CC BY
44
ISSN 2307-9266 e-ISSN 2413-2241
ФАРМАЦИЯ И ФАРМАКОЛОГИЯ
УДК: 615.225
и
ИЗУЧЕНИЕ АНТИАТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКОЙ И ЭНДОТЕЛИОПРОТЕКТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ПЕПТИДНЫХ АГОНИСТОВ ГЕТЕРОРЕЦЕПТОРА EPOR/CD131
Пученкова О.А.1, Надеждин С.В.1, Солдатов В.О.2, Жученко М.А.3, Коршунова Д.С.2, Кубекина М.В.2, Коршунов Е.Н.2, Корокина Л.В.1, Голубинская П.А.4, Куликов А.Л.1, Гуреев В.В.1, Покровский В.М.1, Патраханов Е.А.1, Лебедев П.Р.1, Денисюк Т.А.5, Беляева В.С.1, Мовчан Е.А.1, Лепетюха Е.И.1, Покровский М.В.1
1 ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», 308015, Россия, г. Белгород, ул. Победы, 85
2 ФГБУН «Институт биологии гена РАН», 119334, Россия, г. Москва, ул. Вавилова, 34/5
3 НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика, 123098, Россия, г. Москва, пл. Академика Курчатова, 1
4 Клинико-диагностическая лаборатория, Бюджетное учреждение здравоохранения Воронежской области «Воронежская областная клиническая офтальмологическая больница» (БУЗ ВО «ВОКОБ»), 394030, Россия, г. Воронеж, ул. Революции 1905 года, д. 22
5 ФГБОУ ВО «Курский государственный медицинский университет», 305041, Россия, г. Курск, ул. Карла Маркса, 3
Введение. Препараты, воздействующие на митохондриальную дисфункцию, оксидативный стресс, апоптоз и воспаление сосудистой стенки, обладают высоким потенциалом при профилактике и лечении атеросклеротических поражений. В этой связи применение агонистов гетерорецептора EPOR/CD131, которые обладают подобным спектром фармакологических эффектов, является одной из перспективных стратегий в лечении кардиоваскулярных заболеваний.
Материалы и методы. Исследование было проведено на 68 самцах мышей C57BI/6J. Атеросклероз моделировали на трансгенных животных с эндотелиоспецифичным нокдауном гена Polg путем моделирования баллонной травмы и содержания на западной диете. Затем в течение 27 дней вводили изучаемые препараты 1 раз в 3 дня в дозе 20 мкг/кг. На 28-й день животных эвтаназировали и оценивали площадь атеросклеротических бляшек. Также в тканях аорты определяли экспрессию генов, связанных с процессами воспаления, антиоксидантной защиты, апоптоза, ангиогене-за. Кроме того, было изучено эндотелиопротективное действие пептидов на первичных культурах эндотелиоцитов диких и трансгенных мышей Polg-D257A.
Результаты. Мы не обнаружили статистически значимого влияния препаратов на площадь липидной инфильтрации. Однако исследуемые пептиды значимо уменьшили экспрессию провоспалительных генов iNos, Icaml, Vcaml, Sele, Il6, Tnfa, генов, связанных с ангиогенезом Vegfa, Flt-1 и Hifla, экспрессию проапоптических факторов и более чем в 1,5 раза снизили соотношение Bax/Bcl-2. Кроме того, пептиды дозозависимо увеличили выживаемость эндотелиоцитов при добавлении H2O2 in vitro.
Заключение. Используемые пептиды на основе эритропоэтина способны улучшать функциональное состояние сосудистой стенки на фоне атеросклеротического поражения и оказывают угнетающее влияние на патобиологические процессы, связанные с митохондриальной дисфункцией. Кроме того, исследуемые пептиды оказывают значимый эндотелиопротективный эффект при индукции оксидативного стресса in vitro.
Ключевые слова: атеросклероз, производные эритропоэтина, митохондриальная дисфункция, оксидативный стресс.
Для цитирования: Пученкова О.А., Надеждин С.В., Жученко М.А., Коршунова Д.С., Кубекина М.В., Коршунов Е.Н., Корокина Л.В., Голубинская П.А., Куликов А.Л., Гуреев В.В., Покровский В.М., Патраханов Е.А., Лебедев П.Р., Денисюк Т.А., Беляева В.С., Мовчан Е.А., Лепетюха Е.И., Покровский М.В. Изучение антиатеросклеротической и эндотелиопротективной активности пептидных агонистов гетерорецептора EPOR/CD131. Фармация и фармакология. 2020;8(2):100-111. DOI: 10.19163/2307-9266-2020-8-2-100-111 © Пученкова О.А., Надеждин С.В., Жученко М.А., Коршунова Д.С., Кубекина М.В., Коршунов Е.Н., Корокина Л.В., Голубинская П.А., Куликов А.Л., Гуреев В.В., Покровский В.М., Патраханов Е.А., Лебедев П.Р., Денисюк Т.А., Беляева В.С., Мовчан Е.А., Лепетюха Е.И., Покровский М.В., 2020
For citation: Puchenkova O.A., Nadezhdin S.V., Soldatov V.O., Zhuchenko M.A., Korshunova D.S., Kubekina M.V., Korshunov E.N., Korokina L.V., Golubinskaya P.A., Kulikov A.L., Gureev V.V., Pokrovskiy V.M., Patrakhanov E.A., Lebedev P.R., Denisyuk T.A., Belyaeva V.S., Movchan E.A., Lepetukha E.I., Pokrovskiy M.V. Study of antiatherosclerotic and endothelioprotective activity of peptide agonists of EPOR/CD131 heteroreceptor. Pharmacy & Pharmacology. 2020;8(2):100-111. DOI: 10.19163/2307-9266-2020-8-2-100-111
E-mail: [email protected]
Получено 14.11.2019
Рецензия (1) 23.12.2019
Рецензия (2) 25.12.2019 Принята к печати 30.12.2019
Scientific and Practical Journal
PHARMACY & PHARMACOLOGY
RESEARCH ARTICLE
DOI: 10.19163/2307-9266-2020-8-2-100-111
STUDY OF ANTIATHEROSCLEROTIC
AND ENDOTHELIOPROTECTIVE ACTIVITY
OF PEPTIDE AGONISTS OF EPOR/CD131 HETERORECEPTOR
Puchenkova O.A.1, Nadezhdin S.V.1, Soldatov V.O.2, Zhuchenko M.A.3, Korshunova D.S.2, Kubekina M.V.2, Korshunov E.N.2, Korokina L.V.1, Golubinskaya P.A.4, Kulikov A.L.1, Gureev V.V.1, Pokrovskiy V.M.1, Patrakhanov E.A.1, Lebedev P.R.1, Denisyuk T.A.5, Belyaeva V.S.1, Movchan E.A.1, Lepetukha E.I.1, Pokrovskiy M.V.1
1 Belgorod State National Research University, 85, Pobeda Str., Belgorod, 30801
