CC BY
6ISSN: 2181-3337 | SCIENTISTS.UZ
INTERNATIONAL SCIENTIFIC JOURNAL SCIENCE AND INNOVATION
ISSUE DEDICATED TO THE 80TH ANNIVERSARY OF THE ACADEMY OF SCIENCES OF THE REPUBLIC OF UZBEKISTAN
ИЗУЧЕНИЕ БИОАКТИВНЫХ СВОЙСТВ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ ЭНДОФИТА ASPERGILLUS FISCHERI VO1R М.М.Йулдошева, Д.М.Рузиева, Г.А.Расулова, Т.Г.Гулямова https://doi.org/10.5281/zenodo.8372583
Аннотация. Ингибирование панкреатической липазы (ПЛ) является одним из наиболее изученных механизмов определения потенциальной эффективности натуральных продуктов в качестве средств против ожирения. В статье обсуждается биологическая активность этилацетатного экстракта вторичных метаболитов, ингибирующих ПЛ (91,5 %) Aspergillus fischeri VOIR, выделенного из корня растения Viola odorata. Антиоксидантную активность тестировали по удалению свободных радикалов ДФПГ и перекиси водорода. Экстракт Aspergillus fischeri VOIR в обоих тестах проявлял антиоксидантную активность со значениями IC50 301 и 246 мкг/мл, сравнимыми с IC50 аскорбиновой кислоты в качестве стандарта. Противовоспалительная активность экстракта составила 79,3% и превысила действие аспирина (74,5%). Установлено, что этилацетатный экстракт A.fischeri VOIR оказывает антибактериальное действие в отношении условных возбудителей P.aeruginosa, C.albicans. Фитохимический анализ показал, что в составе экстракта присутствуют флавоноиды, терпеноиды и алкалоиды.
Таким образом, выявленное комплексное ПЛ ингибирующее, антиоксидантное, противовоспалительное и антибактериальное действие in vitro действие экстракта метаболитов позволяет заключить, что эндофит Aspergillus fischeri VOIR может быть использован для разработки новых препаратов для лечения ожирения.
Ключевые слова: ожирение, эндофитные грибы, вторичные метаболиты, флавоноиды, панкреатическая липаза, ингибирующая активность, антиоксиданты, противовоспалительная активность, антибактериальная активность.
Аннотация. Табиий бирикмалардан самарадор, семиришга царши Панкреатик Липаза (ПЛ) ингибиторларининг яратилиши энг куп урганилган илмий механизмлардан биридир. Мацолада Viola odorata усимлиги илдизидан ажратилган Aspergillus fischeri VOIR эндофит замбуругининг ПЛни ингибирловчи (91,5%) этилацетат экстракти иккиламчи метаболитларининг биологик фаоллиги мууокама цилинади. Антиоксидант фаоллик ДФПГ ва водород перикснинг эркин радикалларини тозалаш орцали та^лилдан утказилди. Aspergillus fischeri VOIR экстрактининг %ар иккала та^лилда щм антиоксидант фаоллиги стандарт - аскорбин кислотага цараганда, IC50 цийматлари 301 ва 246 мкг/млни ташкил этди. Экстрактнинг яллигланишга царши фаоллиги аспирин таъсири (74,5%)дан юцори булиб, 79,3% ни ташкил этди. A.fischeri VO1Rнинг этилацетат экстракти P.aeruginosa, C.albicans шартли патоген микроорганизмларига царши антибактериал таъсир курсатиши аницланди. Фитокимёвий та^лиллар экстракт таркибида флавоноидлар, терпеноидлар ва алкалоидлар мавжудлигини курсатди.
Шундай цилиб, комплекс ПЛ ингибитори сифатида аницланган Aspergillus fischeri VO1R эндофит замбуруги иккиламчи метаболитларининг антиоксидант, яллигланишга царши ва антибактериал фаолликлари юцорилигини инобатга олиб, семизликни даволашда цулланиладиган янги дориларни ишлаб чициш учун асос булиб хизмат цилиши мумкин деган хулосага келиш имконини беради.
Калит сузлар: семизлик, эндофит замбуруглар, иккиламчи метаболитлар, флавоноидлар, ошцозон ости бези липазаси, ингибитор фаоллик, антиоксидантлар, яллигланишга царши фаоллик, антибактериал фаоллик.
