CC BY
51
УДК 579.63: 579.66
DOI 10.21685/2307-9150-2018-2-4
Т. Д. Сультимова, Л. Г. Стоянова
ИЗУЧЕНИЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ СВОЙС ТВ КОНСОРЦИУМА МИКРООРГАНИЗМОВ
Аннотация.
Актуальность и цели. Изучены свойства консорциума микроорганизмов, в том числе антибиотические свойства по отношению к ряду бактерий.
Материалы и методы. В работе использованы ранее выделенный штамм К205 Lactococcus lactis ssp. lactis и новая выделенная культура из свежего молока. Использованы классические микробиологические методы выделения и изучения морфологических, физиолого-биохимических и антибиотических свойств микроорганизмов. Каждый эксперимент был проведен в трех повтор-ностях, результаты экспериментов были статистически обработаны.
Результаты. Проведены скрининг, выделение и идентификация культуры Lactococcus lactis 276, изучены морфологические, физиолого-биохимические и антибиотические свойства. Выявлено, что выделенная культура обладает антибиотической активностью по отношению к Bacillus coagulans - 2800 МЕ/мл, Escherichia coli - 3000 МЕ/мл. Исследованы физиолого-биохимические свойства соотношений молочнокислых бактерий (1:1, 1:2, 2:1). По всем изученным свойствам соотношение культур 276 и К-205 1:1 показало наилучшие результаты. Данный вариант соотношений показал активное антибиотическое действие по отношению к грамположительным и грамотрицательным бактериям: Bacillus coagulans - 3500 МЕ/мл, Escherichia coli - 3200 МЕ/мл.
Выводы. В результате работы выделена активная культура Lactococcus lactis 276. Изучены морфологические, физиолого-биохимические свойства и исследованы антибактериальные свойства соотношений культур с известным штаммом Lactococcus lactis subsp. lactis К-205.
Ключевые слова: бактериоцин, антибактериальное действие, молочнокислые бактерии, Lactococcus lactis, биотехнология, консорциум.
T. D. Sul'timova, L. G. Stoyanova
STUDYING THE ANTIBACTERIAL PROPERTIES OF THE MICROORGANISM CONSORTIUM
Abstract.
Background. The properties of consortia of microorganisms including antibiotic properties on a number of bacteria are studied.
Materials and methods. The previously isolated strain K205 of Lactococcus lactis ssp. lactis was used in the work and a new isolated culture from fresh milk from the Republic of Buryatia. Classical microbiological methods of isolating and studying morphological, physiological-biochemical and antibiotic properties of microorganisms were used. Each experiment was performed in triplicate and statistically processed.
© 2018 Сультимова Т. Д., Стоянова Л. Г. Данная статья доступна по условиям всемирной лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/), которая дает разрешение на неограниченное использование, копирование на любые носители при условии указания авторства, источника и ссылки на лицензию Creative Commons, а также изменений, если таковые имеют место .
Results. Screening, isolation and identification of the culture of Lactococcus lac-tis 276 were carried out, morphological, physiological-biochemical and antibiotic properties were studied. It was revealed that the isolated culture has antibiotic activity in relation to Bacillus coagulans - 2800 ME/ml, Escherichia coli - 3000 ME/ml. The physiological-biochemical properties of the ratios of lactic acid bacteria (1:1, 1:2, 2:1) are investigated. For all the properties studied, the ratio of cultures 276 and K-205 1: 1 showed the best results. This variant of the ratio showed an active antibiotic action against Gram-positive and Gram-negative bacteria: Bacillus coagulans -3500 IU/ml, Escherichia coli - 3200 IU/ml.
Conclusions. As a result of the work, active culture of Lactococcus lactis 276 was isolated. Morphological, physiological and biochemical properties were studied and the antibacterial properties of the culture relationships with the known strain Lactococcus lactis subsp. lactis K-205.
Key words: bacteriocin, antibacterial action, lactic acid bacteria, Lactococcus lactis, biotechnology, consortium of microorganisms.
Микроорганизмы существуют в природе как в виде популяций организмов одного типа, образуя микроколонии, растущие в локализованном сайте, так и в виде сообществ, где различные популяции взаимодействуют между собой, в том числе подавляя рост и развитие соседних культур.
Антагонистическое действие штаммов может иметь несколько причин: образование антибиотиков, продуктов обмена, оказывающих ингибирующее действие; разная скорость адаптации штаммов к конкретной питательной среде; темп размножения (продолжительность генерации) и др.
