CC BY
15
Ш Изучение att-фенотипа реассортантов между вирулентным штаммом вируса гриппа А(Н^1)/ WSN/33 и вакцинным холодоадаптированным штаммом вируса гриппа А(H2N2)/ Краснодар/101/35/59
А.В. Терехов (tor4911@yandex.ru), Т.М. Цфасман (tanya.tsfasman@gmail.com), С.Г. Маркушин (s.g.markushin@rambler.ru), И.Б. Коптяева, К.В. Лисовская, В.Ю. Кост
ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМН, Москва (instmech@iitp.ru)
Резюме
Исследовали аттенуационный (att) фенотип одногенных и полигенных реассортантов, полученных с помощью «обратной» генетики между вирулентным штаммом вируса гриппа А(H1N1)/WSN/33 и холодоадаптированным (ХА) штаммом вируса гриппа А(Н2N2)/Краснодар/101/35/59. Изучение размножения реассортантов в носовой полости и легких мышей, а также нейро-вирулентности реассортантов для мышей-сосунков показало, что полученные реассортанты резко различаются по своему att-фенотипу и могут быть распределены по этому признаку на три группы: реассортанты, сходные с вирулентным штаммом А(H1N1)/WSN/33, реассортанты, тождественные ХА-штамму, и реассортанты с частичной аттенуацией. Показано, что реассортанты с включением РВ1- и NS-гена ХА-штамма либо обладают сниженной вирулентностью для мышей, либо не имеют ее вовсе. Эти факты свидетельствуют о том, что РВ1- и NS-гены вакцинного ХА-штамма А(Н2N2)/Краснодар/101/35/59 содержат ключевые детерминанты, определяющие аттенуационный att-фенотип данного штамма. Анализ att-фенотипа полигенных реассортантов говорит о доминировании генов, содержащих детерминанты, ответственные за att-фенотип, в составе их генома. Этот факт позволяет сделать важный вывод о безопасности применения живых гриппозных вакцин во время гриппозной эпидемии. Ключевые слова: вирус гриппа типа А, одногенные и полигенные реассортанты, att-фенотип
Study att-Reassortant Phenotype between Virulent Strain of Influenza A(H1N1)/WSN/33 and Cold-Adapted Vaccine Strain of Influenza A(H2N2)/Krasnodar/101/35/59
АМ Terekhov (tor4911@yandex.ru), Т.М. Tsfasman (tanya.tsfasman@gmail.com), S.G. Маrkushin (s.g.markushin@rambler.ru), I.B. Коpt'ayeva, K.V. Lisovskaya, V.Yu. Коst
Federal State Budgetary Institution «I.I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera» of Russian Academy of Medical Sciences,
Moscow (instmech@iitp.ru)
Abstract
Att-phenotype of singlegenic and polygenic reassortants between cold-adapted (ca) vaccine A(H2N2)/Krasnodar/101/35/59 strain and virulent A(H1N1)/WSN/33 strain, obtained with the help of reverse genetics, was investigated. The study of reassortants replication in nasal turbinates and lungs of mice and the study of reassortants neurovirulence for mice-sucklings have shown, that obtained reassortants differ sharply on yours att-phenotype and can be distributed in several groups. Group I contains reassortants, which exhibited att-phenotype of virulent strain. Group II contains viruses, which exhibited ts-phenotype of ca-vaccine strain. The last group consists of viruses with partial attenuation. It was shown, that the reassortants with included PB1- and NS-genes from ca-vaccine strain acquired reduced virulence or complete absence of virulence for mice. Data obtained have shown that PB1-gene and NS-gene of ca-vaccine strain A(H2N2)/Krasnodar/101/35/59 have crucial determinants, responsible for att-phenotype of this strain. The analysis att-phenotype of obtained polygenic reassortants points out at predomination of genes, containing the determinants, responsible for att-phenotype in genome of reassortants. This fact allows to make important conclusion about the safety of live influenza vaccines using in the period of influenza epidemic.
Key words: influenza virus A, singlegenic and polygenic reassortants, att-phenotype
Введение
Как известно, живые гриппозные вакцины создают на базе холодоадаптированных (ХА) штаммов - доноров аттенуации. Аттенуационный фенотип этих штаммов формируется наличием мутаций в шести РНК-сегментах генома вируса, кодирующих его внутренние белки. Эти мутации ответ-
ственны за {в-фенотип (температурочувствитель-ный маркер), са-фенотип (способность к эффективной репродукции при пониженной температуре) и аН-фенотип (авирулентность), которые в целом определяют аттенуацию вируса гриппа типа А [1].
