CC BY
40
СОВРЕМЕННЫЕ ФАРМАКО- И БИОПРЕПАРАТЫ
Для цитирования: Санин, А.В. Изучение антиоксидантных свойств Фоспренила в различных биологических тест-системах / А.В. Санин, УДК 619: 615
А.Н. Наровлянский, А.В. Пронин, Т.Н. Кожевникова, В.Ю. Санина, А.Д. Агафонова // Российский ветеринарный журнал. — 2017. — № 10. — С. For citation: Sanin A.V., Narovlyansky A.N., Pronin A.V., Kozhevnikova T.N., Sanina V.Yu., Agafonova A.D., Study of Phosprenyl Antioxidant Activity in Various Biological Test Systems, Rossijskij veterinarnyj zhurnal (Russian veterinary journal), 2017, No. 10, pp.
Изучение антиоксидантных свойств Фоспренила в различных биологических тест-системах
А.В. Санин, доктор биологических наук, профессор, зав. лаб. клеточного иммунитета ([email protected]),
A.Н. Наровлянский, доктор биологических наук, профессор, зав. лаб. цитокинов ([email protected]), А.В. Пронин, доктор биологических наук, профессор, зам. директора по научной работе ([email protected]), Т.Н. Кожевникова, кандидат медицинских наук, научный сотрудниклаб. клеточного иммунитета ([email protected]),
B.Ю. Санина, кандидат химических наук, ст. научный сотрудник лаб. клеточного иммунитета ([email protected]), АД. Агафонова, ветеринарный врач, младший научный сотрудник лаб. клеточного иммунитета ([email protected]).
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (ФГБУ ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи) (123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 18).
Препарат Фоспренил (ФП), широко применяемый в ветеринарной практике, обладает иммуномодулирующими, противовирусными, противовоспалительными, адъювантными, панкреопротекторными и иными фармакологическими свойствами. Цель настоящей работы заключалась в изучении антиоксидантной активности ФП. Продукцию активных форм кислорода изучали в суспензии перитонеальных макрофагов крыс методом люминолзависимой хемилюми-несценции. ПОЛ индуцировали в инкубационной среде, содержащей микросомы печени крыс. Также использовали модельные системы: ксантин-ксантиноксидаза и «реактив Фентона».
Показано, что ФП проявляет антиоксидантные свойства в различных тест-системах. В частности, ФП активировал «дыхательный взрыв» и подавлял хемилюминесценцию, индуцированную форболмиристатацетатом (ФМА). При изучении влияния ФП на переоксидацию липидов микросом печени крыс, которую определяли по ингибиции образования малонового диальде-гида (МДА), также было установлено, что ФП проявляет антиоксидантные свойства. ЕС50 составила при этом 10 мкг/мл. В то же время при изучении способности ФП инактивировать гидроксильный радикал в модельной системе «реактив Фентона» было установлено, что в концентрациях 2...20 мкг/мл ФП проявил антиоксидантные, а в концентрациях 200...400 мкг/мл — прооксидантные свойства. Полученные данные о наличии у ФП антиоксидантной активности хорошо согласуются с ранее выявленными противовоспалительными свойствами ФП. Проявление прооксидантных свойств в высоких концентрациях свойственно и другим липофильным соединениям изопрено-идной природы, в частности, a-токоферолу, также как и ФП, проявляющему мембранопротекторные свойства.
Ключевые слова: фоспренил, полипренолы, антиокси-дантная активность, активные формы кислорода, гидроксильный радикал, перекисное окисление липидов Сокращения: КС — карбонильные соединения, МДА — малоновый диальдегид, ПОЛ—перекисное окисление липидов, ТБК — тиобарбитуровая кислота, ФМА — форболмиристатацетат, ФП — фоспренил, ЕС50 — half-maximal effective concentration (полумаксимальная эффективная концентрация)
Введение
Полипренолы, выделенные из хвои сибирской пихты, — исключительно активные в фармакологическом плане соединения. Доказано, что полипренолы, особенно в фосфо-рилированном виде, обладают иммуномодулирующими [2, 16, 17], противовирусными [2, 14], противовоспалительными [19], антитоксическими [5], адъювантными [10, 15], гепатопротекторными [14, 22], панкреопротекторными [20] и иными фармакологическими [8] свойствами.
