CC BY
105
УДК 623.19.47
В. Д. Борисов*, С. В. Калёнов.
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия, 125047, Москва, Миусская площадь, 9
*e-mail:bbd4200@gmail.com
ИЗУЧЕНИЕ АССОЦИИРОВАННЫХ С МИКРОВОДОРОСЛЬЮ DUNALIELLA SALINA КУЛЬТУР ЭКСТРЕМАЛЬНО ГАЛОФИЛЬНОГО СООБЩЕСТВА ОЗЕРА ШОТТ-ЭЛЬ-ДЖЕРИД
Выделены и идентифицированы метаболически связанные с водорослью Dunaliella salina культуры экстремально галофильного консорциума солевого озера Шотт-Эль-Джерид (Тунис): Salicola marasensis и Lysinibacillus xylanilyticus; исследованы ростовые характеристики выделенных индивидуальных культур и их потребности в ростовых факторах; показана возможность устойчивого совместного культивирования выделенных культур и солелюбивой микроводоросли.
Ключевые слова: экстремальные галофилы, галофильные сообщества, смешанные культуры.
Галофильные микроорганизмы, обитающие в солевых озерах и солончаках выработали специфические механизмы устойчивости к экстремальным условиям: высокие температуры и концентрации солей необходимы им для поддержания гомеостаза, сохранения устойчивости сообщества. Эти микроорганизмы подвержены воздействию ультрафиолетового излучения, частой нехватки кислорода и источников питания. Существовать в таких экстремальных условиях им позволяет особое строение мембраны, ферменты, функционирующие при высокой температуре, специфические компоненты клетки. Например, клеточная стенка многих экстремальных галофилов не содержит пептидогликан, а построена из регулярно расположенных гексагональных субъединиц (S-слоя), состоящих в основном из гликопротеинов, которые поддерживают нативную форму клетки. Так же в молекулах липидов глицерин связан с фитанолом, а не с остатками жирных кислот, как у большинства бактреий. Важную роль играет эктоин: он одновременно регулирует осмотический стресс и стабилизирует работу ферментов, нуклеиновых кислот и мембрану клетки, при этом не включаясь в метаболические пути. Микроводоросли Dunaliella salina выживают благодаря высоким концентрациям ß-каротина, защищающим водоросли от интенсивного светового излучения и высоким концентрациям глицерина, защищающим от осмотического давления. Жизнь в сильносоленой среде привела к выработке у галофилов мощной системы активного транспорта, благодаря которой концентрация Na+ в цитоплазме поддерживается на низком уровне, несмотря на колоссальный концентрационный градиент Na+ на клеточной мембране.
Первичным источником углерода в экстремально галофильных сообществах являются солелюбивые водоросли, например Dunaliella salina, Dunaliella parva и др. Наибольший интерес представляет Dunaliella salina, так как является источником ß-
каротина и глицерина, который необходим для существования галофильных бактерий.
Работ, посвященных галофильным сообществам, в которых бы разбирались трофические связи входящих в них микроорганизмов, немного. Имеются лишь отдельные публикации, констатирующие в общих чертах видовой состав и определенную динамику его изменения, причем причины тех или иных изменений в сообществе не выявляются [Oren A., 2002]. Однако установлено, что большинство таких сообществ включает солелюбивые микроводоросли и галобактерии и их видовой состав определяется световым, солевым, температурным режимами соленых водоемов. Параметры подобной среды обитания, как правило, формируют биоценоз, который обеднен по видовому составу и представлен обычно доминирующей культурой водорослей, выдерживающей резкие перепады и широкие границы солености [Р.П. Тренкеншу и др., 2005], а также несколькими видами доминирующих галобактерий, обеспечивающих до 90% всей бактериальной биомассы. Система с двумя-тремя доминирующими микроорганизмами идеально подходит как модельная для лабораторных исследований.
Именно устойчивость галофилов к внешним факторам вызывает к ним все больший интерес со стороны биотехнологов, т. к. они являются источником многих БАВ, а среда их обитания позволяет проводить культивирование в нестерильных условиях, ведь немногие живые объекты способны выдержать те воздействия, при которых растут галофильные микроорганизмы.
В данной работе изучены микроорганизмы, выделенные из ассоциата с одноклеточной зеленой водорослью Dunaliella salina (природный источник -озеро Шотт-Эль-Джерид, Тунис) методом накопительных культур на агаризованной среде Семененко (116 г/л NaCl) при интенсивном освещении и температуре 25-28 °С. Состав сбалансированной среды Семененко для культивирования зеленой микроводоросли Dunaliella
salina, (г/л): КШз - 5,0; КН2РО4 - 1,25; Ы§8О4 - 50; Ре8й4х7Ы2О - 0,009; NaCl - 116; EDTA - 0,037; 2 мл раствора микроэлементов. Питательные компоненты для культивирования выделенного галофильного сообщества оптимизировались по методу математического планирования Плакетта-Бермана. Использовались среды с различным содержанием питательных компонентов, фиксировался прирост биомассы. В результате оптимизации установлены потребности бактерий в источниках питания, среди которых предпочтительны комплексные источники аминокислот, витаминов, других ростовых факторов. Найден оптимум концентраций компонентов для роста и показано ингибирующее действие чрезмерного количества определенных органических субстратов. В модельных экспериментах сообщество выращивалось на среде следующего состава (г/л): NaCl, 250; MgS04*7H20, 20; KCl, 2; цитрат Na, 3; триптон, 5; дрожжевой экстракт, 2; глицерин, 4 мл/л. Культивирование проводилось на качалке G10 New Brunswick при 180 об/мин, освещенности 500 Лк, температуре 38,5°С 7 суток. Для определения морфологии колоний проводились высевы на агаризованные среды в чашки Петри (методом Коха), среды готовились на основе бобового отвара с
добавлением раствора микроэлементов по Федорову для идентификации культур, так как различные микроорганизмы окрашиваются на бобовом отваре по-разному. Чашки Петри помещались в эксикатор для создания 100% влажности. Для определения ферментативных активностей были использованы жидкие питательные среды со специфичном составом, например, для определения наличия целлюлаз в качестве источника углерода использовалась целлюлоза.
