CC BY
53
Агаров yLX.y Хишпюва Н.С., АФ ГОУ ВПО КГМУ, г. Майкоп
ИЗУЧЕНИЕ «АЯТШШТЕРЦИДНОЙ» АКТИВНОСТИ У ГЕМОЛИТИЧЕСКИХ E.COLI, ВЫДЕЛЕННЫХ У БОЛЬНЫХ С СОМАТИЧЕСКИМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ЖКТ
В экспериментах in vitro на 107 штаммов Escherichia coli, выделенных из разных источников (23 штамма от здоровых людей и 84 штамма от больных с заболеваниями ЖКТ), показано. что часть изолятов, преимущественно выделенных от больных, проявляют устойчивость к антибактериальному действию лейкоцитарного катионного белка «интерцида» (AM А) и вы со-ким уровнем антпизоцимиой активности. Среди групп гемолитических Е.соН, лактозонегативные штаммы достоверно чаше проявляли активность к «интерциду» и у них же набольший процент совпадения изолятов с АИА и АЛА в высоких концентрациях
Катионные белки пейтрофилов и макрофагов, локализованные в л и зо с омах клеток, являются эффекторами кислороднезависимого киллинга бактерий и относятся к факторам неспецифической антибактериальной резистентности макроорганизма (6). Летальное действие катионных белков связывают с индуцированным нарушением структуры и функции клеточной стенки (возможно цитоплазматической мембраны) макроорганизмов (4).
К этой группе факторов относятся выделенный из лейкоцитов человека кап ионный термостабильный белок с м.м. 11,0-11,5 кД, обладающий широким спектром антибактериальной активности, названный «интерцидом» (2). Многие грамотрицательные микроорганизмы, в частности энтеробактерии, способны не только противостоять летальному действию «интерцида», но и ингибировать его в среде культивирования, т.е. проявлять «антишггерцидную активность» (2, 7). Этот признак среди штаммов Escherichia сої і изолированных от больных людей, встречался, в несколько раз чаще, чем в группах бактериальных изолятов. выделенных от здоровых лиц и из внешней среды (5, 7). Цель нашей работы - изучить устойчивость гемолитических эшерихий, выделенных от больных с заболеваниями ЖКТ> к антибактериальному действию действию «интерцида».
Исследовано 107 штаммов Escherichia coii, из них 23 штамма банальных типичных эше-рихий. выделенных от здоровых людей, и 84 штамма гемолитических Escherichia coli, выделенных от больных с заболеваниями ЖКТ (желчекаменная болезнь. ЯЬЖ и Дії, СРК, СИР).
Исследуемые культуры были объединены в группы:
I группа - типичные Rcoli, выделенных от здоровых людей-.
П группа включала лактозо негативные Е.соЬ Hly+lac- 18 штаммов;
Ш группа- 28 штаммов Exoli И1у+ с выраженной ферментативной акти в н остью см б (с металлическим блеском);
IV группа- 38 цггаммов E,coIi Н1у+ со сниженной ферментативной активностью- бмб (без металлического блеска).
Все выделенные штаммы обладали типичными культуральными, морфологическими и биохимическими свойствами. Дополнительно у них определялась «антиинтерцидная активность»- АИА (1?7).
В опытах использовали з кс пере ментальный образец препарата «интерцида» (серия 2), полученный на базе Уфимского НИИВС им. И.й. Мечникова из полуфабриката жидкого человеческого лейкоцитарного интерферона методом селективной ультрафильтрации с применением мембранной технологии и представляющий собой сухой порошок желто-розового цвета, хорошо растворимый в воде. Антибактериальная составляющая интерферона выделена в виде вещества «интерцида».
Для обнаружения способности инактивировать бактерицидную основу «интерцида», готовили ряд чашек Петри с питательным агаром, содержащим препарат человеческого лейкоцитарного интерферона (ПЧДИ) в различных концентрациях - от 0 до 7 ед. (одна единица соответствует концентрации препарата 1 МБ К для индикаторной культуры Corynebacterium xerosis № 181). К 7,5 мл расплавленного 1,5% питательного агара добавляли от 0 до 0,9 мл рабочего раствора ГТЧЛИ. Рабочий раствор готовили растворением сухого
вещес тва ампулы в 2 мл 0,85% раствора хлорида натрия. На поверхность подсушенных сред «пятачкам и» засевали исследуемые суточные агаровые культуры эшерихий. После инкубации в термостате при 37°С в течении 24ч, выросшие колонии убивали парами хлороформа и заливали вторым слоем (3-4 мл) полужидкого (0.6-0,7%) агара, смешанного с 0,1 мл взвеси суточной агаровой культуры Corynebacterium xerosis. Взвесь содержит 10* клеток. Учет производили после 24 ч инкубации при 37°С. О наличии «антиинтерцидной» активности у эшерихий судили по наличию роста дифтероида на поверхности и вокруг колоний исследуемых эшерихий, свидетельствующего о нейтрализации бактерицидного компонента препарата интерферона в среде (1).