Abstract. Pancreatic lipase (PL) inhibition is one of the most studied mechanisms for determining the potential effectiveness of natural products as antiobesity agents. The article discusses the biological activity of an ethylacetate extract of secondary metabolites that inhibit PL (91.5%) of Aspergillus fischeri VOIR,, isolated from the root of the Viola odorata plant. Antioxidant activity was tested by scavenging free radicals of DPPH and hydrogen peroxide. Aspergillus fischeri VOIR extract exhibited antioxidant activity in both tests with IC50 values of 301 and 246 ^g/ml, comparable to the IC50 of ascorbic acid standard. The anti-inflammatory activity of the extract was 79.3% and exceeded the effect of aspirin (74.5%). It has been established that the ethylacetate extract of A.fischeri VOIR has an antibacterial effect against the conditional pathogens P.aeruginosa, C.albicans. Phytochemical analysis showed that the extract contains flavonoids, terpenoids and alkaloids.
Thus, the revealed complex PL inhibitory, antioxidant, anti-inflammatory and antibacterial effects in vitro of the action of the metabolite extract allow us to conclude that the endophyte Aspergillus fischeri VOIR can be used to develop new drugs for the treatment of obesity.
Keywords: obesity, endophytic fungi, secondary metabolites, flavonoids, pancreatic lipase, inhibitory activity, antioxidants, anti-inflammatory activity, antibacterial activity.
Введение
Ожирение — распространенное хроническое нарушение липидного обмена, характеризующееся избыточным накоплением жировой ткани [1, 2]. По данным Всемирной организации здравоохранения, клиническое ожирение затрагивает примерно 300 миллионов из более чем 1 миллиарда взрослых людей с избыточным весом в мире [3, 4]. С другой стороны, избыточный вес и ожирение являются значимыми факторами риска развития диабета, ишемической болезни сердца, гипертонии, гиперлипидемии, атеросклероза и других хронических заболеваний [4]. В связи с этим одной из задач политики здравоохранения во многих странах является обращение вспять нынешних тенденций роста распространенности избыточной массы тела и ожирения [5, 6].
Существенной трудностью в определении лечения и профилактики заболевания является многофакторное происхождение этиологии, связанное с окислительным стрессом и хроническим воспалением у людей с ожирением [7, 8]. Было проведено множество научных исследований по лечению ожирения [9]. Одним из терапевтических подходов к профилактике ожирения является замедление всасывания жирных кислот путем ингибирования липазы в органах пищеварения [10, 11]. Панкреатическая липаза (триацилглицеролацилгидролаза, ПЛ), которая катализирует гидролиз трилглицеридов в желудочно-кишечном тракте, является ключевым ферментом всасывания липидов. На его долю приходится 50-70% гидролиза всех пищевых жиров. Таким образом, ингибирование ПЛ является одним из наиболее широко изученных механизмов определения потенциальной эффективности натуральных продуктов в качестве средств против ожирения [11].
Орлистат, производное липстатина, полученное из Streptomyces toxytricini, является единственным ингибитором ПЛ, одобренным FDA для лечения ожирения [12, 13]. В то же время препарат имеет множество нежелательных побочных эффектов, таких как повышение артериального давления, бессонница, головная боль, сухость во рту и другие [14]. Тем не менее, успех Орлистата стимулировал исследования по выявлению новых ингибиторов ПЛ, полученных из природных источников, таких как Anthemis palaestina Boiss., Ononis natrix L. [15], and Sapindus rarak DC. [16] and oolong tea [17].
Эндофиты - бессимптомно живущие внутри тканей растений, были идентифицированы как богатый источник уникальных химических структур для фармацевтических, сельскохозяйственных и других целей. [18,19]. Альтернативой растительным источникам ингибиторов ферментов являются микробные природные продукты, особенно вторичные метаболиты эндофитных грибов лекарственных растений [20]. Эндофитные грибы продуцируют широкий спектр биоактивных соединений различных химических классов, таких как алкалоиды, терпеноиды, флавоноиды, хиноны, стероиды и фенольные кислоты, обладающие противомикробными, противораковыми и иммуномодулирующими свойствами, а также ингибирующей активностью в отношении ряда ферментов [18,21].