2 Federal Publicly Funded Institution of Science "Institute of Gene Biology of the Russian Academy of Sciences", 34/5, Vavilov Str., Moscow, Russia, 11933
3 Russian Research Center "Kurchatov Institute" - State Science Research Institute of Genetics, 1, Academician Kurchatov Square, Moscow, Russia, 123098
4 Clinical diagnostic laboratory, Budgetary institution of public healthcare of the Voronezh Region "Voronezh Regional Clinical Ophthalmological Hospital", 22, Revolution of 1905 Str., Voronezh, Russia, 394030
5 Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education "Kursk State Medical University", 3, Karl Marx Str., Kursk, Russia, 305041
E-mail: [email protected]
Received 14 November 2019 Review (1) 23 December 2019 Review (2) 25 December 2019 Accepted 30 December 2019
Introduction. The drugs affecting a mitochondrial dysfunction, oxidative stresses, apoptosis and inflammation of the vascular wall, have a high potential for the prevention and treatment of atherosclerotic lesions. In this regard, the use of EPOR/CD131 heteroreceptor agonists which have a similar spectrum of pharmacological effects, is one of the promising strategies in the treatment of cardiovascular diseases.
Materials and Methods. The study was carried out on 68 C57Bl/6J male mice. Atherosclerosis was simulated in transgenic animals with an endotheliospecific knockdown of the Polg gene by simulating a balloon injury and keeping on a Western diet. Then, the studied drugs were injected once every 3 days at the dose of 20 |g/kg for 27 days. On the 28-th day, the animals were euthanized and the area of atherosclerotic plaques was assessed. The gene expression associated with the processes of inflammation, antioxidant protection, apoptosis, and angiogenesis was also determined in the aortic tissues. In addition, the endothelium protective effect of peptides on primary cultures of endothelial cells of wild and transgenic Polg-D257A mice was studied.
Results. No statistically significant effect of drugs on the area of lipid infiltration have been found. However, the studied peptides have significantly reduced the expression of proinflammatory genes (iNos, Icaml, Vcaml, Sele, Il6, Tnfa), the genes associated with angiogenesis (Vegfa, Kdr, and Hif1a), the expression of proapoptic factors; they decreased the Bax/Bcl-2 ratio by more than 1.5 times. In addition, when supplemented with H2O2 in vitro, peptides dose-dependently increased endothelial cell survival.
Conclusion. The erythropoietin-based peptides can be used to improve the functional state of the vascular wall against the background of atherosclerotic lesions and have a depressing effect on pathobiological processes associated with a mitochondrial dysfunction. In addition, the studied peptides have a significant endothelial protective effect in the induction of oxidative stress in vitro.
Keywords: atherosclerosis, erythropoietin derivatives, mitochondrial dysfunction, oxidative stress.
ВВЕДЕНИЕ
Атеросклероз - хроническое заболевание стенок сосудов, характеризующееся асептическим воспалением, нарушением перфузии органов и тканей, склонностью к тромбообразованию и прогрессирующей с возрастом дисфункцией сосудистой стенки. В 1912 г. на заседании Общества русских врачей в Санкт-Петербурге крупный российский ученый Н.Н. Аничков, именем которого в настоящее время названа премия за самые выдающиеся исследования в области атеросклероза, совместно с С.С. Халато-вым представил первые результаты своих революционных исследований, касающихся выявлению
связи между алиментарными факторами, уровнем холестерина крови и атеросклерозом. Со времен этих работ, атеросклероз рассматривается, в первую очередь, как заболевание, вызванное накоплением в сосудистой стенке холестерина [1]. Эта концепция до сих пор является ключевой для снижения карди-оваскулярного риска. Тем не менее, сейчас общепризнано, что дислипидемия является единственной причиной атеросклероза только при семейных ги-перхолестеринемиях. В других случаях атеросклероз - это результат совокупного действия ряда патогенетических факторов, среди которых выделяют эндоте-лиальную дисфункции [2], гемодинамическую пере-
ISSN 2307-9266 e-ISSN 2413-2241
ФАРМАЦИЯ И ФАРМАКОЛОГИЯ
грузку [3-5], миграцию гладкомышечных клеток [6], хроническое стерильное воспаление сосудов и ряд других процессов.
Отдельное место в патобиологии атеросклероза отводится нарушению работы митохондрий [7]. Митохондрии являются главным генератором активных форм кислорода (АФК) в клетке. Например, известно, что, проходя по окислительно-восстановительному градиенту электронно-транспортной цепи, 1-3% электронов преждевременно реагируют с кислородом в комплексах I и III с образованием супероксида и других типов АФК [8]. При разных патологических состояниях, включая гипоксию и воспаление, их количество может увеличиваться. Кроме того, митохондрии выполняют в сосудистых клетках не только метаболическую, но также важную регуляторную и сигнальную роль [8].
Немаловажно также, что дисфункция митохондрий в других клетках, включая нейроны и кардио-миоциты приводит к снижению их резистентности к ишемии, что выражается в увеличении летальных исходов на фоне мозгового инсульта, окклюзии коронарных артерий, инфаркте почек и других органов. В связи с обозначенными сведениями, патогенетический каскад, объединяющий митохондриальную дисфункцию и атеросклероз, становится актуальной мишенью для фармакологического воздействия.