Многие бактерии, в том числе молочнокислые, синтезируют антибиотические вещества белковой природы - бактериоцины, действующие губительно на родственные виды и штаммы микроорганизмов и тормозящие их рост или имеющие более широкий спектр антибактериального действия, таким образом проявляя свои антагонистические свойства для получения конкурентного преимущества в естественных условиях существования.
Резистентность бактерий к действию бактериоцинов определяется наличием специальных структур - рецепторов на поверхности клетки. По-видимому, этим определяется избирательная активность бактериоцинов в отношении бактерий того же или близко родственных видов.
В данной статье рассмотрено совместное культивирование близкородственных молочнокислых бактерий, выделенных из разных природных источников, в различных соотношениях, и изучение их свойств, в том числе изменение антибактериальной активности культур в процессе роста.
Материалы и методы исследования
Материал исследования: штамм К205 Lactococcus lactis ssp. lactis, выделенный ранее из национального кисломолочного напитка «Курунга» и обладающий широким спектром антибактериальной активности на грамполо-жительные и грамотрицательные группы бактерий, а также на плесневые грибы и дрожжи. Lactococcus lactis 276, выделенный из свежего коровьего молока. Были использованы следующие микробиологические среды: мясо-пептонный агар (МПА), молочный обрат, MRS, оптимизированная биосинтетическая среда следующего состава (%): КН2РО4 - 0,5, MgSO4 - 0,02, NaCl - 0,2, глюкоза - 2,6, дрожжевой экстракт - 35-40 мг % азота аммония.
Методы исследования
В работе использованы классические микробиологические методы для выделения чистых культур микроорганизмов из природных источников и изучения морфологических и физиолого-биохимических свойств. Культивирование микроорганизмов проводили при температуре 28 °С в термостате в течение 24 ч.
Морфологию выделенных микроорганизмов изучали по характеру роста на твердой питательной среде МПА и в результате микроскопирования. Микроскопирование проводили на микроскопе Альтами БИО 8 при увеличении в 2000 раз.
Устойчивость штамма к NaCl отмечали визуально (после встряхивания пробирки) по наличию или отсутствию мутности и определяли оптическую плотность на фотоэлектроколориметре (ФЭК). Предварительно культуру выращивали на жидкой биосинтетической среде с 4 и 6,5 % NaCl при температуре 30 °С в течение 24 ч.
Определение роста культуры при рН 9,6 отмечали визуально (после встряхивания пробирки) по наличию или отсутствию мутности и определяли оптическую плотность на ФЭКе. Предварительно культуру выращивали на жидкой биосинтетической среде со значением рН 9,6 при температуре 30 °С в течение 24 ч.
Определение роста культуры при различной температуре (10, 40, 45 °С) отмечали визуально (после встряхивания пробирки) по наличию или отсутствию мутности и определяли оптическую плотность на ФЭКе. Культуру выращивали на жидкой биосинтетической среде при разных значениях температур: 10, 40, 45 °С в течение 24 ч.
Ферментативную активность в отношении потребления ряда углеводов проводили по методу «пестрого ряда». Антибиотическую активность определяли методом диффузии в агар с измерением зоны подавления роста тест-культур Bacillus coagulans и Escherichia coli в мм. В качестве эталона для перевода в МЕ использовали соответствующие разведения антибиотического препарата Низаплин (Aplin &Barrett Ltd, Великобритания). Определение белка проводили по методу А. Дуденкова.
Количество молочной кислоты (кислотность) определяли методом титрования и по разности между объемами 0,1 н раствора №ОН, пошедшего на титрование среды культивирования до и после роста бактерий.
Каждый эксперимент был проведен в трех повторностях. Результаты экспериментов были статистически обработаны.
Результаты исследований
Выделение культуры Lactococcus lactis проводили из свежего коровьего молока методом рассева на чашки со средами МПА и MRS. В результате было отобрано пять колоний молочнокислых микроорганизмов, по морфологическим признакам соответствующих молочнокислым лактококкам. Чистоту выделенной культуры проверяли микроскопическим контролем и высевом на среду МПА и биосинтетическую среду. Идентификацию молочнокислых микроорганизмов осуществляли на основании морфологических, культу-ральных, физиолого-биохимических признаков в соответствии с определителем бактерий Берги.