В нескольких исследованиях было обнаружено, что вторичные метаболиты эндофитных грибов могут ингибировать активность липазы поджелудочной железы [2226]. В частности, Gupta et al. [23, 24] провели скрининг культуральных фильтратов 70 эндофитных грибов, выделенных из Aegle marmelos. Высокий ингибирующий потенциал ПЛ был обнаружен у изолята 57TBBALM со значением IC50 3,69 мг/мл, что сравнимо с IC50 орлистата (2,73 мг/мл) в качестве положительного контроля [23]. Sarkar et al. [25] оценили ПЛ ингибирующую активность 39 эндофитных грибов из лекарственных растений Андаманских островов. Наибольший ингибирующий потенциал проявился у 2 штаммов, выделенных из Citrus Lemon и Aegle Marmelos, с активностью 75% и 83% соответственно. При дифференциальной экстракции ингибирующих метаболитов в различных растворителях гексановый экстракт эндофита 9CLHTAI из C. лимона содержит вещество с активностью 87% и IC50 15,46 мкг/мл.
Ранее мы выделили из различных растений Узбекистана несколько эндофитных грибов, способных ингибировать активность панкреатической липазы [27]. Aspergillus fischeri VO1R был выделен из корня Viola odorata, продуцирующего вторичные метаболиты с ингибирующей активностью не менее 70 % при экстракции этилацетатом. Целью данного исследование биологической активности вторичных метаболитов, которые опосредуют сильный ингибирующий эффект ПЛ экстракта Aspergillus fischeri VO1R [28].
Материалы и методы.
Культивирование эндофитного штамма. Эндофиты выращивали глубинным методом на среде Чапека-Докса при 28°С в течение семи дней на орбитальном шейкере при 120 об/мин. Биомассу отделяли центрифугированием при 6000 об/мин и хранили при +4°С.
Экстракция вторичных метаболитов. Выделение вторичных метаболитов осуществляли по Hazalin et al. [29]. 5 г мицелиальной массы гомогенизировали, переносили в конические колбы с 50 мл растворителя и оставляли на сутки на шейкере
при комнатной температуре. Смесь фильтровали через бумагу (ватман №1) и добавляли Na2SO4 (40 мкг/мл) для удаления водного слоя. Затем экстракты упаривали досуха и добавляли 1 мл диметилсульфоксида (ДМСО). Полученные экстракты использовали в качестве исходного сырья и хранили при температуре +4°С.
Определение уровня ингибирования панкреатической липазы. Активность панкреатической липазы свиньи (ПЛ) количественно оценивали с помощью колориметрического анализа по высвобождению п-нитрофенола с использованием п-нитрофенилпальмитата (PNPP) в качестве субстрата [30]. 50 мг липазы (Sigma, 100 ед/мл) суспендировали в 10 мл трис-НС1-буфера (2,5 ммоль, pH 7,4, с 2,5 ммоль NaCl). Раствор интенсивно встряхивали в течение 15 мин, центрифугировали при 4000 об/мин в течение 10 мин и собирали надосадочную жидкость. Экстракты и ксеникал в качестве положительного контроля готовили в ДМСО с линейными концентрациями в диапазоне 1,56-2000 мкг/мл и 0,78-1000 мкг/мл соответственно. Реакционную смесь, состоящую из 875 мкл буфера, 100 мкл фермента и 20 мкл экстракта в различных начальных концентрациях, предварительно инкубировали в течение 5 мин при 37 °C. Затем реакцию начинали добавлением 10 мкл п-нитрофенилпальмитата (PNPP) в качестве субстрата. После инкубации при 37°С в течение 1 часа количество выделившегося п-нитрофенола измеряли на спектрофотометре (UV-5100 Китай) при 405 нм, процент ингибирования рассчитывали по формуле:
% ингибирования = [(Ае-Ат)/ Ae]x100, где Ae — оптическая плотность ферментного контроля (без ингибитора), At — разность оптической плотности исследуемого образца с субстратом и без него.
Определение антиоксидантной активности по удалению свободных радикалов ДФПГ (1,1 -дифенил-2-пикрилгидразил).
Для проверки антиоксидантной активности за счет поглощения свободных радикалов тестируемыми образцами отслеживали изменение оптической плотности радикалов ДФПГ [31]. Готовили различные разведения водного экстракта (100, 200, 300, 400 и 500 мкг/мл). Раствор ДФПГ готовили в этаноле согласно Blois et al. [32]. К 1 мл препаратов экстрактов из каждого разведения добавляли по 1 мл 0,2 мМ ДФПГ и инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин. В качестве контроля использовали смесь 1 мл этанола и 1 мл раствора ДФПГ (без экстракта), в качестве стандарта использовали аскорбиновую кислоту. Оптическую плотность определяли при 517 нм. Формула рассчитывала процент активности поглощения свободных радикалов:
% активности = (Ac - As)/Ac х 100, где Ac - поглощение контроля; As -поглощение образца.