В качестве перспективного терапевтического подхода для воздействия на митохондриальное звено при поражении сосудистой стенки, могут быть рассмотрены агонисты гетеродимерного рецептора эритропоэтина EPOR/CD131. Первым препаратом из данной группы был 11-аминокислотный пептид pHBSP (pyroglutamate helix B surface peptide), открытый в 2008 г. научной группой под руководством Майкла Брайнса [9]. Прежде мы продемонстрировали, что данный пептид оказывает выраженное эндотелиопротективное действие при моделировании L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции у крыс [10, 11]. Однако в этом исследовании нами также был выявлен побочный эффект в виде протромботического действия. В этой связи мы попробовали модернизировать данную молекулу путем добавления трипептидных мотивов, обладающих антиагрегантным действием. В результате было получено два принципиально новых соединения, сочетающих в себе цитопротективный [12] и антиа-грегантный (собственные неопубликованные данные) эффекты. Здесь мы сообщаем о результатах изучения антиатеросклеротической активности этих соединений.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ - оценка антиатероскле-ротических и эндотелиопротективных свойств коротких пептидных производных эритропоэтина.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Животные и диета
В качестве основной тест-системы были использованы мыши C57BI/6J. Животные были переданы в дар ЦКП Института биологии гена РАН и содержа-
лись в центре доклинических исследований НИИ Фармакологии живых систем. После прохождения 14-дневного карантинного режима мыши были стратифицированы по массе и рассажены в отдельные конвенциональные клетки в соответствии с принадлежностью к экспериментальной группе. До и во время выполнения исследования животные содержались в помещениях с искусственным освещением (режим 12 ч. / 12 ч.) при температуре 21-23°С, влажности 38-50% и имели свободный доступ к корму и воде. Номер заключения независимого этического комитета 06-09/02-1 от 16.12.2019 г.
В исследование было включено 16 самцов дикого типа и 52 самца (25-30 г) с генотипом Ро^^257А/ Cdh5-CRE на фоне С57В1^. Генотип ассоциирован с эндотелиоспецифичным нокдауном гена Ро^, кодирующего фермент полимераза гамма. Нарушения в работе данного фермента приводят к развитию митохондриальной дисфункции [13, 14]. Данная линия была создана в ЦКП «Геномное редактирование» ИБГ РАН для изучения эффектов оксидативно-го стресса и митохондриальной дисфункции. Линия характеризуется наличием мутантной формы гена Ро^ под контролем CAG промотора и стоп-кассеты, фланкированной LoxP-сайтами (неопубликованные данные), принципиальное устройство конструкции описано в статье [15]. После скрещивания с мышами Cdh5-CRE происходит эндотелиоспецифичное удаление стоп-кассеты и гиперэкспрессия мутантной формы Ро^ в эндотелии.
За 2 недели до операции животных помещали на западную диету с 2% содержанием холестерина.
При работе соблюдались требования Закона РФ «О защите животных от жестокого обращения» от 24.06.1998 года, правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 3 51000.3-96 и ГОСТ Р 53434-2009), директивы Европейского сообщества (86/609 ЕС), правил Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997) и Правил лабораторной практики, принятых в Российской Федерации (приказ МЗ РФ № 708 от 29.08.2010 г.).
Хирургические процедуры
Операцию выполняли на подогревочном столике под препаративным микроскопом. Под наркозом (Золазепам ^гЬас (Россия)) 2,5 мг/100 г + Ксилазин (Биогель (Беларусь)) 2 мг/100 г внутрибрюшинно) животным после выполнения срединной лапарото-мии выделяли аорту на уровне между бифуркацией и отхождением почечных артерий.
На обнаженный сосуд накладывали две клипсы, надсекали между ними артериальную стенку и вводили начальный участок баллонного катетера (рис. 1). Затем снимали проксимальную клипсу и продвигали катетер в краниальном направлении на 10 мм.
PHARMACY & doi: 10.19163/2307-9266-2020-8-2-100-111
PHARMACOLOGY
После этого на 40 секунд нагнетали в баллон катетера воду, раздувая его до диаметра 1,5 мм при давлении 10 бар. Наконец, катетер извлекали, на разрез в аорте накладывали три шва, рану ушивали. После операции животных помещали в индивидуальные клетки с простерилизованным бумажным подстилом и наблюдали за ними до пробуждения.
Для облегчения послеоперационного болевого синдрома в течение 3 дней с момента операции животные получали Метамизол натрия (Фармстан-дарт-Лексредства (Россия)) с питьевой водой ad libitum в концентрации 50 мг вещества на 100 мл воды [16, 17].
Дизайн эксперимента и введение препаратов
Животные с генотипом Polg-D257A Cdh5-CRE были разделены 5 равных групп:
1) Интактные - животные без моделирования патологии и без введения препаратов (n=12);
2) Контроль - животные с моделированием патологии (баллонная травма + западная диета с повышенным содержанием холестерина), которым, начиная с 1-го дня, вводили воду для инъекций подкожно в объеме 0,1 мл/10 г (n=12);
3) P-aB - животные, с моделированием патологии, которым, начиная с 1-го дня, вводили пептид P-aB (ООО «Фармапарк») подкожно в дозе 20 мкг/кг 1 раз в 3 дня в течение 27 дней (суммарная доза 180 мкг/кг) (n=12);
4) P-aB1 - животные, с моделированием патологии, которым, начиная с 1-го дня, вводили пептид P-aB1 (ООО «Фармапарк») подкожно в дозе 20 мкг/кг 1 раз в 3 дня в течение 27 дней (суммарная доза 180 мкг/кг) (n=12);
5) P-aB3 - животные, с моделированием патологии, которым, начиная с 1-го дня вводили пептид P-aB3 (ООО «Фармапарк») подкожно в дозе 20 мкг/кг 1 раз в 3 дня течение 27 дней (суммарная доза 180 мкг/кг) (n=12) (табл. 1).
Измерение площади
атеросклеротической бляшки
Четверым животным из каждой группы было выполнено макроскопическое изучение атероскле-ротических бляшек аорты. Вкратце, на 28-й день после моделирования баллонной травмы животных эвтаназировали передозировкой наркоза (Золазе-пам (Virbac (Россия)) 10 мг/100 г внутрибрюшинно) и аккуратно извлекали брюшную аорту от бифуркации до участка на уровне диафрагмы.