В США и России были разработаны и всесторонне изучены штаммы - доноры аттенуации вируса
гриппа типа А: A(H2N2)^hh Арбор/6/60, A(H2N2)/ Ленинград/134/17/57 [1, 2]. С учетом недостатков штамма А(H2N2)/Ленинград/134/17/47 (гетерогенность популяции, реактогенность для детей дошкольного возраста) [2] в НИИ вакцин и сывороток был получен новый штамм - донор аттенуации - А(Н2N2)/Краснодар/101/35/59, а также выявлены мутации в РНК-сегментах его генома, кодирующих внутренние белки [3, 4, 5]. В предыдущей работе были исследованы отдельные гены штамма А(Н2N2/Краснодар/101/35/59, ответственные за проявление его ts- и са-фенотипа [3]. Было показано на модели одногенных и полигенных ре-ассортантов, полученных c помощью обратной генетики между ХА-штаммом А(H2N2)/Красно-дар/101/35/59 и вирулентным штаммом A(H1N1)/ WSN/33, что PBl-ген и NS-ген содержат ключевые детерминанты, ответственные за формирование ts-фенотипа ХА-штамма А(H2N2)/Красно-дар/101/35/59 [3].
Основная цель данного исследования - выявление в геноме полученного нами вакцинного ХА-штамма А(H2N2)/Краснодар/101/35/59 генов, содержащих ключевые детерминанты, ответственные за att-фенотип данного штамма.
Материалы и методы
Вирусы
В работе были использованы: ХА-штамм -донор аттенуации для живых гриппозных вакцин А(Н2N2)/Краснодар/101/35/59, полученный методом серийных пассажей в куриных эмбрионах (КЭ) и культуре клеток MDCK при постепенно снижающейся температуре инкубации с последующим трехкратным клонированием методом бляшек в культуре клеток MDCK [4, 5], вирулентный штамм вируса гриппа А(H1N1)/WSN/33 и реассортанты между этими двумя штаммами, полученные с помощью плазмидной технологии в лаборатории генетики РНК-содержащих вирусов НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.
Куриные эмбрионы
Все использованные в работе вирусы поддерживали путем пассажей в 10 - 11-дневных куриных эмбрионах. Активность репродукции вирусов гриппа при разной температуре инкубации оценивали по результатам титрования в КЭ, инкубированных при 34, 38 и 25 0С, и выражали в RCT (reproductive capacity at different temperatures - репродуктивная способность при различных температурах). RCT25= lg ЭИД50/0,2 мл при 34 0С - lg ЭИД50/0,2 мл при 25 0С; TCR38 = lg ЭИД50/0,2 мл при 34 0С - lg ЭИД50/0,2 мл при 38 0С. КЭ инкубировали в течение 48 часов при 34 и 38 0С и в течение пяти суток - при 25 0С. Вирусы считали температуро-чувствительными (ts-фенотип), если RCT38была не менее 5,0 lg ЭИД50/0,2 мл, и холодоадаптирован-ными, если их RCT25 не превышала 3,0 lg ЭИД50/ 0,2 мл (са-фенотип).
Репродукция вирусов в легких и носовых ходах мышей
Изучение att-фенотипа проводили по следующей методике: группы самок беспородных мышей (по 5-10 особей на группу) инфицировали ин-траназально под легким эфирным наркозом анализируемыми вирусами в инфекционном титре 107 ЭИД50/0,2 мл (в дозе 50 мкл на мышь). Через 72 часа мышей усыпляли и извлекали легочную ткань и фрагменты носоглотки. Из легочной ткани готовили 10%-ную суспензию в ступках с тертым стеклом. Инфекционный титр вируса в 10%-ной суспензии легких определяли в куриных эмбрионах и выражали в lg ЭИД50/грамм легочной ткани. Из фрагментов носоглотки выделяли область носовых ходов и также готовили 10%-ную суспензию, которую титровали в куриных эмбрионах. Инфекционный титр также выражали в lg ЭИД50/грамм ткани носовых ходов. Все реассортанты были исследованы в трех независимых опытах в группах по пять мышей на каждый реассортант.
Нейровирулентность реассортантов
для мышей-сосунков при интрацеребральном
введении вируса
Для изучения нейровирулентности реассортан-тов для мышей-сосунков использовали несколько модифицированную методику Сугиуры [6]. В экспериментах использовали мышей-сосунков из пометов самок беспородных белых мышей. Вируссодер-жащую жидкость в дозе 1040 ЭИД50/50 мкл вводили интрацеребрально. Наблюдение за инфицированными мышами проводили в течение последующих двух недель. В таблице 1 использованы данные одного из трех опытов.