Изученные морфологические свойства, способность роста при различных температурах и значениях рН выделенных пяти штаммов сравнивали со свойствами бактерий Ь. \actis 8иЬ8р. \actis, описанных в определителе бактерий Берги (табл. 1).
Таблица 1
Дифференцирующие признаки штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis
Признаки L. lactis subsp. lactis 1 2 3 4 5
Преимущественное расположение клеток наиболее типичное указано первым короткие цепочки короткие цепочки короткие цепочки короткие цепочки короткие цепочки короткие цепочки
Рост при 10 °С + + + + + +
Рост при 40 °С + + + + + +
Рост при 45 °С - - - - - -
рН 9,6 - - - - - -
Рост в присутствии 4 % №С1 + + + + + +
Рост в присутствии 6,5 % №С1 - - - - - -
Примечание. Знак «+» - 90 % или более штаммов положительные, «-» - 90 % или более отрицательные.
Показано, что оптимальной температурой роста культуры Ь. lactis является 30 °С. Выявлено, что бактерии также растут при 39-40 °С и при наличии в среде 4 % №С1; не развиваются в среде, в которой содержится 6,5 % №С1 и при высокой кислотности среды (рН 9,5).
Кроме того, был использован метод определения сбраживания углеводов исследуемыми штаммами с использованием готовых растворов углеводов (1 %) и индикатора бромкрезолового пурпурного в жидкой биосинтетической среде (табл. 2).
Таблица 2
Способность к потреблению углеводов выделенных штаммов
Способность к потреблению углеводов L. lactis subsp. lactis 1 2 3 4 5
Сахароза + + + + + +
Лактоза + + + + + +
Маннит + + + + + +
Глюкоза + + + + + +
Мальтоза + + + + + +
Сорбит - - - - - -
Примечание. Знак «+» - обозначает способность к потреблению углеводного субстрата, «-» - отсутствие способности к потреблению.
Культивировали в течение 24 ч при 30 °С, после чего по изменению окраски среды и измерению оптической плотности отмечали результат.
Из табл. 2 видно, что образцы 1-5 сбраживают сахарозу, лактозу, манит, глюкозу, мальтозу и не сбраживают сорбит, что характерно для L. lactis subsp. lactis согласно Определителю бактерий Берги.
Далее методом диффузии в агар определяли антибиотическую активность выделенных вариантов по отношению к ряду микроорганизмов: Escherichia coli, Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, и в результате отобран вариант Lactococcus lactis № 1, обладающий наибольшей антибиотической активностью по отношению ко всем трем тест-организмам (табл. 3).
Таблица 3
Определение антибиотической активности
Культура микроорганизмов Средний диаметр зон подавления, мм
1 2 3 4 5
Escherichia coli 15 ± 0,5 13 ± 0,5 12,5 ± 0,5 11 ± 0,5 10 ± 0,5
Bacillus coagulans 13 ± 0,5 13 ± 0,5 13 ± 0,5 12 ± 0,5 11 ± 0,5
Bacillus subtilis 14 ± 0,5 12,5 ± 0,5 12,5 ± 0,5 12 ± 0,5 12 ± 0,5
В дальнейших исследованиях использован вариант № 1 - ЬасЮсоссш lactis 276.
Изучена динамика роста культуры 276, представленная на рис. 1.
700
"о 600
4 5 500
W
<">
Ы 4UU
X
о
400
о ч >00
о
S
сг
1UU
0
О 5 10 35 20 25 ЗО
Время, ч
Рис. 1. Динамика роста Ьа^ососсш 1ас^ биЬбр 1ас^ 276
Показано, что максимальное накопление биомассы происходит за 6 ч культивирования, что является характерным признаком для молочнокислых лактококков.
На рис. 2 показана динамика накопления белка. Максимальное накопление белка происходит на 6 ч культивирования.
За счет образования молочной кислоты максимальный уровень кислотности достигает 74 °Т за 25 ч культивирования, показатель рН уменьшается с 6,8 до 3,5.
а
л
и
ч о О
10 1ь JO
Время, ч а)
25
30
so
70
60
H
о ьи
J
H
о 40
я
и
о
ч ¿О
S
и
JO
ю
о
10 15 20
Время, ч б)
10
15
20
25
30
Время, ч «)
Рис. 2. Динамика изменения уровня: а - белка, %; б - кислотности, °Т; в - рН Lactococcus lactis 276
Результаты определения бактериоцинсинтезирующей активности Lac-tococcus lactis 276 в процессе культивирования с измерением зоны подавления роста тест-культуры Bacillus coagulans и Escherichia coli в мм представлены в табл. 4.