Затем препараты продольно рассекали, расправляли на пенопластовой подложке, промывали 50% раствором этанола и погружали в раствор Oil Red O на 15 минут. После этого препараты промывали дистиллированной водой и делали цифровые фотоснимки. На полученных снимках с использованием программы imageJ рассчитывали отношение площа-
ди атеросклеротической бляшки (окрашенной красным) к интактной ткани.
Количественная ПЦР
У остальных животных после эвтаназии ткань аорты в области нанесения баллонного повреждения забирали, гомогенизировали и 10 минут инкубировали при 37°С в растворе «Extract RNA». После лизирова-ния образца в реагенте его подвергли хлороформной чистке, надосадочную пробу собирали и промывали изопропиловым спиртом и 70%-ным этиловым спиртом. Концентрацию полученной РНК измеряли на спектрофотометре IMPLENNanoPhotometer® и доводили до концентрации 300 нг/мкл.
Обратную транскрипцию проводили с использованием набора MMLVRTSK021 в соответствии с протоколом фирмы-производителя (Evrogen). Смесь аккуратно перемешивали и в течение 2 минут прогревали при 70°C для расплавления вторичных структур РНК и последующего отжига праймера OligoDT. После переносили образцы в лед. Всю реакционную смесь инкубировали 60 мин при 40°C в термоцикле-ре T100™ThermalCycler (Bio-Rad).
Для остановки реакции прогревали смесь при 70°C в течение 10 минут. Полученную кДНК разводили до концентрации 1 нг/мкл. Уровень экспрессии гена оценивали относительно значений референс-ного гена Gapdh. Расчет экспрессии в конкретной точке производился по формуле: Экспрессия гена = [(Ct(Gapdh)/Ct(Ген интереса)] (таб. 2).
In vitro изучение цитопротективной активности
У 6-ти интактных мышей (4 животных генотипом Polg-D257A/Cdh5-CRE и 4 животных дикого типа) после эвтаназии в стерильных условиях выделяли нижнюю полую вену и промывали раствором DPBS (Thermo FS) до полного удаления крови. Затем вену надсекали для обнажения внутренней поверхности и помещали в 0,2% раствор коллагеназы в DPBS с добавлением 0,9 mM CaCl2, 0,493 mM MgCl2, 5,56 mM глюкозы, 0,327 mM пирувата натрия, пенициллина и стрептомицина (Lonza), подвергая интиму ферментативной диссоциации. Для увеличения эффективности отделения эндотелиоцитов внутренний слой отскабливали стерильным пинцетом. Раствор коллагеназы, содержащий клетки, собирали в пробирку 5 мл, полученные эндотелиальные клетки культивировали в среде DMEM-F12 (Lonza) с добавлением 20 mM буфера HEPES (Lonza), 5 ЕД/мл гепарина, 200 мкг/мл ECGF (Sigma-Aldrich), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Thermoscientific,) при 37°C во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2 [18].
Жизнеспособность клеток измеряли количественным колориметрическим анализом МТТ, который обеспечивает чувствительные измерения метаболических статусов клеток, в частности мито-хондриального статуса, которые могут отражать ранние окислительно-восстановительные изменения.
ISSN 2307-9266 e-ISSN 2413-2241
ФАРМАЦИЯ И ФАРМАКОЛОГИЯ
Рисунок 1 - Схематическое изображение и размеры баллонного катетера
Рисунок 2 - Первичный монослой эндотелиальных клеток мыши (ув. х40) Таблица 1 - Аминокислотная последовательность исследуемых соединений
Лабораторный шифр
Аминокислотная последовательность
P-aB
_QEQLERALNSS
P-aB1
RGDQEQLERALNSS
P-aB3
KGDQEQLERALNSS
Таблица 2 - Праймеры, используемые для количественной ПЦР
Ген
F-праймер
R-праймер
Длина продукта (п.н.)
GenBank
Trp53 (p53)_CGACTACAGTTAGGGGGCAC CCATGGCAGTCATCCAGTCT_95_NM_001127233.1
Bcl2 TCACCCCTGGTGGACAACAT TTCCACAAAGGCATCCCAGC 102 NM 009741.5
Bax CCCGAGCTGATCAGAACCAT GAGGCCTTCCCAGCCAC 96 NM 007527.3
Pon2 CTTCCACACTGCCACCTGAT TCCTGGGAATTTTAGACCCACA 105 NM 000305.3
Sod2 GGCTGGCTTGGCTTCAATAAG AGCGGAATAAGGCCTGTTGTT 95 NM „013671.3
Vegfa (VEGF-A)_GGGCCTCCGAAACCATGAA_TGCAGCCTGGGACCACTTG_95_NM_001025250.3
Flt-1 (VEGF)_CCCATCGGCAGACCAATACA CGGTGCAGTTGAGGACAAGA_96_NM_001363135.1
Nos2 (iNOS)_GCTCTAGTGAAGCAAAGCCCA GGGATTCTGGAACATTCTGTGC_103_NM_001313921.1
Icaml_CTCCGGACTTTCGATCTTCCA CCTTCCAGGGAGCAAAACAAC_98_NM_010493.3
Vcaml TACTGTTTGCAGTCTCTCAAGC CGTAGTGCTGCAAGTGAGGG 101 NM 011693.3
Sele (E-selectin) GGGAAGAAGACTGTCCTAGCC AGGGGAGCTGGCTTCCTAAG 96 XM 006496715.3
Hifla AGAACAACTTGAGCTGGCGT TGGAGGTGAACTAGGCTCTGT 103 NM 001092957.1
Caspl (Каспаза-1) TGTATTCACGCCCTGTTGGA CCCTCAGGATCTTGTCAGCC 100 NM_009807.2
Casp3 (Каспаза-3) GCTTGGAACGGTACGCTAAG CTTGCTCCCATGTATGGTCTT_105_NM_001284409.1
II6_GACTGGGGATGTCTGTAGCTC TGGATGGAAGTCTCTTGCAG_103_NM_001314054.1
Tnfa (TNFa)_ACTGAACTTCGGGGTGATCG ACTTGGTGGTTTGTGAGTGTG_105_NM_001278601.1
Gapdh_GGGTCCCAGCTTAGGTTCATC CCCAATACGGCCAAATCCGT_100_NM_001289726.1
PHARMACY & doi: 10.19163/2307-9266-2020-8-2-100-111
PHARMACOLOGY
Вкратце, экспоненциально растущие клетки высевали в 96-луночный планшет с плотностью 4 х 104 клеток на лунку. Затем клетки обрабатывали исследуемыми пептидами (P-aB, P-aB1, P-aB3 (ООО «Фармапарк»)) в 3 концентрациях - 5, 30, 50 мкг/мл в течение 2 часов. После предварительной обработки в культу-ральную среду добавляли Н2О2 до конечной концентрации в конечной концентрации 200 мкМ в течение 24 часов. Клетки отрицательного контроля обрабатывали только H202, а клетки положительного контроля не обрабатывали ничем. После инкубации в течение 24 часов в каждую лунку добавляли 10 мкл реагента набора для анализа МТТ и клетки инкубировали в течение дополнительного часа. Поглощение каждого продукта реакции измеряли с помощью микроплан-шет-ридера на длине волны 450 нм. Результаты выражены в процентах от поглощения МТТ контрольных клеток, который был принят за 100% (рис. 2).
