CC BY
147
УДК 615.32:515.03
ИЗУЧЕНИЕ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ НЕКОТОРЫХ ДВУХОСНОВНЫХ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ В СОЧЕТАНИИ С ПРОПОЛИСОМ
Ю.С. Шишкова1, Е.В. Симонян1, О.С. Абрамовских1,
Ю.В. Шикова2, Д.М. Хасанова1, А.Д. Липская1, В.А. Ушакова1,
1ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет», г. Челябинск,
2ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет», г. Уфа,
Симонян Елена Владимировна - e-mail: elenasimonian@yandex.ru
На основании компьютерного моделирования структуры полифенолов и двухосновных карбоновых кислот, а также их комплексов рассчитаны некоторые фармакологические свойства кислот янтарной и фумаровой. Теоретически обоснована антиоксидантная и антимикробная активность. Экспериментально доказана антибактериальная активность исследуемых веществ в отношении представителей грамположительной и грамотрицательной микрофлоры. Установлено, что кислота янтарная оказывает неселективное антимикробное действие в отношении грамположительных, грамотрицательных бактерий и дрожжеподобных грибов. Кислота фумаровая проявляет свою антимикробную активность только в отношении
E. coli и C. а!ЫсапБ.
Ключевые слова: антибактериальная активность, кислота янтарная,
кислота фумаровая, прополис, рутин.
Some pharmacological properties of the succinis and fumaric acids were calculated according to the computer modeling of the structure of polyphenols, dibasic carboxylic acids and also their complexes. Antioxidant, antimicrobic and antiviral activity was theoretically substantiated. Antibacterial activity of the substances, according to their gram-positive and gram-negative microflora, has been proved practically. Nonselective antimicrobic action of succinic acid in the relation to Gram - positive, Gram - negative bacteria and yeast-like fungi has been established. Fumaric acid shows its antimicrobic activity only in the relation to E. coli and C. albicans.
Key words: antibacterial activity, succinic acid, fumaric acid, propolis, rutin.
Введение
Одной из актуальных задач современной медицины и фармации является поиск новых антимикробных средств, обладающих комплексным биоцидным действием. Это направление может быть перспективным в ряду двухосновных карбоновых кислот, среди которых следует выделить кислоты янтарную и фумаровую. Это двухосновные карбоновые кислоты, обладающие регидратирующим, антигипоксантным, антиоксидантным, диуретическим и дезинтоксикационным действиями [6]. Их широкий фармакологический спектр действия предполагает исследования по созданию новых лекарственных форм. Входящие в состав всех животных и растительных клеток организма с аэробным типом дыхания фумараты и сукцинаты способны предотвращать или устранять пост-гипоксические нарушения энергетического метаболизма в организме и метаболический ацидоз. При этом целесообразно использовать их в сочетании с природными биологически активными веществами подобного действия. К ним относится прополис богатый природными фенольными соединениями [9].
В связи с этим целью настоящего исследования было исследование антимикробного действия янтарной и фумаровой кислот, экстракта прополиса, а также модельных смесей этих соединений.
Материалы и методы
С целью изучения антимикробного эффекта двухосновных карбоновых кислот, их сочетаний с прополисом были
проведены теоретические расчеты, позволяющие выявить оптимальное взаимодействие веществ с биологически активными веществами, содержащимися в прополисе. Моделирование тестируемых комплексов осуществляли при помощи программного пакета Mech, который использует генетические алгоритмы формирования молекулярных ассоциатов в полимолекулярных системах. Различные виды фармакологической активности определяли, используя программный пакет: 3D/4D QSAR алгоритм BiS/MC (multi-conformational) для мультиконформационного анализа биологически активных соединений, их ориентации и докинга в полостях рецептора [1, 2]. Для решения задачи ориентации имеется ряд подходов. В основе большинства методов лежит предположение о геометрическом соответствии фармакофорной части молекулы сайту рецептора. Для размещения в полости рецептора используется пространствозаполняющая модель. В разных вариантах решения использовались жесткие сферы и сферы с переменной жесткостью. Это, как правило, позволяет установить верную ориентацию для рядов структурно аналогичных молекул, поскольку попытки ориентации соединений разных классов приводят к отклонениям от экспериментально установленного расположения в полости рецептора. Однако геометрическая форма молекулы является важной, но не единственной характеристикой, определяющей расположение молекулы в полости, поскольку в этом случае оказывает влияние весь комплекс Ван-дер-ваальсовых, кулоновских и специфических взаимодействий с рецептором
IVh
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
и сольватным окружением. В совокупности эти виды взаимодействий определяют молекулярное поле, которое обеспечивает комплементарность биологически активных соединений к рецептору. Эффективность связывания фармакофора с активными центрами рецептора определяет величину фармакологической активности. При этом с активным центром рецептора разные молекулы связываются по-своему. Поэтому генеральная совокупность активных молекул должна достоверно описывать поле рецептора. Тогда решение проблемы ориентации молекул в полости рецептора требует определения совокупного поля выборки молекул. Данная задача решается в рамках алгоритма BiS [3]. С помощью мультиконформационного анализа биологически активных соединений проведена сравнительная оценка двухосновных карбоновых кислот и их продуктов взаимодействия с фенольными соединениями экстракта прополиса с различными лекарственными веществами, представленными в базе данных. Имеющиеся данные свидетельствовали о том, что вещество с максимальной активностью имеет величину, равную 1,0. В ходе исследования происходит поочередное сравнение с веществами базы, на основании чего происходит расчет теоретической фармакологической активности. При отсутствии активности хотя бы в одном из алгоритмов, итоговую активность считали равной нулю.
