CC BY
18
УДК 582.998:581.144.4/ 615.453.3] 616-092.9; 615.015.42
http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2226-7425-2019-21-4-29-34
ИЗУЧЕНИЕ АНТИРАДИКАЛЬНОГО И АНТИОКСИДАНТНОГО ДЕЙСТВИЯ ЭКСТРАКТОВ ИЗ ЛИСТЬЕВ АЛЬФРЕДИИ ПОНИКШЕЙ (ALFREDIA CERNUA)
Компанцев Д.В., Семёнова Н.Н., Поздняков Д.И.,
Шаталова Т.А., Хаджиева З.Д., Аджиахметова С.Л., Червоная Н.М.
Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ФГБОУВО ВолгГму, г. Пятигорск, Российская Федерация
Аннотация. При изучении антирадикальной активности нами были использованы сухие гранулированные экстракты альфредии. Жидкие извлечения для них были получены путем последовательного экстрагирования одной и той же порции сырья с использованием этанола (95%, 70%, 40% - ИЭ40, ИЭ70 и ИЭ95, соответственно). Антирадикальную активность изучали с помощью следующих методов: DPPH, оценки гидроксил-радикальной - антирадикальной активности, оценки супероксид-радикал - антирадикальной активности, оценки нитрозил-радикал - антирадикальной активности. В результате проведения эксперимента было установлено, что все экстракты обладали антирадикальной активностью. Максимально выраженными антирадикальными свойствами обладал объект ИЭ40. При этом по величине антирадикальной активности экстракт ИЭ40 был сопоставим с препаратом сравнения - экстрактом гинкго билоба.
На втором этапе эксперимента нами была изучена анти-оксидантная активность извлечений из листьев альфредии с использованием жидкостного хроматографа «Цвет Яуза-01-АА». При изучении антиоксидантной активности были использованы извлечения, полученные с использованием этанола (95%, 70%, 40%) и воды очищенной. При исследовании антиоксидантной активности извлечений из листьев альфредии (экстрагенты: этанол 95%, 70%, 40% и вода очищенная) выявлено, что все исследуемые образцы содержали антиоксиданты. Максимальное содержание антиоксидантов выявлено в извлечении, полученном экстракцией водой очищенной 6,192±0,042мг/г (впересчете на кверцетин) и 4,031±0,026мг/г (в пересчете на галловую кислоту).
Ключевые слова: листья альфредии поникшей, гранулированные экстракты, антиоксидантная активность, антирадикальная активность, эксперименты in vitro.
THE STUDY OF THE ANTIRADICAL AND ANTIOXIDANT ACTION OF THE GRANULAR EXTRACTS FROM THE LEAVES OF THE ALFREDIA CERNUA
Kompancev D. V., Semenova N.N., Pozdnyakov D.I., Shatalova T.A., Hadzhieva Z.D., Adzhiahmetova S.L., Chervonaya N.M.
Pyatigorsk medical pharmaceutical institute of Volgograd state medical university, Pyatigorsk, Russian Federation
Annotation. In the study of the antiradical activity we used dry granular extracts of Alfredia cernua. Fluid extract them was obtained by successive extraction of the same portion of raw material with ethanol (95%, 70%, 40% - M340, H370 and H395, respectively). We studied antiradical activity using the following methods: DPPH, estimates of hydroxyl radical antiradical activity, estimates of superoxide radical antiradical activity, estimates of nitrosyl radical antiradical activity. As a result of the experiment, we found that all the extracts had antiradical activity. Object H340 had the maximum pronounced antiradical properties. Extract H340 was comparable with the drug comparison, Ginkgo biloba largest antiradical activity. At the second stage of the experiment, we studied the antioxidant activity of extracts from the leaves of Alfredia cernua using a liquid chromatograph "color Yauza-01-AA". We measured the mass concentration of antioxidants using a calibration graph of the output signal versus the concentration of quercetin and/or Gallic acid. In the study of antioxidant activity, we used extracts obtained using with the ethanol (95%, 70%, 40%) and a purified water. All studied samples of extracts from the leaves of Alfredo (extractants: ethanol 95%, 70%, 40% and purified water) contained antioxidants. The content of antioxidants in the extracts increased with a decrease in the concentration of the extractant. Extraction obtained by extraction with purified water contained a maximum amount of 6,192±0,042 mg/g (in terms of quercetin) and 4,031±0,026 mg/g (in terms of Gallic acid).