Статистическая обработка
Полученные данные были проверены на нормальность распределения с использованием критерия Шапиро-Уилка. Данные с нормальным распределением сравнивали между собой с применением One-way ANOVA с пост-хок анализом по HSD Тьюки. Данные с ненормальным распределением сравнивали с применением теста Крускала-Уоллеса и пост-хок анализом по методу Данна.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Макроскопическая оценка бляшки
При макроскопическом анализе было обнаружено, что к 28-му дню после моделирования баллонной травмы во всех препаратах аорты, окрашенных краской Oil Red O визуализировались липидные отложения, характерные для атеросклероза.
В то же время степень повреждения очень сильно варьировала внутри групп, что затруднило интерпретацию полученных результатов. В итоге мы не обнаружили достоверных различий между контрольной группой и группами с применением тестируемых препаратов, хотя некая тенденция к снижению площади наблюдалась в группе с применением P-aB1 (рис. 3).
Количественная ПЦР
С использованием молекулярно-биологического анализа тканей бляшки было обнаружено, что изучаемые пептиды выраженно снижают экспрессию про-апоптических факторов Bax, каспазы 1 и каспазы-3, а также незначительно увеличивают экспрессию анти-апоптического фактора Bcl-2. Как видно из тепловой карты на рисунке 2 наибольший эффект продемонстрировал препарат P-aB1 (рис. 4А).
Для интегральной оценки проапоптической направленности тканей мы рассчитали соотношение экспрессии Bax к Bcl-2. Средний расчетный пока-
затель Bax/Bcl-2 составил 0,67 в группе интактных животных, 1,81 в контрольной группе, 1,19 в группе с применением P-aB, 0,96 в группе с применением P-aB1 и 1,09 в группе с применением P-aB3 (рис. 4Б).
Наряду с антиапоптическим действием, изучаемые препараты снизили повышенную на фоне травмы экспрессию генов воспалительных маркеров iNOS и молекул межклеточной адгезии ICAM-1, VCAM-1 и E-селектина. Наиболее выраженный эффект был получен в группе с применением соединения P-aB1 (рис. 5).
Кроме того, исследуемые препараты снизили экспрессию факторов, связанных с ангиогенезом VEGF-A, VEGFR, а также HIF-1a (рис. 6).
Наконец, нами было обнаружено, что на фоне моделирования атеросклероза у мышей Polg-D257A/ Cdh5-CRE происходит увеличение экспрессии генов антиоксидантных ферментов PON2, SOD2. При этом по сравнению с контролем на фоне применения тестируемых пептидов экспрессия генов антиоксидантной системы была снижена. Также, как и при оценке влияния пептидов на провоспалительные и проангиогенные гены, наиболее выраженный эффект был получен в группе с применением соединения P-aB1 (рис. 7).
Изучение цитопротекторной активности in vitro
При проведении МТТ-теста на первичных культурах эндотелиоцитов было обнаружено, что даже без добавления Н2О2 эндотелиоциты, экспрессиру-ющие Polg-D257A, характеризуются более низкой интенсивностью сигнала по сравнению с диким типом. При инкубации с H2O2 большая часть эндотелиоци-тов Polg-D257A теряла интенсивность сигнала почти в пять раз с 80,60 (95% CI 77,29-84,94) до 15,79 (95% CI 11,97-25,42) (рис. 8).
Исследуемые препараты дозозависимо увеличивали выживаемость клеток в условиях оксидативно-го стресса, вызванного добавлением H2O2. При этом как видно из рисунка модифицированные пептиды (P-aB1 и P-aB3) оказывали более выраженный эффект по сравнению с базовым соединением (PaB) при добавлении в эквивалентных дозах.
ОБСУЖДЕНИЕ
Пептидные агонисты гетерорецептора EPOR/ CD131 являются активаторами связанных с эритро-поэтином каскадов цитопротекции. Соединения P-aB1 и P-aB3 наряду с первичными антиапоптиче-скими свойствами обладают также антиагрегантной активностью, которая достигается за счет внесения трипептидных мотивов KGD и RGD. В данном исследовании в качестве экспериментальной модели для изучения антиатеросклеротической активности P-aB1 и P-aB3 мы использовали трансгенных мышей с митохондриальной дисфункцией на фоне ткане-специфичного нокдауна гена Polg, кодирующего по-лимеразу гамма.
ISSN 2307-9266 e-ISSN 2413-2241
ФАРМАЦИЯ И ФАРМАКОЛОГИЯ
Рисунок 3 - Площадь липидных отложений
Примечание: + - среднее арифметическое.
А
Рисунок 4 - Влияние исследуемых препаратов на относительную экспрессию маркеров апоптоза
Примечание: А) Из рисунка видно, что на фоне моделирования баллонного повреждения выраженно возрастает экспрессия маркеров программируемой клеточной гибели р53 и Вах и падает экспрессия антиапоптического маркера Вс1-2. Исследуемые препараты практически во всех случаях возвращают экспрессию р53, Вах и Вс1 к уровню значений в интакт-ной группе; В) Рисунок Б отражает соотношение Вах/Вс1-2. Соотношение характеризует проапоптическую направленность клетки, чем оно выше, тем более выражена активация каскадов программируемой клеточной гибели. Из рисунка видно, что пептид Р-аВ1 статистически значимо снижает соотношение Вах/Вс1-2.
