прокофьева, В. Ф. Бабкин [8], Б. А. Мамчур [4], В. Ф. Макогон [5, 6], но, несмотря на многочисленные исследования в этом направлении, данный вопрос не теряет свою актуальность и сегодня, потому что болезнь регистрируется вновь и вновь, особенно в промышленном птицеводстве.
Целью нашей работы было исследовать биологические свойства изолята ИЛТ, выделенного от кур-несушек в одном из птицехо-зяйств АР Крым.
Материалы и методы исследования
Патологический материал отбирали от больных кур-несушек 150-162-суточного возраста. Для вирусологических исследований использовали легкие и трахею, которые готовили согласно ГОСТа 25582-83 «Птица сельскохозяйственная. Методы лабораторной диагностики инфекционных заболеваний» [2]. Индикацию возбудителя осуществляли путем инфицирования 10-11-суточных СПФ-куриных эмбрионов на ХАО по общепринятой методике. Инкубацию эмбрионов осуществляли в термостате при температуре 37,5 °С в течение 7 суток. После отмеченного срока инкубации, все эмбрионы охлаждали при плюс 4 °С в течение 8-12 часов и вскрывали. Отобранную экстра-эмбриональную жидкость (ЭЭЖ) исследовали отдельно от каждого эмбриона в реакции гемагглюти-нации (РГА) с 1 % суспензией эритроцитов петуха. Оценивали характер патологоана-
томических изменений на ХАО эмбрионов. Вирулентность изолята для КЭ определяли титрованием вирусного материала в разведении от 10-1 до 10-10, инокулированного на ХАО эмбрионов. На каждое разведение брали по 4 КЭ. Титром вируса (рассчитывали по методу Рида и Менча [13]) считали дозу, которая вызывала специфические поражения ХАО у 50 % инфицированных эмбрионов (ЕИД50 / 0,2 мл).
Для опыта по определению срока появления первых изменений на ХАО инфицированных эмбрионов брали 24 КЭ, которые инфицировали суспензией, приготовленной из ХАО 6-го пассажа изолята вируса ИЛТ. Через каждые 24 часа вскрывали по 4 эмбриона на протяжении 6 суток.
Патогенность выделенного изолята определяли на 60-суточных цыплятах, свободных от специфических антител. Цыплят инфицировали суспензией, приготовленной из ХАО инфицированных эмбрионов 6-го пассажа, интратрахеально в дозе 0,2 см3. Цыплятам контрольной группы (п = 10) интратрахе-ально вводили физиологический раствор в той же дозе. Наблюдали за опытными и контрольными цыплятами в течение 15 суток.
Исследования проводили в лаборатории изучения болезней птиц Крымской опытной станции Национального научного центра «Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины (г. Симферополь, АР Крым).
Результаты исследований и обсуждение
При эпизоотологическом обследовании трех птичников одного из птицехозяйств АР Крым (Украина) были установлены случаи заболевания и гибели кур-несушек 150-162-суточного возраста. Данная птица была вакцинирована в 60-дневном возрасте живой вакциной фирмы АуаРго ГЬТ (Ломан) однократно путем интраокулярного введения.
При определении относительных показателей эпизоотологического процесса данного заболевания установили, что заболеваемость кур составляла 100 % с незначительными показателями смертности (0,91 %) и летальности (1,82 %).
Клинические признаки болезни были от слабо выраженных (снижение аппетита, малоподвижность, угнетение) до ярко выраженных респираторных признаков заболевания: тяжелое дыхание, чихание, хрипы, тряска головой с открытым клювом. Клиническое проявление болезни наблюдали 2 недели, на протяжении которых лечение птицы не проводили, болезнь угасла постепенно.
При вскрытии павшей птицы наблюдали патологоанатомические изменения в гортани и трахее: слизистые оболочки были отечны, гиперемированны с многочисленными точечными кровоизлияниями, просвет гортани и трахеи заполнен катарально-геморрагиче-ским экссудатом. У некоторых птиц наблюдали в просвете гортани фибринозные пробки.
При проведении вирусологических исследований суспензии патологического материала на КЭ (результаты исследований
Рис. 1. Хорион-аллантоисная оболочка эмбриона (1 пассаж): А - инфицированного вирусом ИЛТ; Б - неинфицированного.