Key words: the leaves of Alfredia cernua, the granular extracts, antioxidant activity, antiradical activity, experiments in vitro.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
REFERENCES
---■—
Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК
~ 29 ~
http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2226-7425-2019-21-4 —--—
i Шилова И.В., Суслов Н.И., Самылина И.А. Химический состав и ноотропная активность растений Сибири. - Томск, 2010. 236 с.
[2] Разработка технологии экстрагирования листьев аль-фредии поникшей (Alfredia cemua)/ Семёнова Н.Н., Компанцев Д.В., Шаталова Т.А., Мичник О.В., Мич-ник Л.А., Стригун Н.С.//Журнал научных статей Здоровье и образование в XXI веке. 2018. Т. 20. № 12. С. 149-154.
[3] Mensor L.L., Menezes F.S., Leitao G.G., Reis A.S., dos Santos T.C., Coube C.S., et al. Screening of Brazilian plant extracts for antioxidant activity by the use of DPPH free radical method. //Phytotherapy Research. 2001. Vol. 15. P.127-30.
[4] Elizabeth K., Rao M.N. Oxygen radical scavenging activity of curcumin. // International Journal Of Pharmaceu-tics.1990. Vol. 58. Р. 237-40.
[5] Winterbourn C.C., Hawkins R.E., Brian M., Carrell R.W. The estimation of red cell superoxide dismutase activity. // The Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 1975. Vol. 85. Р. 337-41.
[6] Marcocci L., Maguire J.J., Droy-Lefaix M.T., Packer L. The nitric oxide-scavenging properties of Ginkgo biloba extract EGb 761. // Biochemical and Biophysical Research Communications. 1994. Vol. 201. Р. 748-55.
[7] Аджиахметова С.Л. Антиоксидантная активность экстрактов из листьев, плодов и стеблей крыжовника отклоненного (Grossularia reclinata (L.) Mill.) // Фундаментальные исследования. 2013. №10(6). С.1297-1301. (Режим доступа: http://www.rae.ru/fs/pdf/2013/10-6/32535.) (дата обращения: 12.02.2019)
[8] Яшин А.Я., Яшин Я.И. Прибор для определения анти-оксидантной активности растительных лекарственных экстрактов и напитков. // Журнал научных статей Международная информационная система по резонансным технологиям. 2004. №34. С.10-14.
[9] Патент 2238554 Российская Федерация Способ определения суммарной антиоксидантной активности биологически активных веществ /В.П. Пахомов, Яшин Я.И., Яшин А.Я., Багирова В.Л., Арзамасцев А.П., Кукес В.Г., Ших Е.В. Опубл. 20.10.04. Бюл. № 15. - 3 с.