Определение антиоксидантной активности по поглощению радикалов перекиси водорода (H2O2)
Активность грибковых экстрактов по удалению перекиси водорода оценивали по методу Govindappa et al. [31]. Готовили раствор перекиси водорода (40 ммоль/л) в фосфатном буфере (50 ммоль/л, рН 7,4). Концентрацию перекиси водорода определяли по поглощению при 230 нм с помощью спектрофотометра. Экстракты эндофитов (100, 200, 300, 400 и 500 мкг/мл) в дистиллированной воде добавляли к перекиси водорода и через 10 мин определяли оптическую плотность при 230 нм относительно контрольного
раствора, содержащего фосфатный буфер без перекиси водорода. Процент поглощения перекиси водорода рассчитывали следующим образом: H2O2 (%) = [(Ai -At)/Ai]x100, где Ai — поглощение контроля, а At — поглощение испытуемых образцов.
Противовоспалительная активность in vitro
Противовоспалительную активность экстрактов оценивали по подавлению денатурации альбумина [33]. Исследуемый образец состоял из экстракта эндофитов выбранной концентрации (100-500 мкг/мл) и 1% водного раствора бычьего сывороточного альбумина (Sigma). pH реакционной смеси доводили до 6,5 с помощью 1 н HCl и инкубировали при 37°C в течение 20 минут. Затем инкубационную смесь нагревали при 57°С в течение 10 минут. Процесс денатурации останавливали охлаждением образцов. Мутность полученных растворов измеряли на спектрофотометре при длине волны 660 нм. Диклофенак натрия или аспирин в концентрации, аналогичной экспериментальному экстракту, использовали в качестве стандарта. Ингибирование денатурации белка (Х) выражали в процентах и рассчитывали по формуле: Х=(А0-Ат)/А0*100, где А0 -оптическая плотность контроля; Ат - оптическая плотность исследуемого образца.
Определение антибактериальной активности
Антимикробную активность эндофитного гриба Aspergillus fischeri VO1R определяли методом хорошо диффузионного агара. Грамположительные бактерии включают Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis; Использовали грамотрицательные бактерии Pseudomonas aeruginosa и Escherichia coli. Также использовался условно-патогенный гриб Candida albicans.
Все бактериальные суспензии готовили в соответствии со стандартом МакФарланда с концентрацией 1,5*108 КОЕ/мл. Бактериальные суспензии разливали в количестве 0,5 мл, инокулировали на поверхность среды мясо-пептонного агара (ГПА) в чашки Петри и инкубировали в течение 15 минут. Экстракты разводили ДМСО до концентрации 10 мг/мл. Цефтриаксон - 30 мкг/диск антибиотика использовали в качестве положительного контроля. ДМСО принимали в качестве отрицательного контроля. Затем по 100 мкл образцов помещали в лунки чашек Петри. После инкубации чашек Петри при 37 o C в течение 24 часов измеряют площадь ингибирования.
Эксперименты проводились в трех повторностях.
Результаты и обсуждение
Эндофитные грибы являются обильным и надежным источником новых антиоксидантных соединений, о чем свидетельствует достаточное количество сообщений об антиоксидантных свойствах эндофитных метаболитов [34, 36]. Например, Yadav et. al. продемонстрировали, что метаболиты, продуцируемые эндофитными грибами, выделенными из Eugenia jambolana, могут быть потенциальным источником новых природных антиоксидантных соединений с использованием трех методов определения антиоксидантной активности [37]. Gautam et al. обнаружили, что этилацетат
экстрагирует наиболее значительное количество общих фенолов и флавоноидов из эндофитной Nigrospora sphaerica, выделенной из пантропического сорняка Euphorbia hirta L., что положительно коррелирует с антиоксидантной активностью. Одновременно в составе фенольных соединений были обнаружены соединения с ингибирующей активностью, подобной кверцетину [38].
Согласно ранее полученным данным [28], ПЛ ингибирующая активность экстрактов Aspergillus fischeri VO1R в основном связана с флавоноидами и терпеноидами. Стоит отметить, что флавоноиды и терпены являются основными химическими компонентами, ответственными за снижение перекисного окисления липидов [39].
В этой связи представляло интерес определение антиоксидантной активности активность экстракта Aspergillus fischeri VO1R, обладающего высокой ПЛ ингибиторной активностью.
Так, антиоксидантную активность измеряли спектрофотометрически по удалению свободных радикалов ДФПГ. Установлено, что в диапазоне концентраций экстракта от 100 до 500 мкг/мл изменение активности поглощения свободных радикалов коррелировало с повышением концентрации, возрастая с 15% до 81,3% при 500 мкг/мл (табл.1).
