CC BY
67
I-
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ПРИБОРЫ ДЛЯ ПИЩЕВОМ ПРОМЫШЛЕННОСТИ
= ТЕМА НОМЕРА
УДК 6631.18:621.357
Изучение
антиоксидантной активности
пропионовокислых бактерий
Л.В. Драчева, канд. хим. наук Международная академия информатизации
Е.В. Дорожко, асп., О.А. Аврамчук, асп., Е.И. Короткова, канд. хим. наук, доц. Томский политехнический университет
Е.П. Рыжкова, д-р биол. наук, Ли Хао, асп., И.В. Данилова, канд. биол. наук Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова
Прямым высокочувствительным вольтамперометрическим методом установлено, что жидкие культуры пропионовокислых бактерий (Propionibacterium freudenreichii) способны проявлять антиоксидантный эффект. Это позволило рассчитать величину кинетического критерия, количественно характеризующего антиоксидантную активность данных культур.
Propionibacterium freudenreichii (P. Freudenreichii) - пропионовокислая бактерия (ПКБ), относящаяся к группе так называемых классических «молочнокислых» бактерий. По ряду свойств они близки к лактобациллам и бифидобактериям, которые обладают выраженными антиоксидантны-ми свойствами [1]. Основной продукт жизнедеятельности ПКБ - пропионо-вая кислота. Наряду с ней активно продуцируют и такие жизненно важные экзометаболиты, как витамины группы В, в том числе В12 и фолиевая кислота, а также свободные нуклео-тиды и ферменты [2]. Отличительная особенность ПКБ - повышенное содержание в их клетках витамина В12 (корриноидов).
Идея о том, что предел аэротолерантности ПКБ определен устойчивостью к действию кислорода за счет ферментной системы, содержащей супе-роксиддисмутазу, флавиновые оксида-зы, каталазу, пероксидазу, цитохромы и др., была высказана в 70-х годах прошлого века [3]. Обнаружение ферментов антиоксидантной защиты клеток ПКБ позволило подойти к объяснению их аэротолерантности [4].
Однако в условиях минимальной среды при свободном доступе воздуха ферменты, участвующие в нейтрализации молекулярного кислорода и/или его токсичных форм, сами нуждаются в защите от инактивирующего действия кислорода, и фактором этой защиты выступают корриноиды.
Корриноиды - сложные биомолекулы с уникальной кобальт-углеродной связью, обратимое расщепление кото-
рой определяет их многочисленные химические и биохимические функции [5].
Неоднозначность метаболизма ПКБ, возможность его перестроек констатирована при изучении влияния молекулярного кислорода на энергетический обмен этих бактерий, в котором, помимо основного процесса - пропионово-кислого брожения, включающего электрон-транспортную цепь с использованием фумарата в качестве конечного акцептора электронов, определенную роль играет и кислородное дыхание. Таким образом, молекулярный кислород служит фактором перестройки энергетического обмена ПКБ [6].
Сегодня пропионовокислые бактерии служат основным источником для производства витамина В12 а также используются в технологиях изготовления твердых сортов сыра типа «Швейцарского». Кроме того, продуцируя такие метаболиты, как пропионовая и уксусная кислоты, диацетил, пропиони-цины, данные бактерии проявляют антимикробные свойства, подавляя рост бацилл разных видов, а также микроскопических грибов. Поэтому их применяют в пищевой промышленности для пролонгации сроков хранения продуктов питания в качестве натуральных и эффективных консервантов [7].
С другой стороны, в ходе эволюции в организме человека была создана защитная иммунная система, которая базировалась на основании ферментов -супероксиддисмутазы, каталазы, окси-дазы, витаминов А, С, Е, коферментов и других соединений.