Результаты
Результаты оценки влияния «интерцида» на развитие 107 штаммов E.coli, выделенных из разных источников, свидетельствовали о значительной межгрушовой вариабельности устойчивости эшерихий к антибактериальному действию данного катионного белка.
Наиболее ярко отличия по устойчивости к «интерциду» проявились при сравнении культур E.coli, выделенных от больных, со штаммами эшерихий, изолированными из фекалий относительно здоровых людей. Так, типичные E.coli проявили устойчивость к «интерциду» в 17,4±7,8 % случаев, что в 4,5-5,4 раза меньше, чем аналогичный показатель в выборках гемолитических E.coli. Средняя величина АИА также была значительно меньше и составила ОД±0,04 ед. Среди гемолитичеких эшерихий наиболее высокая частота устойчивости к «интерциду» отмечена у лактозонегативных штаммов- 94,4±5,6%, что превышает аналогичный показатель типичных эшерихий в 5,4 раза (р<0,001). Слабо ферментирующие E.coli Н1у+ и штаммы с выраженной ферментативной актив посты о обладали АИА в 79.0±б,6 и 78,6±7,7 % случаев и и 4,5 раз превышали активность типичных эшерихий (р<0.001). Как видно, среди гемолитических эшерихий наибольшую частоту устойчивости к «интерциду» проявили лактозонегативные штаммы- в 1,2 раза достоверно чаще, чем III группа (р-0,02) и IV группа (р>0,05, недостоверно). Между с л абоферменти ру ю щ им и и с выраженной ферментативной активностью E.coli Н1у+ не отмечено достоверной разницы в частоте встречаемости признака (р>0,5).
По величине АЙА, выраженной в единицах, активность штаммов отмечалась в разбросах: типичные эшерихии- 0Г4-0,6 ед.; E.coli Hly+lac- -0,6-0,7 ед.; E.coli Н1у+ емб и бмб - 0,2-0.7 ед. таким образом, лактозо негативные гемолитические эшерихии проявили устойчивость к высоким концентрациям «интерцида», остальные группы гемолитических E.coli - к низким.
Средняя величина АИА также выше у E.coli Hiy-lac- и составляет 4»45±0,8 ед., что в 2,3-2,2 раза больше, чем у гемолитических штаммов E.coli с выраженной ферментативной активностью и слабоферментирующих - 3.,9±0,4 (р<0,01) и 2,fa0,3 (р<0,01) ед. соответственно и в 44,5 раз больше, чем у банальной у E.coli - 0,1±0,04 (р<0,001). Гемолитические E.coli с выраженной ферментативной активностью и слабо ферментирующих превышают среднюю величин)' АИА типичных эшерихий в 20,0-19,0 раз (р<0,001).
Достоверной разницы в средней величине АИА среди E.coli Н1у+ емб и бмб не отмечено (р>0,5).
Поскольку выявленные отличия среди штаммов эшерихий разных групп обусловлены биологическими свойствами конкретных изолятов E.coli, у исследованных штаммов дополнительно определяли персистентные свойства, такие как наличие и уровень AJLA (антилизоцим-ной активности)[ таб.2]. Определяли соответствие показателей АДА более 6 мкг/мл и АИА более 2 единиц у одних и тех же изолятов каждой группы. В группе типичных эшерихий соответствие АЛА и АИА обнаружено не было. Наибольшее количество соответствий обнаружено в группе E.coli Шу+ 1ас~: 10 штаммов из 17 проявили и АЛЛ и АИА - 58,8=11,9%, а 4 штамма не были активны но этим факлорам - 23,5±б,0%. Слабоферментирующис гемолитические эшери-хии в 43,3±9,0% случаев дали АЛА и АИА (13 штаммов из 30), отсутствие обоих признаков наблюдалось в 20,СН=6,0% -у 6 изолятов. E.coli Н1у+ с выраженной ферментативной активностью в 3L8±8.2% проявили соответствие (7 штаммов из 22), отсутствие активностей наблюдалось у 4 изолятов - 18,2±5,8%. Лактозе негативные эшерихии проявляли одновременно АЛА и АИА в 1,8 раз чаще, чем E.coli Illy I- с выраженной, ферментативной активностью и в 1,4 раза чаще, чем слабоферментирующис E.coli Н1у+,
Гемолитические штаммы эшерихий значительно чаще обладали персистирущими факторами, чем типичные формы (?абЛ).:Так 82Д£6,6 % штаммов проявляли АИА и 35т8±5,9% штаммов АЛА к концентрации Лизоцима4-6 мкг/мл в, что в 5,7 и 2Ь6 раз чаще, чем банальные E.coli. Среди типичных эшерихий не встречались штаммы с АЛА более 6 мкг/мл, a E.coli Н1у+ обнаруживали такую активность в 29,8±5,6%.