Рассчитанное значение IC50 этилацетатного экстракта было сравнимо с IC50 аскорбиновой кислоты как стандарта (288 мкг/мл) и составляло 301 мкг/мл.
Таблица 1. Антирадикальная активность ДФПГ этилацетатного экстракта Aspergillus fischeri VO1R
№ Концентрация мкг/мл Антирадикальная активность (%)
Аскорбиновая кислота, % IC50 мкг/мл Экстракт, % IC50 мкг/мл
1 100 21,5 15,6
2 200 33,4 288 29,7 301
3 300 44,2 45,3
4 400 86 64,1
5 500 97,5 81,3
При определении антиоксидантной активности по поглощению перекиси наблюдалась такая же корреляционная зависимость от концентрации экстракта (табл.2).
Наибольшая антиоксидантная активность составила 78,4% при 500мкг/мл, в то время как активность стандартной аскорбиновой кислоты в той же концентрации составляло 70,5%.
Таблица 2. Антиоксидантная активность экстракта Aspergillus fischeri VOIR по абсорбции H202
Анализ абсорбции H202, %
№ Концентрация мкг/мл Аскорбиновая кислота, % IC50 мкг/мл Экстракт, % IC50 мкг/мл
1 100 10,4 15,8
2 200 25,8 30,4
3 300 30,4 300 45,5 246
4 400 45,2 61,5
5 500 70,5 78,4
Соответственно, значение 1С50 по этому методу было заметно ниже, 246 мкг/мл по сравнению со стандартным 1С50, равным 300 мкг/мл (рис.1).
350
^H 300
^H 250
^H 200
^H 150
^H 100
^H 50
0
ДФПГ Н2О2
■ экстракт A.flsheri VOR1
Рис.1.Значения IC50 антиоксидантной активности экстракта Aspergillus fischeri VOIR и аскорбиновой кислоты.
Результаты этого исследования согласуются с рядом сообщений об антиоксидантной активности эндофитных грибов. Так, высокая антиоксидантная активность, составляющая 96,80%, наблюдалась в этилацетатном сыром экстракте Nigrospora sphaerica, ферментированном на картофельно-декстрозном бульоне наблюдалась [38]. Экстракты A. nidulans и A. flavus, выделенные из Ocimum basilicum, также продемонстрировали потенциальную антиоксидантную активность с IC50 166,3 г/мл и 347,1 г/мл соответственно при использовании ДФПГ [40].
Противовоспалительную активность экстракта Aspergillus fischeri VOIR определяли по денатурации альбумина, в качестве положительного контроля использовали аспирин. Ингибирование денатурации альбумина также имело прямую зависимость от концентрации экстракта, достигая максимумав 79,3% при 500 мкг/мл, что превышало положительный контроль (74,5%) (табл.3).
Таблица 3. Противовоспалительная активность Aspergillus fischeri VO1R по данным анализа денатурации альбумина.
№ Концентрация мкг/мл Аспирин, % % ингибирование
1 100 25,8 31,2
2 200 36,4 40,2
3 300 49,2 55,2
4 400 60,2 60,5
5 500 74,5 79,3
Известно, что при использовании синтетических ингибиторов ПЛ в лечении ожирения непереваренные, негидролизованные жирные кислоты накапливаются в толстом кишечнике и создают благоприятные условия для роста патогенных микроорганизмов. Поэтому изучение антибактериальной активности природных ингибиторов ПЛ приобретает особую важность.
Антибактериальные свойства общего ингибиторного экстракта Aspergillus fischeri VOIR оценивали по подавлению роста грамположительных бактерий Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis; грамотрицательных положительной Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa, и дрожжей Candida albicans (рис.2, табл.4).
Условно-патогенный гриб Грамотрицательные бактерии
Candida albicans Pseudomonas aeruginosa
288
Рис. 2. Антибактериальная активность этилацетатного экстракта Aspergillus fischeri VO1R. (VO1R' - Aspergillus fischeri VOIR; К -ДМСО ; Фл.-флуконазол, Цфр-цефтриаксон.
Как видно из представленных данных, экстракт не оказывал антибактериального действия на грамположительные бактерии, но ингибировал зоны роста Candida albicans до 17±0,17 мм и Pseudomonas aeruginosa до 14±0,16 мм (табл. 4). В качестве положительного контроля на Candida albicans использовали флуконазол, зона ингибирования которого составила 52±0,03 мм.