+ - среднее арифметическое; статистическую значимость межгрупповых отличий выявляли с применением теста Кра-скела-Уоллиса и пост-хок анализа по методу Данна.
Б
Scientific and Practical Journal
PHARMACY & PHARMACOLOGY
RESEARCH ARTICLE
DOI: 10.19163/2307-9266-2020-8-2-100-111
Рисунок 5 - Уровень экспрессии генов iNOS, ICAM-1, VCAM-1 и E-селектина
Рисунок 6 - Уровень экспрессии VEGF-A, VEGFR, и HIF-1a
Рисунок 7 - Уровень экспрессии генов PON2, SOD2
Рисунок 8 - Влияние H2O2 и тестируемых пептидов на выживаемость эндотелиоцитов
с генотипом Polg-D257A
Примечание: + - относительно интактных эндотелиоцитов дикого типа; * - p < 0,0001 при сравнении с группой, получавшей только Н2О2; # - p=0,0783 при сравнении с группой с добавлением P-aB 30 мкг/мл
ISSN 2307-9266 e-ISSN 2413-2241
ФАРМАЦИЯ И ФАРМАКОЛОГИЯ
Полимераза гамма - это фермент, который играет ключевую роль в репликации митохондриальной ДНК. Этот фермент демонстрирует высокую точность работы и, в то же время, обладает собственной 3'->5> экзонуклеазной активностью, благодаря которой возможно исправление ошибок полимеризации. Включение «неправильных» нуклеотидов без последующего исправления приводит к накоплению мито-хондриальных мутаций и дисфункции митохондрий [19]. В результате происходит увеличение выработки активных радикалов и повреждение клетки. Гомозиготные животные с системным нокаутом Polg не выживают, поэтому в нашей работе мы использовали эндотелиоспецифичный нокдаун гена [20]. Данная модель отражает одно из ключевых звеньев в патогенезе атеросклероза - оксидативный стресс на фоне митохондриальной дисфункции. Тем не менее, в любой животной модели атеросклероза, индивидуальные различия в сроках и степени формирования бляшек настолько велики, что для тестирования препаратов нужны очень большие группы животных [21-23]. В этой связи мы решили стандартизировать процесс атерогенеза путем индукции атеросклероза баллонной травмой и западной диетой.
В используемой нами модели атеросклероз связан с травматическим воздействием на сосуд на фоне повреждения эндотелиоцитов вследствие дисфункции митохондрий. Для подтверждения эффектов, наблюдаемых in vivo, мы также провели in vitro изучение эффективности выбранных пептидов на первичной культуре эндотелиоцитов Polg-D257A. Для усиления оксидативного стресса мы инкубировали клетки в присутствии 200 мкМ Н2О2.
Изучаемые пептиды продемонстрировали выраженный эндотелиопротективный эффект на модели оксидативного стресса in vitro. Также было обнаружено, что препараты оказывают выраженное редуцирующее влияние на экспрессию проапоптических маркеров. Подобные результаты согласуются с представлением о базовом механизме действия производных эритропоэтина. При активации цитопротек-торного гетерорецептора EPOR/CD131 происходит Jak/STAT-опосредованная передача сигнала в ядро, приводящая к сигналингу «выживания» путем снижения экспрессии проапоптических генов [24, 25]. Аналогичные эффекты стимуляции эритропоэтино-вых рецепторов прежде уже были показаны при моделировании атеросклероза [26].
Кроме того, нами было получено, что экспрессия генов антиоксидантной системы PON2 и SOD2 снизилась у леченых животных по сравнению с контролем. Мы связываем наблюдаемый эффект с тем, что в сосудах животных контрольной группы развивается сильный оксидативный и токсический стресс, который стимулирует увеличение экспрессии генов антиоксидантной системы. В то же время на фоне лечения, патологические явления в клетках были ре-
дуцированы, и стимулирующая активность в отношении генов PON2 и SOD2 также снизилась.
Также мы установили, что пептидные агонисты EPOR/CD131 обладают выраженной противовоспалительной активностью, снижая экспрессию провос-палительных цитокинов и молекул межклеточной адгезии. Воспаление является активным фактором развития атеросклероза и способствует дестабилизации атеросклеротических бляшек [27]. Особую роль в регулировании воспалительных каскадов и инфильтрации сосудов иммунными клетками играют молекулы VCAM-1 ICAM-1 IL-1b TNF-a [28-30]. В целом противовоспалительный эффект эритропоэтина и его производных являются широко изученным феноменом [31, 32]. Поэтому полученные нами данные укладываются в общее представление о фармакоди-намике агонистов EPOR/CD131.
Отдельно мы решили оценить влияние исследуемых пептидов на экспрессию генов, кодирующих ангиогенные факторы. Ангиогенные факторы играют важную роль в прогрессировании атеросклероза и известно, что эритропоэтин способен стимулировать ангиогенез [33]. В зонах атеросклероза местные специфические условия (относительная аноксия, воспаление, окислительный стресс) увеличивают экспрессию классических и неклассических ангиогенных факторов, которые способствуют разрастанию ранее существовавших vasa vasorum [34]. Неоваскуляризация увеличивает местный поток питательных веществ и O2 и, таким образом, может способствовать прогрессиро-ванию и ремоделированию бляшек [35]. Полученные нами результаты продемонстрировали, что в отличие от эритропоэтина, пептидные агонисты EPOR/CD131 демонстрируют антиангиогенное влияние, по крайней мере в отношении атеросклеротической бляшки.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Прежде нами была сформулирована и подтверждена гипотеза, что при добавлении трипептид-ных мотивов KGD и RGD, цитопротекторные пептидные производные эритропоэтина могут приобретать антиагрегантные свойства. В ходе данного исследования мы продемонстрировали, что два инновационных пептида и базовое соединение PaB (pHBSP) защищают эндотелиоциты in vitro, а также снижают проапоптическую, провоспалительную и ангиоген-ную активацию клеток сосудистой стенки в модели атеросклероза в сочетании с митохондриальной дисфункцией. Подобная фармакологическая активность изучаемых препаратов представляется очень перспективной в совокупности со сведениями о наличии у них антиагрегантной активности. Таким образом наблюдаемые эффекты дополняют сведения карди-оваскулярной активности инновационных пептидов P-aB1 и P-aB3, а также новые перспективы в разработке пептидов, сочетающих в себе атеропротекив-ные и антиагрегантные свойства.