Культуры клеток
В опытах по трансфекции использовали клетки Т293 и линию клеток MDCK, полученную из Института Пастера (Франция). Все клетки выращивались при 37 0С в СО2-инкубаторе. Клеточные культуры пассировались на среде МЕМ производства «ПанЭко» (Москва), содержащей 5% фетальной бычьей сыворотки.
Рекомбинантная ДНК и обратно-генетические методы. Плазмиды и бактерии
В экспериментах использовали плазмиду pHW2000 [7], разработанную для получения вируса гриппа методом обратной генетики, а также плаз-миды со вставками генов штамма вируса гриппа A(H1N1)/WSN/33, которые были любезно предоставлены доктором Вебстером (г. Мемфис, США). Для накопления плазмид использовали штамм E. coli DH5-alpha.
Накопление и концентрирование вирусов
Вирусы накапливали в куриных эмбрионах по стандартной методике. Для последующего выделения РНК вирусы концентрировали центрифу-
гированием. Вначале аллантоисную жидкость центрифугировали в центрифуге Beckman J2-21 (ротор JLA-16250) при 6000 об./мин в течение 30 мин для осаждения клеточного дебриса. Вирус осаждали из надосадочной жидкости также на высокоскоростной центрифуге Beckman J2-21 c использованием ротора JLA-16250 (14000 об./мин; 2,5 часа). Осадок вирионов ресуспендировали в буфере STE (10 ммоль TrisHCL, 100 ммоль NaCl, 1 ммоль EDTA; pH 7,4) в гомогенизаторе Даунса.
Выделение РНК
Для последующей постановки ПЦР выделяли вирусную РНК при помощи набора для выделения РНК из плазмы и сыворотки крови (ООО «Лаборатория Изоген», Москва).
ОТ-ПЦР
Обратную транскрипцию ставили отдельно от ПЦР, при помощи ревертазы M-MuLV («СибЭнзим», г. Новосибирск) в соответствии с рекомендациями производителя. ПЦР ставили с высокоточной поли-меразой Tersus (ЗАО «Евроген», Москва) в соответствии с рекомендациями производителя. Очистку полученных ПЦР-продуктов из легкоплавкой ага-розы осуществляли при помощи набора фирмы Fermentas (Канада).
Клонирование в E. coli
Опыты по клонированию (работа с бактериями, рестрикция, лигирование и т.п.) проводились по стандартным методикам [8] или в соответствии с рекомендациями производителя для соответствующих ферментов (Т4-лигаза, рестриктазы Esp3I и Eco31I).
Секвенирование
Секвенирование вставок в полученных плазми-дах осуществлялось ЗАО «Евроген» на автоматическом секвенаторе MegaBACE-500.
Трансфекция
Трансфекцию проводили при помощи реагента Lipofectamine LTX (Invitrogen) либо в кокультуре клеток Т293 и MDCK по методике, описанной ранее [7], либо в однодневном монослое клеток Т293 (плотность клеточного монослоя около 70%) в соответствии с методикой, прилагаемой к реагенту Lipofectamine LTX (http://www.invitrogen.com/etc/ medialib/files/Cell-Culture/PDFs.Par.61792.File.dat/ lipofectamineLTX and Plus_man.pdf). В качестве отрицательного контроля использовали монослой клеток с добавлением липофектамина и без добавления плазмид. В качестве положительного контроля к культуре клеток добавляли восемь плазмид, содержащих все гены исходного штамма A(H1N1)/ WSN/33. В ряде экспериментов через 48 часов после трансфекции материал вводили в куриные эмбрионы. Клетки снимали трипсином, после чего вводили по 0,5 мл неразведенной суспензии в куриные
эмбрионы. Через 48 часов определяли гемагглюти-нирующий титр вируса в куриных эмбрионах.
Получение панели одногенных и полигенных реассортантов
Для получения панели одногенных и полигенных реассортантов, содержащих различные комбинации РНК-сегментов, полученных из геномов штаммов А(H1N1)/WSN/33 и А(H2N2)/Красно-дар/101/35/59, были использованы методы плаз-мидной технологии. Гены, включенные в плазми-ды, были подвергнуты секвенированию с целью подтверждения присутствия в них выявленных {э-мутаций и обнаружения посторонних мутаций. Ре-ассортанты были получены методом трансфекции двойной культуры клеток Т293 и MDCK - плазми-дами, содержащими различные комбинации восьми генов двух штаммов. Трансфекцию проводили по методу, описанному ранее [7].
Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием среднего квадратическо-го отклонения и коэффициента Стьюдента.
Результаты и обсуждение
Изучение аИ-фенотипа одногенных реассортантов
Аттенуацию реассортантов для мышей определяли по относительной способности вируса реплицироваться в нижних отделах респираторного тракта после интраназальной инокуляции [9]. Интраназальное инфицирование мышей вирулентным штаммом А(H1N1)/WSN/33 приводило к интенсивному размножению вируса как в носоглотке, так и в легких мышей, в то время как интраназальное введение мышам вакцинного ХА-штамма А(H2N2)/Краснодар/101/35/59 -к размножению вируса только в верхних дыхательных путях (табл. 1). Как и ожидалось, все одно-генные реассортанты реплицировались в носовых ходах мышей, однако с разной интенсивностью. Реассортант 6 (см. табл. 1) с включением NS-гена от вакцинного штамма по своему аН-фенотипу почти не отличался от ХА-штамма А(H2N2)/Крас-нодар/101/35/59 (Р < 0,05) и характеризовался полным отсутствием размножения в легких мышей. При инфицировании мышей реассортантом 2 с включением РВ1-гена от холодоадаптированно-го штамма также наблюдалась резко сниженная репродукция вируса в легких животных (Р < 0,05). С другой стороны, реассортанты 1 и 4 с включением РВ2- и NP-генов от ХА-штамма отличались активным размножением вируса в носоглотке и в легких мышей и по своему а^-фенотипу были тождественны вирулентному штамму А(Н^1)/ WSN/33. У мышей, инфицированных реассортан-тами 3 и 5 с включением РА- и М-генов от вакцинного ХА-штамма, наблюдалось достаточно интенсивное размножение вируса в носоглотке (см. табл. 1), однако в легких отмечалось снижение репродукции вируса, что позволило рассматривать эти реассортанты как частично аттенуированные.
Таблица 1.
Размножение одногенных реассортантов между штаммами вируса гриппа A(H1N1)/WSN/33 и ХА А(H2N2)/Краснодар/101/35/59 в респираторном тракте мышей при интраназальном введении
Исходные вирусы и реассортанты Генотип вируса Титр вируса в носоглотке № ЭИДю/1,0 g ) Титр вируса в легких № ЭИД5О/1,0 g ) фенотип
PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 5,5 ± 0,50 5,16 ± 0,56
А/Краснодар/ 101/35/59 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 3,5 ± 0,50 < 1,0 att
1 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 5,0 ± 0,25 4,5 ± 0,81
2 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 4,40 ± 0,14 2,0 ± 0,70 att
3 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 4,5 ± 1,0 3,5 ± 0,91 att (+/-)
4 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 4,5 ± 0,81 5,0 ± 0,50
5 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 4,6 ± 0,62 3,5 ± 0,40 att (+/-)
6 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 3,0 ± 0,70 < 1,0 att
Изучение ай-фенотипа полигенных реассортантов
Как видно из таблицы 2, включение некоторых генов
дополнительное вакцинного ХА-
штамма А(H2N2)/Краснодар/101/35/59 в геном вирулентного штамма А(H1N1)/WSN/33 приводило к усилению аН-фенотипа у значительной части реассортантов. Так, дополнительное включение NS-гена от вакцинного ХА-штамма в состав реассортантов приводило к полной потере размножения вируса в легких мышей (ре-ассортанты 10, 12, 13 и 14). Аналогичным образом дополнительное включение РВ1-гена от вакцинного ХА-штамма в геном реассортантов снижало размножение вируса в легочной ткани мышей, то есть усиливало аН-фенотип. В то же время совместное включение РВ2- и NP-генов от вакцинного штамма в геном вирулентного
штамма (реассортант 8) сопровождалось активным размножением реассортанта в носоглотке и легких мышей, свидетельствуя об отсутствии мутаций, ответственных за аН-фенотип, в этих генах штамма А(H2N2)/Краснодар/101/35/59. Также полное отсутствие аН-фенотипа показал реассортант 11 с включением NP- и М-генов от вакцинного Ха-штамма. Сравнение характеристик полигенных реассортантов свидетельствует о том, что любое включение в геном вирулентного штамма комбинации генов вакцинного ХА-штамма, в состав которой входит РВ1- или NS-ген, вызывает снижение вирулентности ре-ассортанта. На основании этих фактов можно заключить, что РВ1- и NS-гены ХА-штамма А(H2N2)/Краснодар/101/35/59 содержат ключевые детерминанты, определяющие а^-фенотип данного вакцинного штамма-донора.