Таблица 4. Зоны ингибирования роста патогенных микроорганизмов суммарного этилацетатного экстракта эндофитного гриба Aspergillus fischeri VO1R.
Обозначение Экстракт Зона подавления (мм)
Грамотрицательные бактерии Грамположительные бактерии Условно-патогенный гриб
E.coli P.aeruginosa S.aureus B.subtilis C.albicans
VO1R A.fischeri VO1R (суммарный этилацетатный экстракт) - 14 - - 17
K Контроль Цефтриаксон 50 50 55 54 -
K Контроль Флуконазол - - - - 52
Таким образом, совокупность полученных данных показывает, что эндофит Aspergillus fischeri VO1R продуцирует экстрагируемых вторичные метаболиты, обладающие наряду с высокой ингибиторной активностью к панкреатической липазе, также сильное антиоксидантное, противовоспалительное и умеренное антимикробное действие. Учитывая, что в составе метаболитов экстракта содержатся флавоноиды, терпеноиды и алкалоиды, необходимы дополнительные исследования, чтобы определить, является ли комплексное действие экстракта результатом синергического действия этих метаболитов или один из метаболитов обладает свойствами многоцелевого лиганда.
В результате представленных данных можно предположить, что Aspergillus fischeri
VOIR, выделенный из Viola odorata, может быть использован для разработки нового
терапевтического средства множественного действия, обеспечивающего комплексный
подход к лечению ожирения.
REFERENCES
1. Yanovski S. Z., & Yanovski J. A. (2002). Obesity. New England Journal of Medicine, 346(8), 591-602. https://doi.org/10.1056/nejmra012586.
2. Avenell A., Broom J., Brown T., Poobalan A., Aucott L., Stearns S., Smith W., Jung R., Campbell M., & Grant A. (2004). Systematic review of the long-term effects and economic consequences of treatments for obesity and implications for health improvement. Health Technology Assessment, 8(21). https://doi.org/10.3310/hta8210.
3. Bray G. A. (2004). Medical Consequences of Obesity. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 89(6), 2583-2589. https://doi.org/10.1210/jc.2004-0535.
4. Aljaadi A.M., & Alharbi M. (2021). Overweight and Obesity Among Saudi Children: Prevalence, Lifestyle Factors, and Health Impacts. Handbook of Healthcare in the Arab World, 1155-1179. https://doi.org/10.1007/978-3-030-36811-1_187.
5. Multiple Regression and the Global Health Observatory Data (2015): Female Life Expectancy, Health Expenditures, and Legislation. https://doi.org/10.4135/9781473948150.
6. Overweight, Obesity, and Health Risk. (2000). Archives of Internal Medicine, 160(7), 898904. https://doi .org/10.1001/archinte.160.7.898.
7. Ellulu M. S., Patimah I., Khaza'ai H., Rahmat A., & Abed Y. (2017). Obesity and inflammation: the linking mechanism and the complications. Archives of Medical Science, 4, 851-863. https://doi.org/10.5114/aoms.2016.58928.
8. Tun S., Spainhower C. J., Cottrill C. L., Lakhani H. V., Pillai S. S., Dilip A., Chaudhry H., Shapiro J. I., & Sodhi K. (2020). Therapeutic Efficacy of Antioxidants in Ameliorating Obesity Phenotype and Associated Comorbidities. Frontiers in Pharmacology, 11. https://doi.org/10.3389/fphar.2020.01234.
9. Achkasov E. E., Razina A. O., & Runenko S. D. (2016). Pathogenetically targeted method for conservative treatment of obesity and overweight correction. Clinical Medicine (Russian Journal), 94(7), 509-517. https://doi.org/10.18821/0023-2149-2016-94-7-509-517.
10. Dias D. A., Urban S., & Roessner U. (2012). A Historical Overview of Natural Products in Drug Discovery. Metabolites, 2(2), 303-336. https://doi.org/10.3390/metabo2020303.
11. Drent M.L., van der Veen E.A. (1993) Lipase inhibition: a novel concept in the treatment of obesity. Int. J. Obes. Relat. Metab. Disord. 17(4), 241-244. PMID: 8387973.
12. Weibel E. K., Hadvary P., Hochuli E., Kupfer E., & Lengsfeld, H. (1987). Lipstatin, an inhibitor of pancreatic lipase, produced by Streptomyces toxytricini. I. Producing organism, fermentation, isolation and biological activity. The Journal of Antibiotics, 40(8), 1081-1085. https://doi.org/10.7164/antibiotics.40.1081.