PHARMACY & DOI: 10.19163/2307-9266-2020-8-2-100-111
PHARMACOLOGY
ФИНАНСОВАЯ ПОДДЕРЖКА
Работа выполняется при поддержке Минобрнауки России. Соглашение о субсидии № 05.605.21.0191 (уникальный идентификатор соглашения RFMEFI60519X0191).
АВТОРСКИЙ ВКЛАД
О.А. Пученкова - введение препаратов животным, забор органов для молекулярно-биологического и макроскопического изучения, написание статьи; С.В. Надеждин - выделение первичной культуры эндотелио-цитов, изучение цитопротективной активности производных эритропоэтина in vitro. Написание статьи; В.О. Солдатов - написание статьи, разработка дизайна исследования; М.А. Жученко - синтез пептида и анализ литературы; Д.С. Коршунова - выделение РНК, конвертация РНК в кДНК, анализ экспрессии таргетных генов; М.В. Кубекина - выделение РНК, конвертация РНК в кДНК, анализ экспрессии таргетных генов; Е.Н. Коршунов - хендлинг и уход за животными, подготовка экспериментальной группы животных; Л.В. Корокина
- написание статьи, разработка дизайна исследования; А.Л. Куликов - провизорская служба, статистическая обработка и работа с графическим материалом; П.А. Голубинская - написание статьи, формализация списка литературы; В.М. Покровский -наблюдение и уход за животными, хендлинг животных, введение препаратов; Е.А. Патраханов - наблюдение и уход за животными, хендлинг животных, введение препаратов; П.Р. Лебедев
- наблюдение и уход за животными, введение препаратов., некропсия животных; В.В. Гуреев - написание статьи, консультации по планированию, методологии и реализации эксперимента, моделирование баллонной травмы; Т.А. Денисюк - статистическая обработка, написание статьи, формализация списка литературы; В.С. Беляева - анализ графического изображения и измерение площади атеросклеротической бляшки, выделение первичной культуры эндотелиоцитов, изучение цитопротективной активности производных эритропоэтина in vitro; Е.А. Мовчан - выделение первичной культуры эндотелиоцитов, изучение цитопротективной активности производных эритропоэтина in vitro, пробоподготовка образцов аорты для графического анализа; Е.И. Лепетюха - выделение РНК, проведение количественной ПЦР; М.В. Покровский - создание идеи, планирование исследования, консультация по вопросам проведения отдельных этапов экспериментальных работ, обеспечение качества.
КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Zárate A, Manuel-Apolinar L, Basurto L, De la Chesnaye E, Saldívar I. Cholesterol and atherosclerosis. Historical considerations and treatment. Arch Cardiol Mex. 2016; 86(2):163-9. DOI: 10.1016/j.acmx.2015.12.002.
2. Davignon J, Ganz P. Role of endothelial dysfunction in atherosclerosis. Circulation; 2004; 109(23):27-32. DOI: 10.1161/01.CIR.0000131515.03336.f8.
3. Davies PF. Hemodynamic shear stress and the endothelium in cardiovascular pathophysiology. Nat ClinPractCardiovasc Med. 2009; 6(1):16-26. DOI: 10.1038/ncpcardio1397.
4. Sorokin A, Kotani K, Bushueva O, Taniguchi N, Lazarenko V. The cardio-ankle vascular index and ankle-brachial index in young Russians. Journal of atherosclerosis and thrombosis. 2015; 22(2):211-8. DOI: 10.5551/jat.26104.
5. Polonikov A, Bykanova M, Ponomarenko I, Sirotina S, Bocharova A, Vagaytseva K, Shvetsov Y. The contribution of CYP2C gene subfamily involved in epoxygenase pathway of arachidonic acids metabolism to hypertension susceptibility in Russian population. Clinical and Experimental Hypertension. 2017; 39(4):306-311. DOI: 10.1080/10641963.2016.1246562.
6. Bennett M.R, Sinha S, Owens G.K. Vascular Smooth Muscle Cells in Atherosclerosis. Circ Res. 2016; 118(4):692-702. DOI: 10.1161/CIRCRESAHA.115.306361.
7. Kattoor AJ, Pothineni NVK, Palagiri D, Mehta JL. Oxidative Stress in Atherosclerosis. CurrAtheroscler Rep. 2017; 19(11):42s DOI: 10.1007/s11883-017-0678-6.
8. Quintero M, Colombo SL, Godfrey A, Moncada S. Mitochondria as signaling organelles in the vascular
endothelium. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2006; 103:53795384. DOI: 10.1073/pnas.0601026103.
9. Brines M, Patel NS, Villa P, et al. Nonerythropoietic, tissue-protective peptides derived from the tertiary structure of erythropoietin. Proc Natl AcadSci U S A. 2008; 105(31):10925-10930. DOI: 10.1073/pnas.0805594105.
10. Korokin MV, Soldatov VO, Tietze AA, Golubev MV, Belykh AE, Kubekina MV, Puchenkova OA, Denisyuk TA, Gureyev VV, Pokrovskaya TG, Gudyrev OS, Zhuchenko MA, Zatolokina MA, Pokrovskiy MV. 11-amino acid peptide imitating the structure of erythropoietin a-helix b improves endothelial function, but stimulates thrombosis in rats. Pharmacy & Pharmacology. 2019; 7(6):312-320. Russian. DOI: 10.19163/2307-9266-2019-7-6-312-320.
11. Korokin M, Gureev V, Gudyrev O, Golubev I, Korokina L, Peresypkina A, Pokrovskaia T, Lazareva G, Soldatov V, Zatolokina M, Pobeda A, Avdeeva E, Beskhmelnitsyna E, Denisyuk T, Avdeeva N, Bushueva O, Pokrovskii M. Erythropoietin Mimetic Peptide (pHBSP) Corrects Endothelial Dysfunction in a Rat Model of Preeclampsia. Int. J. Mol. Sci. 2020; 21:6759. DOI: 10.3390/ijms21186759.