На основании компьютерного моделирования структуры полифенолов и двухосновных карбоновых кислот, а также их комплексов были рассчитаны некоторые фармакологические свойства кислот янтарной и фумаровой. Предварительными исследованиями установили, что основной компонент полифенолов прополиса - рутин [4, 5]. В связи с этим теоретическую активность рассчитывали в пересчете на рутин.
Для подтверждения антимикробного действия кислот янтарной и фумаровой и их композитов с экстрактом прополиса нами был проведен эксперимент in vitro в отношении штаммов микроорганизмов Staphylococcus аигеиБ штамм 209, Escherichia coli штамм М-17, Pseudomonas aeruginosa штамм 4/1 и Candida аНэкат штамм 18/1. В день эксперимента готовили ряды разведений кислоты янтарной и фумаровой в концентрациях
0,05 г/мл, 0,005 г/мл и 0,0005 г/мл, 10% экстракта прополиса в разведениях 1:10, 1:100 и 1:1000. Кроме того, нами были приготовлены модельные смеси, содержащие по 0,5 г исследуемых кислот и 1 мл экстракта прополиса, из которых также делали разведения в концентрациях 0,05-0,0005 г/мл.
Для опыта в стерильные пробирки отмеряли по 0,9 мл каждого разведения и в каждую вносили по 0,1 мл предварительно подготовленной взвеси суточной культуры одного из микроорганизмов в физиологическом растворе в концентрации 108 КОЕ/мл. Для контроля роста микроорганизмов в стерильные пробирки без определяемых веществ вносили по 0,9 мл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида и по 0,1 мл тест-культуры. Пробирки инкубировали 24 часа при температуре 37°С, после чего визуально учитывали антимикробную эффективность по изменению прозрачности пробы и определяли минимальную ингибирующую концентрацию вещества. Исследования проводили в трех повторах.
Результаты и их обсуждение
В результате проведения теоретического прогнозирования определили широкий спектр фармакологических свойств исследуемых веществ. Установлено, что янтарная и фумаровая кислоты обладают антибактериальной, противовоспалительной и антиоксидантной активностью. Результаты исследования представлены в таблице 1.
ТАБЛИЦА 1.
Теоретическое прогнозирование фармакологической активности
Антибактериальная активность, %
Исследуемое вещество S. aureus E. coli Противо- туберкулезная активность
Рутин 87,8 96 32
Кислота янтарная 34,1 68,4 35,1
Комплекс рутина с кислотой янтарной 24,2 19,9 87,5
Кислота фумаровая 34,3 34,7 24,7
Комплекс рутина с кислотой фумаровой 20,5 20,5 63,2
Для подтверждения теоретического расчета антибактериальной активности тестируемых веществ было проведено исследование в отношении представителей грампози-тивной и грамнегативной микрофлоры в присутствии исследуемых агентов и их композитов. Полученные результаты представлены в таблице 2.
ТАБЛИЦА 2.