1. 13.Orlistat (Xenical). (2008). Encyclopedia of Obesity.
https://doi.org/10.4135/9781412963862.n357.
13. Filippatos T. D., Derdemezis C. S., Gazi I. F., Nakou E. S., Mikhailidis D. P., & Elisaf M. S. (2008). Orlistat-Associated Adverse Effects and Drug Interactions. Drug Safety, 31(1), 5365. https://doi .org/10.2165/00002018-200831010-00005.
14. Seyedan A., Alshawsh M. A., Alshagga M. A., Koosha S., & Mohamed Z. (2015). Medicinal Plants and Their Inhibitory Activities against Pancreatic Lipase: A Review. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2015, 1-13. https://doi .org/10.1155/2015/973143.
15. Meshram V., Uppal K., & Gupta M. (2018). Endophytes: A Gold Mine of Enzyme Inhibitors. Microbial Bioprospecting for Sustainable Development, 61-92. https://doi.org/10.1007/978-981-13-0053-0_4.
16. Bustanji Y., Al-Masri I. M., Mohammad M., Hudaib M., Tawaha K., Tarazi H., & AlKhatib H. S. (2010). Pancreatic lipase inhibition activity of trilactone terpenes of Ginkgo biloba. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 26(4), 453-459. https://doi.org/10.3109/14756366.2010.525509.
17. Nakai M., Fukui Y., Asami S., Toyoda-Ono Y., Iwashita T., Shibata H., Mitsunaga T., Hashimoto F., & Kiso, Y. (2005). Inhibitory Effects of Oolong Tea Polyphenols on Pancreatic Lipase in Vitro. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53(11), 4593-4598. https://doi.org/10.1021/jf047814.
18. Kondrasheva K.V., Egamberdiev F.B., Suyarova R.A., Ruzieva D.M., Nasmetova S.M., Abdulmyanova L.A, Rasulova G.A., Gulyamova T.G. (2022). Production of indole-3-acetic acid by endophytic fungi of halophyte plants under salt stress. IOP Conference Series: Earth and Environmental Sciencethis link is disabled, 1068(1), 012040. DOI: 10.1088/17551315/1068/1/012040
19. Morikawa T., Xie Y., Asao Y., Okamoto M., Yamashita C., Muraoka O., Matsuda H., Pongpiriyadacha Y., Yuan D., & Yoshikawa M. (2009). Oleanane-type triterpene oligoglycosides with pancreatic lipase inhibitory activity from the pericarps of Sapindus rarak. Phytochemistry, 70(9), 1166-1172. https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2009.06.015.
20. Aly A. H., Debbab A., Kjer J., & Proksch P. (2010). Fungal endophytes from higher plants: a prolific source of phytochemicals and other bioactive natural products. Fungal Diversity, 41(1), 1-16. https://doi.org/10.1007/s13225-010-0034-4.
21. Slama H. B., Chenari Bouket A., Alenezi F. N., Pourhassan Z., Golinska P., Oszako T., & Belbahri L. (2021). Potentials of Endophytic Fungi in the Biosynthesis of Versatile Secondary Metabolites and Enzymes. Forests, 12(12), 1784. https://doi.org/10.3390/f12121784.
22. Gupta M., Saxena S., & Goyal D. (2014). Potential pancreatic lipase inhibitory activity of an endophyticPenicilliumspecies. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 30(1), 15-21. https://doi.org/10.3109/14756366.2013.871007.
23. Gupta M., Saxena S., & Goyal D. (2014). Lipase inhibitory activity of endophytic fungal species of Aegle marmelos: a bioresource for potential pancreatic lipase inhibitors. Symbiosis, 64(3), 149-157. https://doi.org/10.1007/s13199-015-0311-9.
24. Sarkar S. J., Dioundi D., & Gupta M. (2017). Endophytic pestalotiopsis species from andaman islands: a potential pancreatic lipase inhibitor. Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, 10(10), 82. https://doi.org/10.22159/ajpcr.2017.v10i10.19795.
25. Patil M. P., & Patil R. H. (2019). Data on the inhibitory effect of endophytic fungi of traditional medicinal plants against pancreatic lipase (PL). Data in Brief, 27, 104797. https://doi.org/10.1016Zj.dib.2019.104797.
26. Katoch M., Paul A., Singh G., & Sridhar S. N. C. (2017). Fungal endophytes associated with Viola odorata Linn. as bioresource for pancreatic lipase inhibitors. BMC Complementary and Alternative Medicine, 17(1) 385. https://doi.org/10.1186/s12906-017-1893-y.