[10] Яшин А.Я. Инжекционно-проточная система с ампе-рометрическим детектором для селективного определения антиоксидантов в пищевых продуктах и напитках. // Российский химический журнал (Журнал Российского химического общества им. Д.И. Менделеева). 2008. № 2. С.130-135._
[1] Shilova I.V., Suslov N.I. Samylina I.A. Chemical composition and nootropic activity of plants in Siberia. - Tomsk, 2010, 236 p. (in Russian)
[2] Development of technology for extraction of the leaves of Alfredia drooping (Alfredia Cernua). Semenova N.N., Kompancev D.V., Shatalova T.A., Michnik O.V., Michnik L.A., Strigun N.S. Journal of scientific articles Health & Education millennium, 2018, vol. 20, No.12, p.p. 149-154. (in Russian)
[3] Mensor L.L., Menezes F.S., Leitao G.G., Reis A.S., dos Santos T.C., Coube C.S., et al. Screening ofBrazilian plant extracts for antioxidant activity by the use of DPPH free radical method. PhytotherapyResearch. 2001, vol. 15, p.p.127-30. (in English)
[4] Elizabeth K., Rao M.N. Oxygen radical scavenging activity of curcumin. International Journal Of Pharmaceu-tics.1990, vol. 58, p.p. 237-40. (in English)
[5] Winterbourn C.C., Hawkins R.E., Brian M., Carrell R.W. The estimation of red cell superoxide dismutase activity. The Journal of Laboratory and Clinical Medicine.1975, vol. 85, p.p. 337-41. (in English)
[6] Marcocci L., Maguire J.J., Droy-Lefaix M.T., Packer L. The nitric oxide-scavenging properties of Ginkgo biloba extract EGb 761. Biochemical and Biophysical Research Communications.1994, vol. 201, p.p. 748-55. (in English)
[7] Adzhiakhmetova S.L. Antioxidant activity of extracts from leaves, fruits and stems of rejected gooseberry (Grossularia reclinata (L.) Mill.). Fundamental research. 2013, №10(6), p.p.1297-1301. (access mode: URL http://www.rae.ru/fs/pdf/2013/10-6/32535.) (date of treatment: 18.01.2019) (in Russian)
[8] Yashin A.Y., Yashin Y.I. Device for determination of an-tioxidant activity of herbal medicinal extracts and beverages. Journal of scientific articles of the international information system on resonance technologies. 2004, No.34, p.p.10-14. (in Russian)
[9] RU 2238554. Method for determining the total antioxidant activity of biologically active substances. Pakhomov V.P., Yashin A.Y., Yashin Y.I., Bagirova V.L., Arzamastsev A.P., Kukes V.G., Shikh E.V. Publ. 20.10.04, Issue. No. 15, 3 p. (in Russian)
[10] Yashin A.Y. Injection-flow system with amperometric detector for the selective determination of antioxidants in food and beverages. Russian chemical journal (Journal of the Russian chemical society. D.I. Mendeleev). 2008, No.2, p.p.130-135. (in Russian)
Лекарственные растения с ноотропным и антиокси-дантным эффектами применяются в комплексной терапии церебральных ишемических состояний [1]. Аль-фредия поникшая - источник растительного сырья, обладающего ноотропным действием и содержащее комплекс биологически активных веществ (флавоноиды, оксикоричные кислоты и др.) [1].
Целью исследования является изучение антирадикального и антиоксидантного действия экстрактов листьев альфредии поникшей.
Материалы и методы исследования. В качестве объектов исследования при изучении антирадикальной активности использовали гранулированные экстракты альфредии. Технология экстрактов заключалась в том, что одна и та же порция листьев альфредии последовательно экстрагировалась этанолом различной концентрации (95%, 70%, 40%) и водой очищенной [2], затем вытяжки, полученные с помощью спирта, переносили на вспомогательные вещества, например, на полипласдон, смесь гранулировали и
http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2226-7425-2019-21-4
—--—-
высушивали. Гранулированные экстракты, полученные с использованием 95%, 70%, 40% этанола (ИЭ95, ИЭ70, ИЭ40, соответственно) были использованы для изучения их антирадикальной активности с помощью методов, основанных на реакциях связывания биологически активных веществ (БАВ) экстрактов с продуктами деградации:
1) 2,2-дифенил-1-пикрилгидрозила (метод DPPH или метод Мешог) [3];
2) 2-дезоксирибозы и тиобарбитуровой кислотой (метод оценки гидроксил-радикальной - антирадикальной активности) [4];
3) рибофлавина (метод оценки супероксид-радикал -антирадикальной активности) [5];
4) нитропруссида натрия (метод оценки нитрозил-ра-дикал - антирадикальной активности) [6].
Полученные в ходе эксперимента данные статистически обрабатывали и рассчитывали величину ГС50 методом пробит-анализа.