Таблица 2.
Размножение полигенных реассортантов между штаммами вируса гриппа А(H1N1)/WSN/33 и А(Н2N2)/ Краснодар/101/35/59 в респираторном тракте мышей при интраназальном введении
Исходные вирусы и реассортанты Генотип вируса Титр вируса в носоглотке (lg ЭИДю/1,0 g ) Титр вируса в легких № ЭИДю/1,0 g ) фенотип
РВ2 РВ1 РА НА NP NA М NS 4,5 ± 0,40 5,5 ± 0,40
А/Краснодар/101/35/59 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 3,5 ± 0,70 < 1,0 att
7 PB2 PB1 PA НА NP NA М NS 4,0 ± 0,40 2,0 ± 0,40 att
8 PB2 РВ1 РА НА NP NA М NS 5,0 ± 0,61 3,75,0 ± 0,40
9 РВ2 PB1 PA НА NP NA М NS 5,0 ± 1,22 2,0 ± 1,10 att
10 РВ2 РВ1 РА НА NP NA М NS 3,5 ± 0,40 < 1,0 att
11 РВ2 РВ1 РА НА NP NA M NS 4,25 ± 0,53 4,75 ± 0,24
12 РВ2 РВ1 РА НА NP NA M NS 3,5 ± 0,65 <1,0 att
13 РВ2 РВ1 PA НА NP NA М NS 3,75 ± 0,32 <1,0 att
14 РВ2 PB1 РА НА NP NA М NS 3,75 ± 0,93 < 1,0 att
15 PB2 PB1 РА НА NP NA М NS 3,25 ± 0,53 < 1,0 att
Изучение нейровирулентности реассортантов для мышей-сосунков
Из литературы известно, что штамм A(H1N1)/ WSN/33 обладает нейровирулентностью для мышей [6, 10, 11]. Было показано, что генетические детерминанты, ответственные за нейровирулент-ность штамма A(H1N1)/WSN/33, содержатся в NA-гене данного штамма [6, 12]. При анализе ну-клеотидной последовательности NA-гена штамма A(H1N1)/WSN/33 было обнаружено, что нейро-вирулентность штамма для мышей связана с отсутствием консервативного сайта гликозилирова-ния в позиции 130 NA-белка [12]. Представляло интерес изучить нейровирулентность полученных нами одногенных и полигенных реассортантов между штаммом A(H1N1)/WSN/33 и вакцинным ХА-штаммом А(H2N2)/Краснодар/101/35/59 для мышей-сосунков. Как видно из таблицы 3, вирулентный штамм A(H1N1)/WSN/33 вызывал гибель подавляющего большинства мышей-сосунков в течение двух недель после инфицирования. Вакцинный штамм А(H2N2)/Краснодар/101/35/59 обладал при интрацеребральном введении полной авирулентностью. Однако при интрацеребральном заражении мышей-сосунков одногенными и полигенными реассортантами наблюдались разные результаты. Некоторые реассортанты были сходны по вирулентности со штаммом A(H1N1)/WSN33 (од-ногенный реассортант 1, с включением РВ2-гена от ХА-штамма, реассортант с включением РВ2- и NP-генов от ХА-штамма). Часть одногенных и полигенных реассортантов была тождественна по данному фенотипу вакцинному штамму А(H2N2)/Крас-
нодар/101/35/59 (реассортанты 2, 6, 7, 10 и 14). Данная группа реассортантов, как правило, включала РВ1- либо NS-ген от вакцинного штамма. Наблюдалась доля реассортантов с промежуточными характеристиками (реассортанты 3, 4, 5 и 15). При анализе полигенных реассортантов следует особо отметить доминирование генов, ответственных за att-фенотип, в общей характеристике реассортантов. Так, включение PB1- или NS-гена от вакцинного ХА-штамма в состав реассортанта независимо от наличия других генов всегда приводило к резкому снижению вирулентности для мышей-сосунков.