При изучении антилизоцимной активности у этих же изолятов в группе с АЛА к концентрации лизоцима 4,0-6,0 мкг/мл 24 штамма E.coli Н1у+ проявили активность - 35,8±5,9%, тогда как типичная кишечная палочка только к 13,3±8,7 % случаев, что в 2,7 раз больше. Из подгрупп гемолитических эшерихий наибольший процент встречаемости штаммов с данной АЛА также приходится нагруппу эшерихии с выраженной ферментативной активностью -39,1±10,2%- в 2,9 раза чаше, наименьший - на лактозонегативные - 33,3±12,1%- в 2,5 раз чаше, чем изоляты типичных эшерихий.
Со степенью АЛА более 6 мкг/мл было выявлено 20 штаммов E.coli Шу4- (29,S=fc5,6%). Среди типичных эшерихий АЛА к данной концентрации лизоцима обнаружена не была. Чаще АЛА определялась в группе лактозонегативных гемолитических эшерихий — в 53,3±12»9% случаев. С наименьшей - в группе E.coli с выраженной ферментативной активностью-17,4*7,0% (р<0,02) и в группе E.coli со сниженной ферментативной активностью - 27,6±8,3, что в 3,1 и 1,9 раз соответственно меньше, чем лактозонегативные изоляты.
При изучении наличия: обоих признак о в персистенции видно, что гемолитические формы эшерихий достоверно чаще обладали ими, чем типичные E.coli. Из групп E.coli НМ лакто-юнегативные штаммы достоверно чаще проявляют АИА , а также АЛА к высоким концентра-циим лизоцима (>6 мкг/мл).
Обсуждение
Пред ставленные экспериментальные данные об антибактериальном действии «интерцида» на E.coli позволяют согласиться с оценкой катионных белков лейкоцитов как эффекторов фагоцитарного кидлинга и факторов противоинфекционной резистентности макроорганизма (4,6). Высокая частот встречаемости штаммов, устойчивых к «интерциду», среди штаммов, выделенных от больных, очевидно, детерминированы биологическими свойствами изолятов. Подтверждением этому' служат данные о взаимосвязи персистентных свойств как «интиинтер-цидная» и ангилизоцимная. активности. Наличие у эшерихий «антиинтерцидной» активности оценивают как дополнительный механизм, обеспечивающий выживание Е.соНпри контакте с «ингерцидом». Возможно устойчивость эшерихий к антибактериальному действиго «интерцида» реализуется в виде нейтрализации катионного белка непосредственно на поверхности бактерий или в их перипяззматическом пространстве (3).
Таким образом, изоляты гемолитических E.coli, выделенные от больных с соматическими заболеваниями ЖКХ, с высокой частотой обладают АИА, чем типичные эшерихии, выделенные от относительно здоровых людей. Среди групп гемолитических E.coli, лактозонега-тивные штаммы достоверно чаще проявляли активность к «интерциду» и у них же набольший процент совпадения изолятов с АИА и АЛА в высоких концентрациях- Не отмечено достоверных различий по частоте и уровню АИА среди гемолитических эшерихий с выраженной и сла-боаыраженной ферментативной активностью. Можно допустить, что наличие гемолитического и отсутствие ферментативного признаков коррелируют с «антиинтерцидной» и антпизоцим-ной активностью и сообщают эшерихиям свойства, обеспечивающие выживание бак-серий m vivo при встрече с эффекторами иммунитета хозяина и способствующие их персистенции в организме хозяина.
Литература:
1. Бухарин О. В. Перс потенция пато^нных бактерий. 1999. - с, 94-95.
2. Бухарин О.В., Усвяцев Б Л. Бактерионосительства (медик о-экологический аспект).-Екатеринбург, 1996.
3.Грииснко В.А., Шухман М.Г, // Журн. микроб.-2000.-№ 4.- с, 71-76.
4.Ждан-Пушкина СМ, Рыбакова Л.П. // Журн. микроб.-1991,-№7,- с. 5-8.
5.Ляшенко И.Э., Гриценко В.А. //Журн. микроб.-1996.-№3.-о. 110-114.
6.Маянский А.Н., Маянский Д.И. Очерки о нейтрофиле и макрофаге.- Новосибирск,
1989.
7.Соколов В.Ю., Бухарин О.В. //Персистенция бактерий/.- Куйбышев. 1990.- с. 83-93.