Цель исследования
Изучить антиоксидантные свойства ФП — 0,4%-го по-липренилфосфата натрия, широко применяемого в ветеринарной практике [21].
Материалы и методы
Суспензию перитонеальных макрофагов крыс получали по экспериментальной схеме, описанной ранее [12]. Продукцию активных форм кислорода в ответ на стимуляцию посредством ФМА измеряли с помощью лю-
минолзависимой хемилюминесценции (окисление лю-минола активными формами кислорода с выделением аминофталата и испусканием кванта света). Для этого в ячейку помещали 500 мкл среды регистрации с pH=7.6, содержащей 0,9 % NaCl; 5 mM HEPES; 5 mM глюкозы; 1 mM CaCl2 и (10-5 моль) люминола, добавляли суспензию клеток, а затем, после инкубации, добавляли ФМА (10-6 моль/л). Хемилюминесценцию регистрировали на приборе «Liminometer 1251» (LKB, Швеция).
На основе полученных первичных данных рассчитывали параметры, характеризующие хемилюминесцент-ный ответ клеток: 1о — уровень спонтанного свечения клеток; 1/1о — относительное изменение интенсивности свечения клеток при их активации ФМА.
ПОЛ в опытах in vitro индуцировали в инкубационой среде, содержащей быстроокисляемый субстрат — микросомы печени крыс. Для получения микросом в гомоге-натах печени использовали стандартную методику [11].
Содержание МДА определяли по цветной реакции образующихся альдегидов с ТБК. К 50 мкл суспензии добавляли 450 мкл раствора ТБК в 2%-й ортофосфорной кислоте. Полученный раствор инкубировали при 100 оС в течение 1 ч и затем окрашенный продукт экстрагировали н-бута-нолом. Из спиртового экстракта регистрировали спектр в диапазоне 450.. .650 нм (спектрофотометр UV-Vis «Specord-M40», Carl Zeiss, Германия) и определяли оптическую плотность при 460, 500 и 532 нм, характерную для максимумов поглощения соответствующих ТБК-КС, учитывая, что для продукта конденсации ТБК-МДА характерно поглощение при 532 нм. Содержание МДА выражали в нмолях на мг.
Превращение флюорохромов под воздействием свободных радикалов кислорода изучали в модельных системах: влияние ОН' радикалов — в модифицированном реактиве Фентона [6]. Для генерации супероксида в разных экспериментах использовали систему ксантин-ксантинокси-даза [24]. При работе с ксантиноксидазай образец помещали в тонкостенный (0,00254 мм) тефлоновый капилляр, как и при работе с митохондриями, а запись спектров проводили при непрерывной продувке воздухом.
Результаты
Двумя главными точками приложения действия антиок-сидантов в живых системах являются липидная и водная фазы клетки, поэтому на первом этапе исследования было изучено влияние ФП в двух системах, в одной из которых (макрофаги, стимулированные ФМА) была охарактеризована концентрационная зависимость влияния изучаемого соединения на образование свободных радикалов кислорода в живых клетках на границах внешних мембран, в другой — его воздействие на протекание процесса переоксидации липидов печени и микросом [4].
Хемилюминесцентное исследование влияния ФП на продукцию активных форм кислорода фагоцитирующими клетками. При концентрации ФП 0 мкг/мл интенсивность спонтанной хемилюминесценцию клеток составила 16 мВ, при 2 мкг/мл — 19, при 20 — 160, при 200 — 24, при 400 мкг/мл — 13 мВ.