Активные формы кислорода (АФК) в умеренных концентрациях в живом организме выступают в роли медиаторов процессов передачи клеточного сигнала. Но в условиях повышенного содержания они оказывают повреждающее действие в виде избыточной концентрации свободных радикалов, поражающих биомакромолекулы (белков, ДНК) и клетки организма, в первую очередь разрушая липиды их мем-
бран. Поэтому для поддержания оптимальной концентрации АФК в организме человека, т. е. для защиты его иммунной системы от оксидативного стресса, необходимо использовать экзогенные антиоксиданты.
К антиоксидантам относится широкий круг органических соединений, обладающих антирадикальной и антиокислительной способностью. Разнообразие этих соединений обусловлено различиями в механизме их окисления - восстановления. При этом ПКБ выступают эффективно действующие биоантиоксиданты.
В работе использовали культуры штаммов Propionibacterium freuden-reichii RVS-2-ims (I) и Propionibacterium freudenreichii RVS-4-irf (II), изолированные из твердых сыров и селекционированные на кафедре микробиологии МГУ им. М.В. Ломоносова.
Общая концентрация клеток составила 9,10х108 КОЕ/см3 (I) и 9,0х108 КОЕ/см3 (II). Колонии подсчитаны с помощью микроскопа Laboval-4 (фирма Karl Zeiss Jena, Германия).
Бактерии культивировали 72 ч при 30 °C с периодической нейтрализацией образуемых кислот - пропионовой и уксусной и хранили при 6...10'C. Выращенные для анализа образцы имели рН 6,8-7,0.
Для изучения антиоксидантной активности пропионовокислых бактерий использовали электрохимический метод катодной вольтамперомет-рии. Методика эксперимента заключалась в получении вольтамперог-рамм катодного восстановления кислорода с помощью портативного программируемого анализатора «Анти-оксидант» (фирма «Полиант», г. Томск). Электрохимическая ячейка прибора представляет собой стеклянный стаканчик, в который последовательно помещали фоновый электролит и анализируемые образцы биопрепаратов ПКБ. В качестве фонового электролита был выбран фосфатный буфер (рН 6,86).
В электрохимической ячейке также находятся индикаторный ртутно-пле-ночный электрод, хлорид-серебряный электрод сравнения и хлорид-серебряный вспомогательный электрод.
Объемы отбираемых проб составляли 0,1; 0,5 и 1,0 см3. В работе использовали магнитную мешалку.
Антиоксидантную активность образцов определяли с помощью метода катодной вольтамперометрии, в частности, процесс электровосстановления кислорода (ЭВ О2) (стадии 1-4). Он обладает рядом преимуществ, но главное - в его основе лежит модельная реакция ЭВ О2, протекающая на индикаторном электроде по механизму, аналогичному восстановлению кисло-
рода в тканях и клетках организма человека:
В данном способе рассматривается одноэлектрон ное восстановление кислорода с образованием активных кислородных радикалов: О^-, НО2\ (стадии 1_3). Предполагается, что ан-тиоксиданты, имеющие восстановительную природу, реагируют с кислородом и его активными радикалами на поверхности индикаторного электрода, что отражается в уменьшении катодного тока ЭВ О2 на ртутно-пле-ночном электроде в области потенциалов от 0 до - 0,7 В по следующему механизму:
Вольтамперометрическим методом исследовали антиоксидантные свойства культуральной жидкости (питательная среда) и образцы двух анализируемых культур ПКБ.
На рисунке представлены вольтам-перограммы электровосстановления кислорода в отсутствие (1) и в присутствии образцов ПКБ при разбавлении 1:100 (А), 1:20 (В) и 1:10 (С) и различном времени проведения эксперимента (от 4 до 20 мин).
На примере исследованных образцов видно, что они проявляют выраженную антиоксидантную активность, уменьшая величину тока. При этом наиболее значительный эффект отмечен при наименьшем (1:10) разбавлении. Таким образом, чем выше концентрация ПКБ в анализируемом образце, тем более высокую антиокси-дантную активность показывает биопрепарат. Также следует отметить, что и питательная среда, хотя и в незначительной степени, также обладает анти-оксидантными свойствами.