Антимикробное действие двухосновных карбоновых кислот в сочетании с экстрактом прополиса
Определяемые вещества Концентрация, г/мл Микроорганизмы
E. coli s u Ф ur a S. ГС s o n ‘Б 3 er a ОІ C. 3lbicans
Кислота янтарная 0,05 - - - -
0,005 + + + +
0,0005 + + + +
Кислота фумаровая 0,05 - + + -
0,005 + + + +
0,0005 + + + +
Экстракт прополиса 0,01 - - - -
0,001 - - + -
0,0001 + - + -
Смесь кислоты янтарной и экстракта прополиса 0,05 - - - -
0,005 + + - -
0,0005 + + + +
Смесь кислоты фумаровой и экстракта прополиса 0,05 - - - -
0,005 + - + +
0,0005 + + + +
Контроль культуры микроорганизмов + + + +
Примечания: «-» - отсутствие микроорганизмов, «+» - наличие микроорганизмов.
Согласно данным, полученным в ходе теоретического моделирования, комплексы кислот с рутином оказывают
менее выраженное антибактериальное действие, по сравнению с фармацевтическими субстанциями кислот фума-ровой и янтарной. Однако экспериментально доказано усиление антимикробного эффекта смеси, поскольку экстракт прополиса содержит целый комплекс фенольных соединений, обладающих бактерицидным и бактериоста-тическим эффектом.
Было установлено, что кислота янтарная в концентрации 0,05 г/мл оказывает неселективное антимикробное действие в отношении грамположительных, грамотрицатель-ных бактерий и дрожжеподобных грибов, что согласуется с предварительно проведенным прогнозом. Скорее всего, это связано с тем, что в недиссоциированном виде органические кислоты являются липофильными и могут легко проникать через мембрану бактериальной клетки в цитоплазму [6]. Оказавшись внутри клетки, где pH имеет приблизительно нейтральное значение, эти кислоты диссоциируют, высвобождая протоны. Это приводит к распространению движущей силы протона, подавляющей ферментную систему, перенос биогенных веществ, аминокислот, энергетический обмен и синтез ДНК. Бактерицидное действие органических кислот может также возникнуть в результате скопления анионов внутри клетки. Снижение pH внутри клетки приводит к тому, что микробная клетка использует свою энергию для выведения протонов наружу, что приводит к истощению клетки [7].
Нами определено, что фумаровая кислота проявляет свою антимикробную активность только в отношении E. coli и C. аНэга^. Скорее всего это связано с тем, что величина показателя константы ионизации кислоты фумаровой значительно ниже, чем у янтарной, поскольку она является непредельной кислотой в транс-форме [8]. При этом фумаровая кислота проявляет большую способность к диссоциации, что приводит к уменьшению ее липофильности и снижению способности проникновения через клеточную оболочку.
При оценке антибактериальных свойств прополиса было установлено, что он обладает губительным воздействием на грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы и дрожжеподобные грибы в минимальных разведениях. Было отмечено, что P. aeruginosa менее чувствительна к прополису. Можно предположить, что участвующими в этом эффекте веществами являются коричная кислота, некоторые ароматические молекулы и многие фла-воноиды, что было доказано теоретическими расчетами. Механизм, который приводит к гибели бактерий, все еще остается малоизученным, но японские исследователи показали [9], что прополис способен ингибировать размножение микробов, препятствуя делению клеток и вызывая деструкцию клеточной стенки бактерий (хорошо известный эффект ароматических веществ). Полученные нами экспериментальные данные показали потенцирование антибактериального эффекта двухосновных карбоновых кислот и прополиса при совместном действии, поскольку происходит активация фармакофорных группировок каждого из компонентов.
Заключение
1. Теоретически рассчитаны некоторые виды фармакологической активности янтарной и фумаровой кислот в сочетании с экстрактом прополиса.
2. В опытах in vivo доказано усиление бактерицидного и фунгицидного действия кислот янтарной и фумаровой в сочетании с прополисом, что открывает возможность использования этих веществ для разработки новых фармакологических средств и лекарственных форм.
ЛИТЕРАТУРА
1. Коваленко А.Л., Белякова Н.А., Романцов М.Г., Алексеева Л.С. Фармакологическая активность янтарной кислоты и ее лекарственные формы. Врач. 2000. № 4. С. 26-27.
Kovalenko A.L., Beljakova N.A., Romancov M.G., Alekseeva L.S. Farmakologicheskaja aktivnosf jantarnoj kisloty i ee lekarstvennye formy. Vrach. 2000. № 4. S. 26-27.