Как видно из представленных данных, ФП в концентрации 20 мкг/мл является сильным активатором «дыхательного взрыва», вполне сравнимым по биоэффекту с ФМА. В остальных концентрациях ФП не влиял на окислительный метаболизм фагоцитов.
При изучении влияния ФП на ФМА-активированную хемилюминесценцию получены следующие данные: при концентрации ФП 0 мкг/мл относительное изменение интенсивности свечения клеток при их активации ФМА (1/10) составило 12,0; при 2 — 9,1; при 20 — 0,5; при 200 — 1,0; при 400 мкг/мл — 1,1.
Прежде всего, обращает внимание, что клетки, обработанные ФП, не отвечают на активацию ФМА. Если ФМА вносить в суспензию уже активированную ФП (20 мкг/мл), то хемилюминесцентный ответ полностью подавляется, тогда как в концентрациях 200 и 400 мкг/мл, практически не влияя на спонтанную хемилюминесценцию, ФП полностью подавляет ответ, индуцированный ФМА.
Влияние ФП на переоксидацию липидов гомогената печени и микросом крыс. В следующей серии экспериментов исследовали влияние ФП на ПОЛ микросом печени крыс. О результатах судили по способности ФП ингибировать образование конечного продукта ПОЛ—МДА. Последний определяли стандартным методом по цветной реакции с ТБК [23]. Полученные результаты представлены в таблице 1.
Установлено, что ФП в концентрации 2 мкг/мл ин-гибирует процессы ПОЛ на 13,1 %, но уже в разведении
препарата 20 мкг/мл его активность возрастает до 71 %, а применяемый из расчета 200 и 400 мкг/мл ФП вызывает снижение выхода МДА на 88 % и 80,6 %, соответственно. Расчетная величина ЕС5о составляет 10 мкг/мл.
Таким образом, в использованной модели ФП проявляет антиоксидантные свойства. Результаты, полученные при исследовании препарата в двух описанных тест-системах, позволяют указать на его очевидные антиоксидантные свойства.
Второй этап исследования был направлен на подтверждение полученных результатов и углубление представлений о механизмах антиоксидантного действия ФП, в частности, на выявление конкретных типов свободных радикалов, с которыми способен взаимодействовать ФП.
Влияние ФП на образование свободных радикалов в модельной системе ксантин-ксантиноксидаза. Способность ФП инактивировать супероксидный анион радикал кислорода изучали в модельной ферментативной системе ксантин-ксан-тиноксидаза. Фермент ксантиноксидаза содержится в различных органах млекопитающих, поэтому использованная тест-система в некоторой степени моделирует условия т у1ус Полученные данные представлены в таблице 2.
2. Влияние ФП на образование супероксидного анион-радикала кислорода в системе ксантин-ксантиноксидаза 2. Phosprenyl influence on the formation of superoxide anion radical of oxygen in the xanthine-xanthine oxidase system
Концентрация ФП, мкг/мл Скорость образования супероксида, рМ/мин Подавление, %
0 2,52 -
2 2,59 0
20 2,59 0
200 2,27 12
400 2,16 16
ФП в концентрациях 2 и 20 мкг/мл не оказывал какого-либо влияния на скорость восстановления цитохрома, в разведении 200 мкг/мл незначительно инактивировал супероксидный анион-радикал, скорость восстановления цитохрома снижалась на 12 %, а при использовании препарата из расчета 400 мкг/мл этот показатель составил только 16 %.
Таким образом, способность ФП инактивировать супероксидный анион — радикал кислорода проявляется только при его использовании в концентрациях 200 и 400 мкг/мл и выражена весьма незначительно.
Влияние ФП на образование свободных радикалов в модельной системе гидропероксид-пероксидаза хрена. Исследование антиоксидантных свойств препарата было продолжено в системе «пероксид водорода + перок-сидаза хрена». Использовали фотометрический метод, основанный на опосредованном пероксидазой хрена окислении гидропероксидом водорода фенолового красного, окисленная форма которого отличается по спектру от восстановленной формы в области 600 нм.