В результате проведенных исследований построена зависимость изменения предельного тока электровосстановления кислорода от времени протекания процесса (см. рисунок).
На основании полученных данных была рассчитана количественная характеристика антиоксидантной активности ПКБ, в качестве которой использовали кинетический критерий К (мкмоль/дм3-мин). Он отражает количество прореагировавших с анализируемым образцом кислородных форм во времени, следствием чего является эффективность взаимодей-
ANALYTICAL DEVICES FOR FOOD PROCESSING INDUSTRY
Вольтамперограммы электровосстановления кислорода в отсутствие (1) и в присутствии (2-6) образца Propionibacterium freudenreichii RVS-2-ims при разбавлении 1:100 (А), 1:20 (В) и 1:10 (С) и при времени опыта 4 мин (2), 8 мин (3), 12 мин (4), 16 мин (5) 20 мин (6)
ствия образца с кислородными радикалами, которая определяется по формуле
где Со2 - концентрация кислорода в фоновом растворе, мкмоль/дм3; 1/-текущее значение предельного тока ЭВ О2 в присутствии анализируемого образца ПКБ, мкА; 10 - значение предельного тока ЭВ О2 в отсутствие анализируемого образца ПКБ, мкА; t- время протекания процесса, мин.
Полученные результаты обрабатывали следующим образом:
К5г - среднее значение кинетическо-
_ X*
го критерия: А' = ^—, 3
Б, - стандартное отклонение одного определения:
Значения кинетического критерия антиоксидантной активности К образцов жидких культур ПКБ и питательной среды (п = 3, P = 0,95)
S
относительное стандартное от-
Образец Разбавление Ks, мкмоль/дм3мин S r
Propionibacterium Freudenreichii-RVS-2-ims:
образец 1а 1:100 0,41 0,084
1:20 1,62 0,071
1:10 4,12 0,031
образец 1б 1:100 0,53 0,047
1:20 1,84 0,038
1:10 1,84 0,014
Propionibacterium Freudenreichii-RVS-4-irf:
образец 1а 1:100 0,51 0,031
1:20 1,53 0,016
1:10 3,68 0,020
образец 1б 1:100 0,41 0,057
1:20 1,56 0,049
1:10 3,82 0,020
Питательная 1:100 0,12 0,021
среда
1:20 0,24 0,023
1:10 0,38 0,022
клонение: S ==.
X
Рассчитанные значения кинетического критерия антиоксидантной активности для исследуемых образцов жидких культур ПКБ приведены в таблице.
Данные, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что образцы культур исследованных штаммов Propionibacterium freudenreichii RVS-2-ims (I) и Propionibacterium freudenreichii RVS-4-irf (II) обладают выраженными антиоксидантными свойствами. При этом образцы штамма I проявляют более высокую антиоксидантную активность в соответствии с величиной кинетического критерия по сравнению с образцами штамма II.
ЛИТЕРАТУРА
1. Драчева Л.В., Короткова Е.И., До-рожко Е.В.//Пищевая промышленность. 2008. №4. С. 28.
2. Hugenholtz J, Hunik J, Santos H, Smid E.//Lait №82. P. 103.
3. Ryzhkova E.P.//Applied Biochemistry and Microbiology. 2003. №39. P. 115.
4. Краева Н.И., Воробьева Л.И.//Микробиология. 1981. № 50. С. 813.
5. Pritchard G.G., Wimpenny J.W.T., Morris H.A., Levis M.W.A., Hughes D.E.//J. Gen. Microbiol. 1977. №102. P. 223.
6. Pritchard G.G., Asmundson R.V.// Adv. Microbiol. 1980. №126. P. 167.
7. Lind H, Jonsson H, Schnurer J.// International Journal of Food Microbiology. № 98. P. 157.