При высеве исходного образца на агаризованную среду выделены 2 основные культуры, фенотипические характеристики которых приведены в таблице 1. Опираясь на фентотипические признаки, сообщество было разделено на белую культуру (образец 1) и оранжевую (образец 2). В результате 16Б-рРНК- анализа было установлено, что в образце 1 доминируют бактерии Salicola marasensis (рис. 1), а в образце 2 - Lysinibacillus xylanilyticus (рис. 2). Также присутствуют незначительные количества Geobacillus stearothermophilus и Pseudomonas halophila в обоих образцах. Идентификация проводилась с использованием бактериальной праймерной системы (511-519г).
Таблица 1. Фенотипические характеристики культур
Характеристика Salicola marasensis LysmibaciПus xylanilyticus
Форма колонии круглая круглая с валиком по краю
Профиль колонии плоский выпуклый
Край колонии гладкий гладкий
Структура колонии однородная однородная
Поверхность колонии гладкая гладкая
Блеск и прозрачность колонии блестящая блестящая
Цвет колонии оранжевая белая
Консистенция колонии легко снимается с агара слизистая, прилипает к петле
Форма клеток кокки бациллы
Взаимное расположение клеток отдельные клетки отдельные клетки
Рисунок 1. БаИсо1а шагаяетЬ на агаризованной среде Рисунок 2. Lysinibacillus ху1апйуйсш на скошенном агаре
Изучены ферментативные активности для каждого образца. Данные приведены в таблице 2.
Таблица 2. Биохимические характеристики культур
Активность Микроорганизмы
Salicola marasensis Lysinibacillus xylanilyticus
Целлюлазная + +
Амилазная + +
Нитрогеназная + -
При одновременном инокулировании минеральной среды галофильными бактериями и микроводорослями, и культивировании первые две недели при 28 °С в микроаэрофильных условиях, а в дальнейшем при 38,5 °С в режиме интенсивного газообмена получены следующие результаты: после активного накопления биомассы Dunaliella salina при повышении температуры и аэрации наблюдается скачок роста бактерий с уменьшением количества водорослей. Дальнейшие исследования могут послужить основой создания управляемой смешанной популяции галофильных микроорганизмов, а также сред для культивирования ранее некультивируемых культур, находящихся в составе экстремально галофильного сообщества.
В ходе работы выделены доминирующие культуры галофильного сообщества; начато изучение поведения микроорганизмов в различных условиях; получены первичные данные о причинах изменения соотношения микроорганизмов в сообществе; оптимизирована питательная среда для культивирования. Представленные в данной работе бактерии, в силу того, что могут потреблять широкий спектр субстратов и обладают высокими ферментативными активностями, могут найти применение в биотехнологии. Показана возможность совместного культивирования галобактерий с микроводорослями.
Борисов Владимир Дмитриевич, студент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Калёнов Сергей Владимирович, к. т. н., доцент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Литература
1. Р.П.Тренкеншу. Основы промышленного культивирования дуналиеллы солоноводной (Dunaliella salina teod.) // Р.П.Тренкеншу, Р. Г. Геворгиз, А. Б. Боровков. - Севастополь., НПЦ «ЭКОСИ-Гидрофизика», 2005. - 10 с.
2. Abdeljabbar Hedi и др. Prokaryotic biodiversity of halophilic microorganisms isolated from Sehline Sebkha Salt Lake (Tunisia) // African Journal of Microbiology Research. -2013. -№8(4). -с.355-367
3. Oren A. Halophilic microorganisms and their environment // Oren A. - USA, 2002. - 358 с.
4. Shiladitya DasSarma, Priya DasSarma. Halophiles // John Wiley & Sons. - 2012. - с.1-11.
Borisov Vladimir Dmitrievich*, Kalenov Sergei Vladimirovich
D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia. *e-mail: bbd4200@gmail.com
THE STUDY OF THE CULTURES ASSOCIATED TO MICROALGAE DUNALIELLA SALINA OF EXTREME HALOPHILIC COMMUNITY OF CHOTT EL DJERID LAKE
Abstract
Metabolic-related to algae Dunaliella salina cultures of exteme halophilic consortium of salt lake Chott el Djerid (Tunisia): Salicola marasensis and Lysinibacillus xylanilyticus were isolated and identified; the investigation of growth characteristics of isolated individual cultures and their needs for growth factors were perfomed; the possibility of sustainable co-cultivation of the isolates and halophilic microalgae were shown.
Keywords: extreme halophiles, halophilic associations, mixed cultures