представлены в таблице 1) был выделен изо-лят вируса ИЛТ, которому присвоили название курица/«Южная-Холдинг»/09/11. Путем молекулярно биологического исследования патологического материала, которое было проведено в Федеральном государственном учреждении «Федеральный центр охраны животных» (г. Владимир, Россия), было обнаружено наличие ДНК вируса ИЛТ.
Данные таблицы 1 свидетельствуют о том, что в первом пассаже павших эмбрионов не регистрировали. Однако при их вскрытии в 50 % случаев наблюдали характерные поражения ХАО, которые характеризовались появлением мелких очажков некроза (узелков), утолщением и отечностью оболочки (рис. 1).
Во втором и третьем пассажах количество инфицированных эмбрионов с характерными признаками поражения ХАО возросло до 100 % (табл. 1). Изменился и характер па-
Рис. 2. Хорион-аллантоисная оболочка эмбриона (2-3 пассаж): А - инфицированного вирусом ИЛТ; Б - неинфицированного.
Таблица 1.
Вирусологические исследования материала от павших кур
Номер пассажа Наименование Процент погибших Процент КЭ Наличие
органов, из которых эмбрионов с характерными гемагглютинации
выделен вирус % / через, часов признаками +/-
1 легкие 0 0 -
трахея 0 50 -
2 легкие 0 0 -
трахея 0 100 -
3 трахея 0 100 -
4 трахея 0 75 -
5 трахея 0 100 -
6 трахея 0 50 -
» * т||
'1Д
/ 1
тологоанатомических изменений: на ХАО в месте некротических очагов появились некротические тяжи в виде конгломератов. Регистрировали отечность ХАО (рис. 2). В четвертом пассаже количество эмбрионов с поражениями снизилось до 75 %, против третьего пассажа, где регистрировали 100 % поражение эмбрионов. Изменился характер поражений ХАО: снова появились некротические очажки в виде узелков размером с просяное зерно. Аналогичная картина изменений ХАО наблюдалась в пятом и шестом пассажах. Разница была в количестве эмбрионов с поражением ХАО: в пятом пассаже -100 %, в шестом - 50 %. Гемагглютинирую-щей активностью данный изолят не обладал.
Результаты, по определению срока появления первых изменений на ХАО инфицированных изолятом вируса ИЛТ эмбри-
онов, приведены в таблице 2. При анализе данных таблицы прослеживается динамика появления первых изменений на ХАО инфицированных эмбрионов: через 24-48 часов инкубации изменений на ХАО не обнаружено, через 72 часа первые изменения на ХАО появляются у трех эмбрионов, что составляло 75 %. Эти изменения имеют характер единичных мелких узелков. Через 96 часов инкубации количество узелков и их размер увеличились у 75 % эмбрионов. Через 5-6 суток инкубации изменения на ХАО характеризовались отеком оболочки и массовыми узелками на ее поверхности. Вирулентность изолята вируса ИЛТ курица/«Южная-Холдинг»/09/11, которую определяли путем инфицирования КЭ разведениями вируса от 10-1 до 10-10 и рассчитывали по методу Рида и Менча, составляла 6,5±0,81 ^ ЭИД50/0,2см3.
Таблица 2.
Определение срока появления первых изменений на ХАО эмбрионов, инфицированных изолятом вируса ИЛТ
Срок инкубации, ч. Эмбрион Наличие изменений на ХАО Характер изменений на ХАО
1 Нет -
24 2 Нет -
3 Нет -
4 Нет -
1 Нет -
48 2 Нет -
3 Нет -
4 Нет -
1 Появление единичных мелких узелков
72 2 Появление единичных мелких узелков
3 Появление единичных мелких узелков
4 Нет -
1 Количество узелков и их размер увеличены
96 2 Количество узелков и их размер увеличены
3 Количество узелков и их размер увеличены
4 Появление единичных мелких узелков
1
120 2 ХАО отечна, по всей поверхности узелки
3
4
1
144 2 ХАО отечна, по всей поверхности узелки
3
4
При определении патогенности изолята вируса ИЛТ курица/«Южная-Холдинг»/09/11 на 60-суточных цыплятах установили, что данный изолят был слабопатогенным для опытных цыплят, так как на протяжении 15 суток наблюдения ни один цыпленок не заболел, однако при вскрытии вынужденно забитых цыплят в 30 % случаев наблюдали патологоанатомические изменения в гортани и трахее, которые характеризовались гиперемией и точечными кровоизлияниями. При серологических исследованиях крови от опытных цыплят получен средний титр антител к вирусу ИЛТ, который составлял 3,8±0,22 При последующем инфицировании КЭ материалом от опытных цыплят установлены патологоанатомические изменения на ХАО эмбрионов в виде мелких некротических очажков (узелков).