В данной модельной системе ФП в исследованном диапазоне концентраций (2...400 мкг/мл) не оказывал влияния на содержание пероксида водорода.
Влияние ФП на образование свободных радикалов в модельной системе «реактив Фентона». Способность ФП инактивировать гидроксильный радикал исследовали в модельной системе «реактив Фентона». Для количественного определения образования гидроксильного радикала применяли хемилюминесцентный метод, оценивая све-тосумму за 1 минуту.
Получены следующие результаты: при концентрации ФП 0 подавление образования гидроксильного радикала ОН составило 100 % от контроля; при концентрации ФП
1. Влияние ФП на образование ТБК-активных продуктов в микросомальной системе 1. Phosprenyl influence on the formation of thiobarbituric acid active products in the microsomal system
Концентрация ФП, мкг/мл Содержание МДА, нМ/мг Подавление, %
0 15 -
2 13 13,1
20 4,3 71,0
200 1,8 88,0
400 2,9 80,6
А.В. Санин, А.Н. Наровлянский, А.В. Пронин, Т.Н. Кожевникова, В.Ю. Санина, А.Д. Агафонова
2 мкг/мл — 40,1 %; при 20 — 92,7; при 200 — 153,2; при 400 мкг/мл — 125,5 %.
Как видно из приведенных данных, ФП в концентрации 2 мкг/мл подавляет образование гидроксильного радикала на 59,9 % (процент генерации гидроксильного радикала от контроля 40,1), но при повышении концентрации ФП до 20 мкг/мл его ингибирующая активность уменьшалась почти в 7 раз (была зарегистрирована смена ингибирующей активности на потенцирующую). Действительно, при использовании в концентрации 200 мкг/мл ФП усиливает хемилюминесцентный ответ на 53,2 %, а в концентрации 400 мкг/мл — на 25,5 %.
Таким образом, в модельной системе «реактив Фентона» ФП в концентрациях 2...20 мкг/мл проявил антиоксидантные, а в концентрациях 200.400 мкг/мл — прооксидантные свойства.
Обсуждение
Свободнорадикальное окисление играет важнейшую роль в развитии многих заболеваний и патологических состояний, сопровождающихся нарушением барьерных функций клеточных мембран. Это относится к сердечно-сосудистой патологии, сахарному диабету, онкологическим, инфекционным и многим другим заболеваниям [1, 13]. Например, при гриппе и ряде других вирусных инфекций образование повышенных концентраций свободно-радикальных форм кислорода и активация процессов ПОЛ, нарушение равновесия в системе протеолитического контроля способствуют утяжелению инфекции [7].
Антиоксиданты обладают доказанной способностью подавлять интенсивность свободнорадикального окисления липидов и белков клеточных мембран, приводящего к их повреждению [3]. Природные полипренолы, являющиеся интегральными компонентами мембран всех живых клеток, играют ведущую роль в регуляции текучести и проницаемости мембран. Для организма наиболее ценны фосфорилированные полипренолы, так как они на несколько порядков превосходят по биологической активности свои нефосфорилированные производные. Полипренилфосфаты являются не только модификаторами мембран, но и в качестве витаминоподобных ам-фифильных соединений участвуют в формировании цепочек гликопротеидов, необходимых для регуляции и осуществления ряда жизненно важных функций клетки.
Наличие антиоксидантных свойств у полипренолов и их ацетатов было выявлено ранее [8], тогда как ан-тиоксидантную активность ФП прежде не изучали.
В настоящей работе показано, что ФП проявляет антиоксидантные свойства, что было продемонстрировано в различных тест-системах. Так, в концентрации 20 мкг/мл ФП является сильным активатором «дыхательного взрыва», вполне сравнимым по биоэффекту с ФМА. При изучении влияния ФП на ФМА-индуцированную хемилюминесценцию, было показано, что ФП в концентрациях 200 и 400 мкг/мл, практически не влияя на спонтанную хемилюминесценцию, полностью подавляет ответ, индуцированный ФМА.