В настоящей работе мы попытались выявить гены, ответственные за формирование аттенуа-ционного фенотипа (att) штамма А(Н2N2)/Красно-дар/101/35/59. Как видно из результатов работы, полученные нами с помощью методов обратной генетики одногенные и полигенные реассортанты характеризовались различной вирулентностью для мышей, что дало возможность распределить их в несколько групп. Реассортанты, отнесенные в группу I, не отличались по своему att-фенотипу от вирулентного штамма А(H1N1)/WSN/33. Реассортанты группы II по своему att-фенотипу были тождественны вакцинному ХА-штамму А(H2N2)/ Краснодар/101/35/59. В группе III - реассортанты с частичной аттенуацией. Анализ одногенных и полигенных реассортантов между вирулентным штаммом А(H1N1)/WSN/33 и вакцинным ХА-штаммом А(H2N2)/Краснодар/101/35/59 показал, что РВ1- и NS-гены от вакцинного ХА-штамма содержат ключевые детерминанты, ответственные за att-фенотип данного штамма. Ранее нами было
Таблица 3.
Изучение нейровирулентности одногенных и полигенных реассортантов между штаммами вируса гриппа A(H1N1)/WSN/33 и ХА А(Н2^)/Краснодар/101/35/59*
Исходные вирусы и реассортанты Генотип реассортанта нейровирулентность для мышей-сосунков**
A/WSN/33 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 11/13
А/Краснодар/101/35/59 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 0/9
1 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 11/11
2 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 0/10
3 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 2/10
4 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 6/9
5 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 4/10
6 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 0/8
7 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 0/11
8 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 9/9
9 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 3/13
10 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 0/8
14 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 0/9
15 PB2 PB1 PA HA NP NA M NS 2/10
Примечание: *Данные одного из трех опытов. **В числителе число погибших мышей, в знаменателе число инфицированных мышей.
показано, что РВ1- и NS-гены штамма А(H2N2)/ Краснодар/101/35/59 также содержат генетические детерминанты, ответственные за {в-фенотип этого штамма [3].
Данные литературы указывают на роль РВ1-, РВ2-, РА- и М-генов в формировании а{{-фенотипа ХА-штамма-донора А(H2N2)/Энн Арбор/6/60 [13]. Анализ реассортантов, полученных на основе ХА-штамма-донора А(H2N2)/Ленинград/134/17/57, указывает на участие также РВ1- и РВ2-генов в формировании {в- и а{{-фенотипа этого штамма [2]. Как показали результаты наших исследований, полученный штамм-донор А(H2N2)/Красно-дар/101/35/59 несколько отличается от используемых в настоящее время штаммов - доноров аттенуации. Его генетические детерминанты, ответственные за {в- и а{{-фенотипы, локализованы в генах, кодирующих РВ1- и NS1/NS2-белки. Полученные нами результаты и данные литературы свидетельствуют о том, что мутации, ответственные за аттенуацию ХА-штаммов вируса гриппа типа А, могут, по-видимому, возникать в любом РНК-сегменте генома данного вируса, кодирующем внутренние белки.
Анализ полученных нами полигенных реассор-тантов свидетельствует о доминировании генов, содержащих детерминанты, ответственные за а{{-фенотип, в составе генома реассортантов. Сход-
ные данные были получены Ch.L. Parks с сотрудниками [14] при анализе реассортантов между вирулентным штаммом вируса гриппа A(H3N2)/ Sydney/5/97 и полученным из него вакцинным вариантом. Эти факты позволяют сделать важный вывод о безопасности применения живых гриппозных вакцин во время гриппозной эпидемии.
Выводы
1. Полученные с помощью методов обратной генетики одногенные и полигенные реассор-танты различались по своему att-фенотипу, что дает возможность выделить три группы реассортантов - не отличающиеся по своему att-фенотипу от вирулентного штамма A(H1N1)/ WSN/33, тождественные вакцинному ХА-штамму А(H2N2)/Краснодар/101/35/59 по своему att-фенотипу и с частичной аттенуацией.
2. РВ1- и NS-гены ХА-штамма А(H2N2)/Красно-дар/35/59 содержат ключевые детерминанты, определяющие att-фенотип данного штамма.
3. Характеристика полученных нами полигенных реассортантов свидетельствует о доминировании генов, содержащих детерминанты, ответственные за att-фенотип, в составе генома реассортантов. Это говорит о безопасности применения живых гриппозных вакцин во время гриппозной эпидемии. ш
Литература
1. Maassab H.F., Bryant M.L. The development of live attenuated cold-adapted influenza virus vaccine for humans. Rev. Med. Virol. 1999; 9: 237 - 244.
2. Киселева И.В. Основы аттенуации вируса гриппа: Автореф. дис. ... докт. биол. наук. Санкт-Петербург; 2001.
3. Терехов А.В., Цфасман Т.М., Маркушин С.Г. и др. Генетические основы аттенуации холодоадаптированного штамма А(Н2Ы2)/Краснодар/101/35/59 -донора для живых гриппозных вакцин. Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2013; 3 (70): 71 - 77.