Также нами была изучена антиоксидантная активность извлечений из листьев альфредии. Массовую концентрацию антиоксидантов в них измеряли, используя градуировочный график зависимости выходного сигнала от концентрации кверцетина и/или галловой
при изучении антиоксидантной активности были использованы извлечения, полученные путем троекратной обработки 1 г сырья (точная навеска) экстраген-том. Режим экстрагирования: кипячение на водяной бане в течение 30 минут с использованием 30 мл экс-трагента. Каждую порцию извлечения фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл. После окончания экстрагирования фильтр промывали экстрагентом и доводили объем фильтрата до метки. Экстрагирование начинали с 95% этанола и получали 100 мл экстракта, сырье подсушивали на фильтре при комнатной температуре до удаления запаха спирта, продолжали экстрагирование этой же порции сырья в тех же условиях 70% этанолом. Процесс повторяли с 40% этанолом и водой очищенной и получали 4 извлечения. В случае необходимости пробу разбавляли [7-10]. Концентрации антиоксидантов в извлечениях определяли исходя из площадей пиков дифференциальных кривых соответствующих экстрактов [710].
Результаты исследования. Результаты изучения DPPH - ингибирующих свойств экстрактов ИЭ40, ИЭ70, ИЭ95 и препарата сравнения - экстракта гингко билоба (ЭГБ) представлены на рисунке 1.
кислоты [8-10]. В качестве объектов исследования
90,00 80,00 £ 70,00 ! 60,00 g. 50,00 40,00 х 30,00 ^ 20,00 10,00 0,00
DPPH-радикал
0,00
200,00
400,00
600,00
800,00
1 000,00
1 200,00 цг/мл
ЭГБ
ИЭ40
ИЭ70
ИЭ95
Рис. 1. DPPH-радикал ингибирующие свойства изучаемых экстрактов в сравнении с экстрактом гинкго билоба
Анализ данных, представленных на рисунке 1, показывает, что DPPH - ингибирующие свойства были установлены для всех использованных в работе экстрактов. Так для референтного экстракта ЭГБ величина 1С50 при оценке анти DPPH -радикальной активности, составила 393 мкг/мл. Для изучаемых экстрактов ИЭ40, ИЭ70 и ИЭ95 значение ГС50 было выше в сравнении с референтом: ГС50 ИЭ40=475,6 мкг/мл; ГС50 ИЭ70=565,9 мкг/мл; ГС50 ИЭ95=520,6 мкг/мл. При этом
максимальная ингибирующая активность экстракта гинкго билоба и объекта ИЭ40 были сопоставимы между собой: 83,1% и 80,1% в концентрации 1000 мкг/мл, соответственно.
Результаты изучения гидроксил радикал-ингибиру-ющих свойств экстрактов ИЭ40, ИЭ70, ИЭ95 и препарата сравнения - экстракта гингко билоба (ЭГБ) представлены на рисунке 2.
http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2226-7425-2019-21-4 —--—-
Рис. 2. Гидроксил-радикал ингибирующие свойства изучаемых экстрактов в сравнении с экстрактом гинкго би-
лоба
Анализ данных, представленных на рисунке 2, показывает, что гидроксил радикал-ингибирующие свойства установлены для всех изучаемых объектов. Для референтного экстракта ЭГБ величина ГС50 составляла 355,1 мкг/мл - 80,2%. При этом ГС50 для изучаемого экстракта ИЭ40 была незначительно выше в сравнении
с экстрактом гинкго билоба (1С50=404,2 мкг/мл). Показатель 1С50 для экстрактов ИЭ70 и ИЭ95 составлял 649,2 мкг/мл и 603,8 мкг/мл, соответственно. Максимальное ингибирование генерации гидроксил-ради-кала отмечено при внесении в модельную среду референтного экстракта ЭГБ и составляло 80,2%.
90
80
70
к
S X 60
те
CQ
О 50
5
ю 5 40
I
S 30
20
10
0
Супероксид-радикал
цг/мл
200
400
600
800
1000
1200
ЭГБ
ИЭ40
ИЭ70
ИЭ95
Рис. 3. Супероксид-радикал ингибирующие свойства изучаемых экстрактов в сравнении с экстрактом гинкго
билоба
Результаты изучения супероксид-радикал-ингиби-рующих свойств экстрактов ИЭ40, ИЭ70, ИЭ95 и препарата сравнения - экстракта гингко билоба (ЭГБ) представлены на рисунке 3.