В данной серии экспериментов была изучена антиоксида-нтная активность ФП в суспензии живых перитонеальных макрофагов крыс по измерению уровня реакции хемилюминес-ценции, развивающейся под действием ФМА. Последний изменяет метаболизм фагоцитирующих клеток: увеличивается ионная проницаемость, усиливается окисление глюкозы, резко возрастает потребление кислорода, то есть наблюдают «дыхательный взрыв». В его основе лежит резкая активация
гексозомонофосфатного шунта и окисление NАDРН ферментным комплексом NАDРН-оксидазой, которая восстанавливает кислород до супероксидного анион-радикала на внешней поверхности клеточной мембраны. Супероксидный анион-радикал является ключевым звеном одноэлектронного восстановления кислорода, его возникновение запускает свободно-радикальные процессы, неизбежно приводящие к формированию таких свободно-радикальных продуктов и их производных, как гидроксильный радикал, гидропероксид водорода, синглетный кислород. Использованный в работе хемилюминесцентный метод позволяет суммарно регистрировать все указанные активные формы кислорода.
Таким образом, следует заключить, что в концентрациях 200.400 мкг/мл ФП обладает в использованной тест-системе выраженными антиоксидантными свойствами. Природа активирующего влияния ФП в концентрации 20 мкг/мл на спонтанную клеточную хемилюминесцен-цию пока не ясна, что требует специального изучения.
В следующей серии экспериментов исследовали влияние ФП на переоксидацию липидов микросом печени крыс, которую определяли по способности ФП ингиби-ровать образование МДА. В данной модели также было установлено, что ФП проявляет антиоксидантные свойства. Расчетная величина ЕС50 составила 10 мкг/мл.
При изучении способности ФП инактивировать супероксидный анион радикал кислорода в модельной ферментативной системе ксантин-ксантиноксидаза было показано, что инактивация супероксидного аниона проявлялась только при использовании ФП в концентрациях 200 и 400 мкг/мл и была выражена весьма незначительно.
В то же время при изучении способности ФП инактивировать гидроксильный радикал в модельной системе «реактив Фентона» было установлено, что ФП в концентрации 2 мкг/мл подавляет образование гидроксильного радикала почти на 60 % , тогда как при повышении концентрации ФП до 20 мкг/мл была зарегистрирована смена ингибирующей активности на потенцирующую, а в концентрациях 200 и 400 мкг/мл ФП усиливал хемилюминесцентный ответ на 53 и 25,5 %, соответственно. Таким образом, в модельной системе «реактив Фентона» в эффекте ФП наблюдался дуализм: в концентрациях 2.20 мкг/мл ФП проявил антиоксидантные, а в концентрациях 200.400 мкг/мл — прооксидантные свойства.
Заключение
Полученные данные могут иметь важное значение. Прежде всего, это относится к наличию у ФП антиоксидантных свойств, проявляющихся в способности подавлять активные метаболиты кислорода, в первую очередь—свободные радикалы, которые обладают значительным деструктивным потенциалом, играющим важную роль в патогенезе воспаления. Гидроксильный радикал представляет собой наиболее реакционноспо-собную форму активных форм кислорода (время жизни 10-9 с). Он разрушает практически любую встретившуюся ему молекулу. Действуя на 8Н-группы и аминокислотные остатки белков, гидроксильный радикал вызывает денатурацию последних и инактивирует ферменты, а внедряясь в липидный слой, радикал гидроксила запускает реакции ПОЛ, что приводит к повреждению мембран [3, 25]. Как медиаторы воспаления, повреждающие эндотелиальные клетки, активные метаболиты кислорода способствуют поддержанию хронического воспаления. Доказано, например, что при гриппе образование свободных радикалов кислорода является одним из основных механизмов воспалительного процесса. Посколь-
ку ранее было показано, что ФП обладает выраженной противовоспалительной активностью [19], эти данные хорошо согласуются с выявленными у ФП свойствами антиоксиданта.