4. Гендон Ю.З., Маркушин С.Г., Цфасман Т.М. и др. Новые холодоадаптированные штаммы - доноры аттенуации для живых вакцин против гриппа. Вопр. вирусол. 2013; 1: 11 - 17.
5. Патент РФ № 2354695. Аттенуированный холодоадаптированный штамм вируса гриппа А(Н2Ы2)/Краснодар/101/35/59 для получения штаммов живой интраназальной вакцины. Опубликовано: 10.07.2007.
6. Sugiura A., Ueda M. Neurovirulence of influenza virus in mice. Neurovirulence of recombinants between virulent and avirulent strains. J. Virol. 1979; 101: 440 - 449.
7. Hoffmann E., Krauss S., Perez D. et al. Eight-plasmid system for rapid generation of influenza virus vaccines. Vaccine. 2002; 20: 3165 - 3170.
8. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии: Молекулярное клонирование. М.: Мир; 1984.
9. Murphy B.R., Coelingh K. Principles underlying the development and use of live cold-adapted influenza A and B virus vaccines. Viral Immunol. 2002; 15 (2): 295 - 323.
10. Scholtissek C., Vallbracht A., Flehmig B., Rott R. Correlation of pathogenicity and gene constellation of influenza viruses. II. Highly neurovirulent recombinants derived from nonneurovirulent or weakly neurovirulent parent virus strains. J. Virol. 1979; 95: 492 - 500.
11. Schulman J.L., Palese P Virulence factors of influenza A virus. WSN virus neuraminidase required for plaque production in MDBK cells. J. Virol. 1977; 24: 170 - 176.
12. Li Sh., Schulman J., Itamura S., Palese P Glycosilation of neuraminidase determines the neurovirulence of influenza A/WSN/33 virus. J. Virol. 1993; 67: 6667 - 6673.
13. Snyder M.H., Betts R.F., DeBorde D. et al. Four viral genes independently contribute to attenuation of live influenza A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) cold-adapted reassortant virus vaccines. J. Virol. 1988; 62 (2): 488 - 495.
14. Parks Ch.L., Latham Th., Cahill A. et al. Phenotypic properties resulting fromdirected gene segment reassortment between wild-type A/Sydney/5/97 influenza virus and the live attenuated vaccine strain. J. Virol. 2007; 367: 275 - 287.
References
1. Maassab H.F., Bryant M.L. The development of live attenuated cold-adapted influenza virus vaccine for humans. Rev. Med. Virol. 1999; 9: 237 - 244.
2. Kiseleva I.V. The bases of influenza virus attenuation. Doctor med. sci. diss.. Sankt-Petersburg: 2001 (in Russian).
3. Terekhov A.V., Tsfasman T.M., Markushin S.G., Koptyaeva I.B., Lisovskaya K.V., Kost V.Yu. Genetic bases of attenuation of cold-adapted (ca) (H2N2) A/Kras-nodar/101/35/59 strain-donor for live influenza vaccines. Epidemiology and Vvaccineprevention. 2013 ; 3 (70): 71 - 77 ( in Russian). Ghendon Y. Z., Markushin S.G., Tsfasman T.M., Akopova I.I., Ahmatova N.K., Koptyaeva I.B. New cold-adapted strains-donors of attenuation for live influenza
vaccines. Vopr. Virusol. 2013; 1: 11 - 17 (in Russian).
Attenuated cold-adapted A (H2N2)/Krasnodar /101/35/59 influenza strain for the development of live intranasal vaccine. Patent RF N 2354695. Have published 10.07.2007 (in Russian).
Sugiura A., Ueda M. Neurovirulence of influenza virus in mice. Neurovirulence of recombinants between virulent and avirulent strains. J. Virol. 1979; 101: 440 - 449.
Hoffmann E., Krauss S., Perez D. et al. Eight-plasmid system for rapid generation of influenza virus vaccines. Vaccine. 2002; 20: 3165 - 3170.
8. Maniatis T., Fritsch E., Sambrook J. Methods of genetic engineering: Molecular cloning. Moscow: Mir. 1984; 479 (in Russian).
9. Murphy B.R., Coelingh K. Principles underlying the development and use of live cold-adapted influenza A and B virus vaccines. Viral Immunol. 2002; 15 (2): 295 - 323.
10. Scholtissek C., Vallbracht A., Flehmig B., Rott R. Correlation of pathogenicity and gene constellation of influenza viruses. II. Highly neurovirulent recombinants derived from nonneurovirulent or weakly neurovirulent parent virus strains. J. Virol. 1979; 95: 492 - 500.