27. Gulyamova T. G., Ruzieva D. M., Yoldosheva M. M., Rasulova G. A., Kondrasheva K. V. (2022). Screening of Pancreatic Lipase Inhibitors of Endophytic Fungi of Medicinal Plants in Uzbekistan. Biosciences Biotechnology Research Asia, 19(4), 1037-1044. Portico. https://doi.org/10.13005/bbra/3053.
28. Hazalin N.A., Ramasamy K., Lim S.M., Wahab I.A., Cole A.Lj., Majeed A.A. Cytotoxic and antibacterial activities of endophytic fungi isolated from plants at the National Park, Pahang, Malaysia. BMC Complementary and alternative medicine. 2009, 9:46.
29. Bustanji Y., Al-Masri I. M., Mohammad M., Hudaib M., Tawaha K., Tarazi H., & AlKhatib H. S. (2010). Pancreatic lipase inhibition activity of trilactone terpenes of Ginkgo biloba. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 26(4), 453-459. https://doi.org/10.3109/14756366.2010.525509.
30. Govindappa M., Channabasava R., Kumar K. R. S., & Pushpalatha, K. C. (2013). Antioxidant Activity and Phytochemical Screening of Crude Endophytes Extracts of <i>Tabebuia argentea</i> Bur. & K. Sch. American Journal of Plant Sciences, 4(8), 1641-1652. https://doi.org/10.4236/ajps.2013.48198.
31. Blois M. S. (1958). Antioxidant Determinations by the Use of a Stable Free Radical. Nature, 181(4617), 1199-1200. https://doi.org/10.1038/1811199a0.
32. Sakat S.S., Juvekar A.R., & Gambhire M.N. (2010). Invitro antioxidant and antiinflammatory activity of methanol extract of oxalis corniculata Linn. Int. J. Pharm. Pharmacol. Sci., 2(1): 146-155.
33. Kuralarasi R. (2018). Endophytic Fungi: As A Pool Of Secondary Metabolites. International Journal of Advanced Research, 6(8), 248-256. https://doi.org/10.21474/ijar01/7516.
34. Doaa M.A., Khalil1 Soad A., El-Zayat1 Magdi A. El-Sayed. (2020). Phytochemical Screening and Antioxidant Potential of Endophytic Fungi Isolated From Hibiscus sabdariffa. J Appl Biotechnol Rep. 7(2), 116-124. doi 10.30491/JABR.2020.109287.
35. Habisukan U. H., Elfita Widjajanti H., Setiawan A., & Kurniawati A. R. (2021). Antioxidant and Antimicrobial Activity of Endophytyc Fungi Isolated from Syzygium aqueum Leaves. Journal of Physics: Conference Series, 1751(1), 012059. https://doi.org/10.1088/1742-6596/1751/1/012059.
36. Yadav M., Yadav, A., & Yadav, J. P. (2014). In vitro antioxidant activity and total phenolic content of endophytic fungi isolated from Eugenia jambolana Lam. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 7, S256-S261. https://doi.org/10.1016/s1995-7645(14)60242-x.
37. Gautam V. S., Singh A., Kumari P., Nishad J. H., Kumar J., Yadav M., Bharti R., Prajapati P., & Kharwar R. N. (2022). Phenolic and flavonoid contents and antioxidant activity of an endophytic fungus Nigrospora sphaerica (EHL2), inhabiting the medicinal plant Euphorbia hirta (dudhi) L. Archives of Microbiology, 204(2). https://doi.org/10.1007/s00203-021-02650-7.
38. Gutiérrez-del-Río I., López-Ibáñez S., Magadán-Corpas P., Fernández-Calleja L., Pérez-Valero Á., Tuñón-Granda M., Miguélez E. M., Villar C. J., & Lombó F. (2021). Terpenoids
and Polyphenols as Natural Antioxidant Agents in Food Preservation. Antioxidants, 10(8), 1264. https://doi .org/10.3390/antiox 10081264. 39. Sharaf M. H., Abdelaziz A. M., Kalaba M. H., Radwan A. A., & Hashem A. H. (2021). Antimicrobial, Antioxidant, Cytotoxic Activities and Phytochemical Analysis of Fungal Endophytes Isolated from Ocimum Basilicum. Applied Biochemistry and Biotechnology, 194(3), 1271-1289. https://doi.org/10.1007/s12010-021-03702-w.