Таблица 4
Антибиотическая активность штамма Lactococcus lactis 276
Время, ч Диаметр подавления зон, мм
Escherichia coli Bacillus coagulans
0 13 ± 0,5 12 ± 0,5
1 15 ± 0,5 12 ± 0,5
2 15 ± 0,5 13 ± 0,5
3 15 ± 0,5 12 ± 0,5
4 15 ± 0,5 13 ± 0,5
5 15 ± 0,5 13 ± 0,5
6 16 ± 0,5 12 ± 0,5
24 13 ± 0,5 12 ± 0,5
Культура проявляла антибиотические свойства с момента начала культивирования, однако после 6 ч замечена наибольшая зона подавления роста тест-культуры Escherichia coli, диаметр которой составил 16 мм.
Далее проведены исследования свойств соотношений молочнокислых бактерий Lactococcus lactis К-205 и 276 при совместном культивировании.
Изучен спектр антибиотического действия ранее выделенного штамма Lactococcus lactis subsp lactis К-205 и выделенного из свежего коровьего молока Lactococcus lactis 276 в соотношениях 2:1, 1:2, 1:1 (табл. 5).
Таблица 5
Антибиотическая активность Lactococcus lactis subsp lactis К-205 и 276 в соотношении 2:1, 1:2, 1:1
Время, ч Диаметр подавления зон, мм
2:1 1:2 1:1
Escherichia coli Bacillus coagulans Escherichia coli Bacillus coagulans Escherichia coli Bacillus coagulans
0 13 ± 0,5 13 ± 0,5 13 ± 0,5 14 ± 0,5 11 ± 0,5 10 ± 0,5
1 12 ± 0,5 12 ± 0,5 12 ± 0,5 13 ± 0,5 12 ± 0,5 12 ± 0,5
2 12,5 ± 0,5 13 ± 0,5 13 ± 0,5 12 ± 0,5 12 ± 0,5 12 ± 0,5
3 12 ± 0,5 12 ± 0,5 13 ± 0,5 13 ± 0,5 13 ± 0,5 12 ± 0,5
4 13 ± 0,5 12 ± 0,5 14 ± 0,5 14 ± 0,5 14 ± 0,5 12 ± 0,5
5 13 ± 0,5 13 ± 0,5 14 ± 0,5 14 ± 0,5 15 ± 0,5 13 ± 0,5
6 12 ± 0,5 12 ± 0,5 14 ± 0,5 12 ± 0,5 15 ± 0,5 13 ± 0,5
24 12 ± 0,5 12 ± 0,5 14 ± 0,5 12 ± 0,5 11 ± 0,5 11 ± 0,5
Установлено, что выделенные активные бактериоцинобразующие штаммы подавляли рост Escherichia coli, B. coagulans. Штаммы 276 и К-205 в соотношениях 2:1, 1:2 проявляли антибиотическую активность по отношению к Escherichia coli, B. coagulans, но незначительно. Культуры в соотношении 1:1 обладали антибактериальным действием: эффективно подавляли рост тест-культур и к 6 ч культивирования зона подавления роста Escherichia coli составляла 15 мм, а Bacillus coagulans - 13 мм, что выше, чем результаты в других соотношениях.
Предполагаем, что в соотношении 1:1 имеет место быть выраженное антагонистическое действие культур в борьбе за субстрат и, соответственно, антибиотическое действие наиболее выражено (рис. 3). Тогда как в соотношениях 2:1, 1:2 происходит подавление культуры, находящейся в меньшем количестве.
Изучена динамика роста соотношений штаммов 276 и К-205 (1:1, 1:2, 2:1).
600
500
о 400
^
ч
S JUO
W
О
й 2UU
100
0
о г 10 15 20 25 зо
Время, ч
Рис. 3. Динамика роста соотношения культур 1:1
В результате выявлено, что при соотношении 1:1 наблюдается наибольший рост культур (500 -105 КОЕ/мл) на 6 ч культивирования.
Проводили измерение накопления белка, динамику изменения кислотности (рис. 4).