2. Хельмут Хорн, Гехард Лейбольд. Лекарства из улья: мёд, пыльца, маточное молочко, пчелиный воск, прополис, пчелиный яд. М.: АСТ «АСТРЕЛЬ», 2006. 238 с.
Hel'mut Horn, Gehard Lejbol'd Lekarstva iz ul'ja: mjod, pyl'ca, matochnoe molochko, pchelinyj vosk, propolis, pchelinyj jad. M.: AST «ASTREL'», 2006. 238 s.
3. Гришина М.А., Барташевич Е.В., Потемкин В.А., Белик А.В. Генетический алгоритм для прогноза строения и свойств молекулярных агломератов в органических веществах. Журн. структ. химии. 2002. Т. 43. № 6. С. 1128-1133.
Grishina M.A., Bartashevich E.V., Potemkin V.A., Belik A.V. Geneticheskij algoritm dlja prognoza stroenija i svojstv molekuljarnyh aglomeratov v organicheskih veshhestvah. Zhurn. strukt. himii. 2002. T. 43. № 6. S. 1128-1133.
4. Потемкин В.А., Гришина М.А., Барташевич Е.В. Комбинированная вычислительная 3D - QSAR технология BiS // Информационно - вычислительные технологии в решении фундаментальных и прикладных задач (Сессия ИВТН - 2004): Сборник материалов. М. 2004. С. 24.
Potemkin V.A., Grishina M.A., Bartashevich E.V. Kombinirovannaja vychislitel'naja 3D - QSAR tehnologija BiS// Informacionno - vychislitel'nye tehnologii v reshenii fundamental'nyh i prikladnyh zadach (Sessija IVTN -2004): Sbornik materialov. M. 2004. S. 24.
5. BiS/MC (multi - conformational), зарегистрировано в Реестре программ для ЭВМ 18 февраля 2008 г., заявка № 2007613594 от 7 сентября 2007 г.
BiS/MC (multi - conformational), zaregistrirovano v Reestre programm dlja EVM 18 fevralja 2008 g., zajavka № 2007613594 ot 7 sentjabrja 2007 g.
6. Симонян Е.В., Юркова Е.А., Карагезов С.Т. и др. Определение флаво-ноидов в продуктах пчеловодства / «Научная дискуссия: вопросы медицины»: материалы I Международной заочной научно-практической конференции. М.: Международный центр науки и образования, 2012. С. 78-81.
Simonjan E.V., Jurkova E.A., Karagezov S.T. i dr. Opredelenie flavonoidov v produktah pchelovodstva / «Nauchnaja diskussija: voprosy mediciny»: materialy
I mezhdunarodnoj zaochnoj nauchno-prakticheskoj konferencii. M.: Mezhdunarodnyj centr nauki i obrazovanija. 2012. S. 78-81.
7. Симонян Е.В., Евсельева Е.А., Юмагужина А.Т. и др. Определение дубильных веществ в продуктах пчеловодства / Материалы
II Международного конгресса «Физическое и духовное здоровье: традиции и инновации». Традиционная медицина. 2012. № 5. С. 301-303.
Simonjan E.V., Evsel'eva E.A., Jumaguzhina A.T. i dr. Opredelenie dubil'nyh veshhestv v produktah pchelovodstva / Materialy II mezhdunarodnogo kongressa «Fizicheskoe i duhovnoe zdorov'e: tradicii i innovacii». Tradicionnaja medicina. 2012. № 5. S. 301-303.
8. Шульгина М.В. Разработка принципов изучения антибактериального действия веществ на доклиническом этапе создания лекарственных средств: автореферат дисс. ... докт. биол. наук. Москва: ММА им. И.М. Сеченова, 1999. 47 с.
Shul'gina M.V. Razrabotka principov izuchenija antibakterial'nogo dejstvija veshhestv na doklinicheskom jetape sozdanija lekarstvennyh sredstv. Avtoreferat diss. ... dokt. biol. nauk. Moskva: MMA im.
I.M. Sechenova, 1999. 47 s.
9. Березин Б.Д., Березин Д.Б. Курс современной органической химии: учеб. пособие для вузов. М.: Высшая школа, 2001. 768 с.
Berezin B.D., Berezin D.B. Kurs sovremennoj organicheskoj himii: ucheb. posobie dlja vuzov. M.: Vysshaja shkola, 2001. 768 s. IT4!