4.
7.
11. Schulman J.L., Palese P. Virulence factors of influenza A virus. WSN virus neuraminidase required for plaque production in MDBK cells. J. Virol. 1977; 24: 170 - 176.
12. Li Sh., Schulman J., Itamura S., Palese P. Glycosilation of neuraminidase determines the neurovirulence of influenza A/WSN/33 virus. J. Virol. 1993; 67: 6667 - 6673.
13. Snyder M.H., Betts R.F., DeBorde D. et al. Four viral genes independently contribute to attenuation of live influenza A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) cold-adapted reassortant virus vaccines. J. Virol. 1988; 62 (2): 488 - 495.
14. Parks Ch.L., Latham Th., Cahill A. et al. Phenotypic properties resulting fromdirected gene segment reassortment between wild-type A/Sydney/5/97 influenza virus and the live attenuated vaccine strain. J. Virol. 2007; 367: 275 - 287.
К вопросу о значении нанобактерий в медицине и биологии
(продолжение)
А.Г. Кутихин1 (antonkutikhin@gmail.com), Е.Б. Брусина1, 2 (brusina@mail.ru), А.Е. Южалин2 (yuzhalin@gmail.com)
1ГБОУ ВПО «Кемеровская государственная медицинская академия» Минздрава России
2ФГБУ «НИИ комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний» Сибирского отделения РАМН, г. Кемерово
Резюме
Кальцифицирующиеся наночастицы (нанобактерии; частицы, подобные нанобактериям; нанобы) были открыты более 25 лет назад, тем не менее природа их остается неизвестной. До настоящего времени никому так и не удалось достоверно выяснить, являются ли они мельчайшей самореплицирующейся формой жизни на Земле или представляют собой лишь минерально-белковые комплексы, не имеющие отношения к живым существам. Сторонники обеих точек зрения располагают рядом аргументов в пользу своих гипотез. Тем не менее в результате эпистемологического анализа, проведенного в этой статье, все аргументы, приводимые в пользу гипотезы о нанобактериях как о минерально-белковых комплексах, могут быть отвергнуты на основании проведенных исследований. Таким образом, опубликованные данные позволяют предположить биологическую природу кальцифицирующихся наночастиц. Единственным препятствием для признания кальцифицирующихся наночастиц живыми организмами на данный момент является отсутствие достоверно правильно секвенированного генома. Более того, очевидно, что кальцифицирующиеся наночастицы играют важную роль в этиопатогенезе многих заболеваний, и эта связь не зависит от их природы. Следовательно, появление кальцифицирующихся наночастиц в организме является патологическим, а не физиологическим процессом. В статье также приводятся классификация кальцифицирующихся наночастиц и перечень новых направлений в исследовании их роли в биологии и медицине.
Ключевые слова: кальцифицирующиеся наночастицы; нанобактерии; частицы, подобные нанобактериям; заболевания; инфекционные агенты
On the Significance of Nanobacteria in Medicine and Biology
A.G. Kutikhin1 (antonkutikhin@gmail.com), E.B. Brusina12 (brusina@mail.ru), A.E. Yuzhalin2 (yuzhalin@gmail.com) 1State Budgetary Educational Institution of Higher Professional Training «Kemerovo State Medical Academy» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation
2«Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases» under the Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, Kemerovo Abstract
Nanobacteria were discovered more than 25 years ago; nevertheless, their nature is still poorly known. To date nobody was able to credibly define them either as smallest self-replicating life form on Earth, or as mineralo-protein complexes without any relation to living creatures. Proponents of both hypotheses possess numerous arguments to support their theories. The only obstacle to establish nanobacteria as living organisms is an absence of sequenced genome. Moreover, it is clear that nanobacteria, regardless of their nature, play an important role in etiopathogenesis of various diseases. Therefore, emergence of nanobacteria in the organism is a pathological, not a physiological, process. The classification of nanobacteria and new directions of the further investigations devoted to the their role in medicine and biology are proposed.
Key words: calcifying nanoparticles, nanobacteria, mineralo-protein complexes, diseases, a pathological process
Роль кальцифицирующихся наночастиц в этиопатогенезе заболеваний
Многими авторами были получены результаты, подтверждающие участие КН в этиопатогенезе
различных заболеваний, особенно связанных с патологической кальцификацией (см. табл. 3). Martel и соавт. [6] выдвинули гипотезу о некорректности использования широко применяемой Y-облученной