о -,-т-,-,-,-,
О 5 10 15 20 25 ЗО
Время, ч а)
Рис. 4. Динамика накопления белка (а) и изменение уровня кислотности (б) соотношения культур 1:1 (начало)
20 ■ 10 ■ 0
О S 10 15 20 25 30
Время, ч б)
Рис. 4. Динамика накопления белка (а) и изменение уровня кислотности (б) соотношения культур 1:1 (окончание)
Изменение динамики накопления белка происходило равномерно во всех соотношениях. На рис. 4,а представлена динамика соотношения 1:1, из которой видно, что максимальное накопление белка (3,6 %) происходит на 6 ч культивирования. Максимальный уровень кислотности достигается на 24 ч культивирования и составляет 90 °Т.
Заключение
В результате проделанной работы проведены скрининг, выделение и идентификация штамма Lactococcus lactis 276, изучены морфологические и физиолого-биохимические свойства выделенной культуры, изучена антибиотическая активность штамма 276. Выявлено, что выделенный штамм обладал антибиотической активностью по отношению к Bacillus coagulans - 2800 МЕ/мл, Escherichia coli - 3000 МЕ/мл. Исследованы физиолого-биохимические свойства соотношений молочнокислых бактерий (1:1, 1:2, 2:1). По характеру роста, накоплению белка, кислотности соотношение штаммов 276 и К205 молока и из лечебно-профилактического продукта курунга, в соотношении 1:1, показало наилучшие результаты. Изучено антибактериальное действие соотношений. Наиболее активным по отношению к грамположительным и грамотри-цательным бактериям являлось соотношение культур 1:1: Bacillus coagulans -3500 МЕ/мл, Escherichia coli - 3200 МЕ/мл, что является весьма перспективным для дальнейшего использования консорциума в биотехнологических целях.
Библиографический список
1. Стоянова, Л. Г. Создание банка лиофильных бактериоцинпродуцирующих молочнокислых бактерий / Л. Г. Стоянова, Т. Д. Сультимова, А. И. Нетрусов // Цитология. - 2004. - Т. 46, № 10. - С. 865-867.
2. Стоянова, Л. Г. Микробиологическая характеристика нового штамма Lactococcus lactis ssp. lactis K-205 / Л. Г. Стоянова, Т. Д. Сультимова, А. Р. Строева, А. И. Нетрусов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -2008. - № 1. - С. 60-63.
3. Квасников, Е. И. Молочнокислые бактерии и их использование / Е. И. Квасников, О. А. Нестеренко. - М. : Наука, 2003. - 348 с.
4. Стоянова, Л. Г. Молочнокислые бактерии / Л. Г. Стоянова // Практикум по микробиологии / под ред. А. И. Нетрусова. - М. : Академия, 2005. - С. 467-486.
References
1. Stoyanova L. G., Sul'timova T. D., Netrusov A. I. Tsitologiya [Cytology]. 2004, vol. 46, no. 10, pp. 865-867.
2. Stoyanova L. G., Sul'timova T. D., Stroeva A. R., Netrusov A. I. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii [Journal of microbiology, epidemiology and immuno-biology]. 2008, no. 1, pp. 60-63.
3. Kvasnikov E. I., Nesterenko O. A. Molochnokislye bakterii i ikh ispol'zovanie [Lactic acid bacteria and their use]. Moscow: Nauka, 2003, 348 p.
4. Stoyanova L. G. Praktikum po mikrobiologii [Practical work on microbiology]. Moscow: Akademiya, 2005, pp. 467-486.
Сультимова Татьяна Доржиевна
кандидат биологических наук, доцент, кафедра биотехнологии, ВосточноСибирский государственный университет технологий и управления (Россия, г. Улан-Удэ, ул. Ключевская, 40в)
E-mail: tsultimova@mail.ru
Стоянова Лидия Григорьевна
доктор биологических наук, профессор, кафедра микробиологии, Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова (Россия, г. Москва, Ленинские горы, 1)
E-mail: stoyanovamsu@mail.ru
Sul'timova Tat'yana Dorzhievna Candidate of biological sciences, associate professor, sub-department of biotechnology, East Siberia State University of Technology and Management (40v Klyuchevskaya street, Ulan-Ude, Russia)
Stoyanova Lidiya Grigor'evna Doctor of biological sciences, professor, sub-department of microbiology, Lomonosov Moscow State University (1 Leninskie Gory, Moscow, Russia)
УДК 579.63: 579.66 Сультимова, Т. Д.
Изучение антибактериальных свойств консорциума микроорганизмов / Т. Д. Сультимова, Л. Г. Стоянова // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Естественные науки. - 2018. - № 2 (22). - С. 42-51. -БОТ 10.21685/2307-9150-2018-2-4.