Анализ совокупности результатов проведенного исследования позволяет заключить, что ФП обладает ан-тиоксидантными и прооксидантными свойствами как в живых клетках, так и в модельных химических тест-системах. Выявление непосредственных механизмов этих эффектов и их концентрационно зависимых переходов требует дальнейшего изучения.
В определенных условиях антиоксиданты способны проявлять прооксидантные свойства [18]. Наличие прооксида-нтных свойств выявлено, например, у аскорбиновой кислоты, токоферолов, флавоноидов, каротиноидов, глута-тиона, куркумина и ряда других соединений с высокой ан-тиоксидантной активностью. Прооксидантное действие антиоксидантов может зависеть от различных факторов: химической природы антиоксиданта, концентрации самого антиоксиданта или иных компонентов тест-системы, наличия катионов металлов переходной валентности и др. [18]. Липофильные антиоксиданты, например, токоферолы, благодаря наличию в структуре изопреноидной цепи, встраиваются непосредственно в бислойную структуру мембран, защищая их от агрессивного воздействия радикалов. Поэтому антиоксидантная и мембранопротектор-ная роль токоферолов в живом организме считается наиболее обоснованной [9]. Причем для а-токоферола и фла-воноидов было показано, что их прооксидантное действие проявляется при более высоких концентрациях, чем анти-оксидантное, однако тонкий химический механизм этого явления пока не изучен [26]. Этим объясняется двойственность поведения а-токоферола в биологических системах: при физиологических концентрациях а-токоферол
выступает как антиоксидант, при избытке — его образующиеся радикалы оказывают прооксидантное повреждающее действие на мембраны. По-видимому, сходным образом может объясняться и описанный выше дуализм эффектов ФП, липофильного соединения, также обладающего изопреноидной структурой.
Библиографию см. на сайте издательства http://logospress.ru/page/2500
ABSTRACT
A.V. Sanin, A.N. Narovlyansky, A.V. Pronin, T.N. Kozhevnikova, V.Yu. Sanina, A.D. Agafonova.
Gamaleya Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology (18, Gamaleya st., Moscow, 123098).
Study of Phosprenyl Antioxidant Activity in Various Biological Test Systems. The
drug Phosprenyl (PP) widely used in veterinary practice is known to possess immunomodulatory, antiviral, antiinflammatory, adjuvant, pancreoprotective and other pharmacological properties.
The aim of this work was to study the antioxidant activity of PP Production of reactive oxygen species was studied in suspensions of rat peritoneal macrophages by method of luminol- dependent chemiluminescence. Induction of lipid peroxidation was produced in the incubation medium containing rat liver microsomes. Also used were the model system of xanthine- xanthine oxidase and «Fenton reagent». PP exhibited antioxidant properties in different test systems. It has activated the «respiratory burst» and inhibited the chemiluminescence induced by phorbolmiristatac-etate. When studying the effect of PP on peroxidation of liver microsomes lipids of rats, it was also found that PP exhibited antioxidant activity. EC50was 10 |jg/ml. At the same time, when studying the ability of PP to inactivate hydroxyl radical in the model system «Fenton reagent» it was found that in concentrations of 2...20 ig/ml PP exib-ted antioxidant activity, while at concentrations of 200.400 ig/ml — prooxidant effect. Results of antioxidant activity expression by PP are in good agreement with previously identified anti- inflammatory properties of PP The manifestation of prooxidant properties at high concentrations is also shown for other lipophilic compounds of isoprenoid nature, in particular, for a - tocopherol, which is also a known membrane-protective agent as well as PP.
Keywords: phosprenyl, polyprenols, antioxidant activity, reactive oxygen species, hydroxyl radical, lipid peroxidation.