Выводы
1. Вспышка инфекционного ларинготрахе-ита в одном из птицехозяйств АР Крым возникла среди вакцинированных 150-162-су-точных кур-несушек при этом заболеваемость составила 100 %, смертность - 0,91 %, летальность 1,82 %. Вирусологическими исследованиями патологического материала от данной птицы на КЭ выделен изолят вируса ИЛТ курица/«Южная-Холдинг»/09/11.
2. При определении биологических свойств изолята курица/«Южная-Холдинг»/09/11 установлено, что характер поражений ХАО инфицированных эмбрионов был не постоянным: от мелких узелков в первом пассаже до разлитых некротических конгломератов в 2-3 пассажах. Появление первых изменений на ХАО инфицированных эмбрионов регистрировали в 75 % случаев через 72 часа инкубации, в 100 % случаев -через 96 часов инкубации.
3. Изолят вируса инфекционного ларин-готрахеита курица/«Южная-Холдинг»/09/11 был слабопатогенным для опытных цыплят. Клинических проявлений заболевания у них не регистрировали, однако при вскрытии
птицы были обнаружены патологоанатоми-ческие изменения в гортани и трахее у 30 % цыплят. Вирулентность изолята составляла 6,5±0,81 lg ЭИД50/0,2см3.
Список литературы
1. Вирусные болезни животных [Текст] / В. Н. Сю-рин [и др.]. - М. : ВНИТИБП, 1998. - С. 308-309.
2. ГОСТ 25581-91 «Птица сельскохозяйственная. Методы лабораторной диагностики инфекционного ларинготрахеита».
3. Каришева, А. Ф. Специальная эпизоотология [Текст] : учебник / А. Ф. Каришева. - К. : Высшее образование, 2002. - 703 с.
4. Мамчур, Б. А. Изучение инфекционного ларинготрахеита индеек в эксперименте и естественных условиях [Текст] : Автореф. дис. ... канд. вет. наук / Б. А. Мамчур. - О. - 1969. - 20 с.
5. Макогон, В. Ф. Изучение биологических свойств вируса инфекционного ларинготрахеита птиц в клеточных культурах [Текст] / Автореф. дис. ... канд. вет. наук / В. Ф. Макогон. - Х. - 1973. - 20 с.
6. Макогон, В. Ф. Производственная проверка окулярного метода вакцинопрофилактики инфекционного ларинготрахеита птиц [Текст] / В. Ф. Макогон, А.И. Доценко // Всесоюзная научно-практич. пезисов докл. - Сумы, 1989. - С. 198-199.
7. Полякова, О. А. Инфекционный ларинготра-хеит птиц [Текст] / О. А. Полякова // Ветеринария. -1951. - № 2. - С. 29-32.
8. Прокофьева, М. Т. Культивирование вируса инфекционного ларинготрахеита в развивающихся перепелиных и гусиных эмбрионах [текст] / М. Т. Прокофьева, Б. А. Мамчур, В. Ф. Бабкин // Материалы I-II вет. вирус. конф., М. - 1970. - Ч. 1. - С. 46-47.
9. Самуйленко, А. Я. Инфекционная патология животных. Инфекционный ларинготрахеит птиц [Текст] /
A. Я. Самуйленко [и др.]. - М. : ИКЦ Академкнига, 2006. - Т. 1. - С. 702-709.
10. Чистовая, З. Я. О вариантах вируса инфекционного ларинготрахеита кур [Текст] / З. Я. Чистовая,
B. Н. Сюрин // Вопросы ветеринарной вирусологии. -М., 1964. - Т. i. - С. 413-425.
11. Щенников, С. Т. Активная иммунизация кур против инфекционного ларинготрахеита [Текст] /
C. Т. Щенников, Е. А. Петровская // Ветеринария. -1954. - № 3 - С. 42-46.
12. Cover, M. S. The biological variation of ILT virus [Text] / M.S. Cover, W.J. Benton // Avian Disease. -1958. - V 2. - P. 375-383.
13. Reed, L. J. A simple method of estimating fifty percent end points [Text] / L.J. Reed, H. Muench // Am J. Hyg. - 1938. - V. 27. - P. 493-497.
Архивы номеров журнала: www.invetbio.spb.ru/journal/vp_main.htm