Анализ данных, представленных на рисунке 3, показывает, что при исследовании способности изучаемых экстрактов подавлять образование в модельной среде супероксид-радикала установлено, что для
Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК
~ 32 ~
0
http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2226-7425-2019-21-4
—--—-
референта - ЭГБ значение ГС50 составляло 474 мкг/мл. В тоже время для изучаемого объекта ИЭ40 данный показатель составлял 400,9 мкг/мл, что было существенно ниже в сравнении с величиной 1С50, полученной для объектов ИЭ70 (1С50=568,9 мкг/мл) и ИЭ95 (1С50=571,4 мкг/мл). Максимальная ингибирующая способность отмечена для исследуемого экстракта ИЭ40 в концентрации 1000 мкг/мл - 82,4%.
Результаты изучения нитрозил-радикал - ингибиру-ющих свойств экстрактов ИЭ40, ИЭ70, ИЭ95 и препарата сравнения - экстракта гингко билоба (ЭГБ) представлены на рисунке 4.
Анализ данных, представленных на рисунке 4, показывает, что при исследовании нитрозил-радикал
ингибирующих свойства изучаемых экстрактов установлено, что величина ГС50 для референтного ЭГБ составляла 480,9 мкг/мл, при максимальном показателе ингибирования образования нитрозил-радикала 87,3%. Для изучаемых экстрактов ИЭ40, ИЭ70 и ИЭ95 значение 1С50 при ингибировании генерации нитрозил радикала составляло 433,9 мкг/мл; 564,8 мкг/мл и 674,3 мкг/мл. При этом максимальный процент ингибиции отмечен для объекта ИЭ40 - 88,9%. Результаты исследований по изучению антиоксидантной активности извлечений из листьев альфредии (площади пиков, а также концентрации антиоксидантов в пересчете на кверцетин и галловую кислоту) представлены в таблице 1.
100
90
80
70
60
50
40 s
2? 30 20 10 0
Нитрозил-радикал
цг/мл
0
200
400
600
800
1000
1200
ЭГБ
ИЭ40
ИЭ70
ИЭ95
Рис. 4. Нитрозил-радикал ингибирующие свойства изучаемых экстрактов в сравнении
с экстрактом гинкго билоба
Таблица 1
Содержание антиоксидантов (в пересчете на кверцетин и галловую кислоту) в извлечениях из
листьев альфредии
Название сырья Экстрагенты Площадь пика (Эп нА/с) Кратность разбавления образца, взятого на анализ Содержание антиоксидантов
в пересчете на кверцетин, мг/г в пересчете на галловую кислоту, мг/г
Листья альфредии Этанол 95% 3574,43 - 0,331±0,002 0,212±0,002
Этанол 70% 4890,30 3 1,371±0,008 0,889±0,006
Этанол 40% 4203,78 5 1,948±0,007 1,259±0,006
вода очищенная 4747,07 14 6,192±0,042 4,031±0,026
Анализ данных, представленных в таблице, показал, что все экстракты имеют антиоксидантную активность. Установлено, что содержание антиоксидантов в
извлечениях возрастает при уменьшении концентрации спирта и достигает максимального значения в извлечении, полученном экстракцией водой очищенной,
http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2226-7425-2019-21-4 —--—-
-6,192±0,042 мг/г (в пересчете на кверцетин) и 4,031±0,026 мг/г (в пересчете на галловую кислоту).
Выводы. 1. При изучении антирадикальной активности экстрактов из листьев альфредии ИЭ40, ИЭ70 и ИЭ95 установлено, все они обладали данным видом активности (подавляли образование нитрозил, супероксид, гидроксил и DPPH-радикалов.). Активность экстрактов возрастала с уменьшением концентрации экстрагента. Максимально выраженными антирадикальными свойствами обладал объект ИЭ40. При этом по величине антирадикальной активности экстракт ИЭ40 был сопоставим с препаратом сравнения -
экстрактом гинкго билоба. 2. При исследовании анти-оксидантной активности извлечений из листьев альфредии (экстрагенты: этанол 95%, 70%, 40% и вода очищенная) выявлено, что все исследуемые образцы содержали антиоксиданты. Максимальное содержание антиоксидантов выявлено в извлечении, полученном экстракцией водой очищенной 6,192±0,042 мг/г (в пересчете на кверцетин) и 4,031±0,026 мг/г (в пересчете на галловую кислоту).
Конфликт интересов - нет.