12. Golubev IV, Gureev VV, Korokin MV, Zatolokina MA, Avdeeva EV, Gureeva AV, Rozhkov IS, Serdyuk EA, Soldatova VA. Preclinical study of innovative peptides mimicking the tertiary structure of the a-helix B of erythropoietin. Research Results in Pharmacology. 2020; 6(2):85-96. DOI: 10.3897/rrpharmacology.6.55385.
13. Trifunovic A, Wredenberg A, Falkenberg M. et al. Premature ageing in mice expressing defective mitochondrial DNA polymerase. Nature. 2004; 429:417-423. DOI: 10.1038/ nature02517.
ISSN 2307-9266 e-ISSN 2413-2241
ФАРМАЦИЯ И ФАРМАКОЛОГИЯ
14. Kujoth GC, Hiona A, Pugh TD, et al. Mitochondrial DNA mutations, oxidative stress, and apoptosis in mammalian aging. Science. 2005. 309(5733):481-484. DOI: 10.1126/ science.1112125.
15. Zvartsev RV, Korshunova DS, Gorshkova EA., et al. Neonatal Lethality and Inflammatory Phenotype of the New Transgenic Mice with Overexpression of Human Interleukin-6 in Myeloid Cells. DoklBiochemBiophys. 2018; 483(1):344-347. DOI: 10.1134/S1607672918060157.
16. Stubbendorff M, Hua X, Deuse T, et al. Inducing myointimal hyperplasia versus atherosclerosis in mice: an introduction of two valid models. J Vis Exp. 2014; 87:51459. DOI: 10.3791/51459.
17. Tediashvili G, Wang D, Reichenspurner H, Deuse T, Schrepfer S. Balloon-based Injury to Induce Myointimal Hyperplasia in the Mouse Abdominal Aorta. J Vis Exp. 2018; 132:56477. DOI: 10.3791/56477.
18. Molina-Sánchez P, Andrés V. Isolation of Mouse Primary Aortic Endothelial Cells by Selection with Specific Antibodies. Methods in Mouse Atherosclerosis. Methods in Molecular Biology. Humana Press, New York, NY. 2015; 1339. DOI: 10.1007/978-1-4939-2929-0_7.
19. Stumpf JD, Saneto RP, Copeland WC. Clinical and molecular features of POLG-related mitochondrial.
20. Kusov P, Deikin A. Developing Novel Transgenic Mice Model Of Atherogenesis With Conditional Oxidative Stress By Introduction Of Epithelium-Specific Inducible Mitochondrial Polg With Mutagenic Activity. Atherosclerosis. 2019; 287:99 s. DOI: 10.1016/j. atherosclerosis.2019.06.287.
21. Poznyak AV, Silaeva YY, Orekhov AN, Deykin AV. Animal models of human atherosclerosis: current progress. Braz J Med Biol Res. 2020. 53(6):9557 s. DOI: 10.1590/1414-431x20209557.
22. Mushenkova NV, Summerhill VI, Silaeva YY, Deykin AV, Orekhov AN. Modelling of atherosclerosis in genetically modified animals. Am J Transl Res. 2019.11(8):4614-4633.
23. Volobueva AS, Orekhov AN, Deykin AV. An update on the tools for creating transgenic animal models of human diseases - focus on atherosclerosis. Braz J Med Biol Res. 2019; 52(5):8108. DOI: 10.1590/1414-431X20198108.
24. Bittorf T, Jaster R, Lüdtke B, Kamper B, Brock J. Requirement for JAK2 in erythropoietin-induced signalling
АВТОРЫ
Олеся А. Пученкова - студентка 6 курса Медицинского института, ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» (НИУ «БелГУ»). ORCID ID: 0000-00027657-0937. E-mail: [email protected]
Сергей В. Надеждин - кандидат биологических наук, научный сотрудник НИИ Фармакологии живых систем, ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» (НИУ «БелГУ»). ORCID ID: 0000-0002-6249-2464. E-mail: [email protected]
Владислав О. Солдатов - младший научный сотрудник, ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет». ORCIDID: 0000-0001-9706-0699. E-mail: [email protected]
pathways . Cell Signal. 1997; 9(1):85-89. DOI: 10.1016/ s0898-6568(96)00121-0.
25. Peng B, Kong G, Yang C. et al. Erythropoietin and its derivatives: from tissue protection to immune regulation. Cell Death Dis. 2020; 11(79). DOI: 10.1038/s41419-020-2276-8.
26. Warren JS, Zhao Y, Yung R, Desai A. Recombinant human erythropoietin suppresses endothelial cell apoptosis and reduces the ratio of Bax to Bcl-2 proteins in the aortas of apolipoprotein E-deficient mice. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 2011; 57(4):424-433. DOI: 10.1097/ fjc.0b013e31820d92fd.
27. Bäck M, Yurdagul A, Tabas I. et al. Inflammation and its resolution in atherosclerosis: mediators and therapeutic opportunities. Nat Rev Cardiol. 2019; 16:389-406. DOI: 10.1038/s41569-019-0169-2.
28. Ley K, Huo Y. VCAM-1 is critical in atherosclerosis. J Clin Invest. 2001; 107(10):1209-1210. DOI: 10.1172/JCI13005.
29. Fatkhullina AR, Peshkova IO, Koltsova EK. The Role of Cytokines in the Development of Atherosclerosis. Biochemistry (Mosc). 2016; 81(11):1358-1370. DOI: 10.1134/S0006297916110134.
30. Fotis L, Agrogiannis G, Vlachos IS, Pantopoulou A, Margoni A, Kostaki M, Verikokos C, Tzivras D, Mikhailidis DP, Perrea D. Intercellular adhesion molecule (ICAM)-1 and vascular cell adhesion molecule (VCAM)-1 at the early stages of atherosclerosis in a rat model. In Vivo. 2012; 26:243-250.
31. Nairz M, Sonnweber T, Schroll A, Theurl I, Weiss G. The pleiotropic effects of erythropoietin in infection and inflammation. Microbes Infect. 2012; 14(3):238-246. DOI: 10.1016/j.micinf.2011.10.005.
32. Liu Y, Luo B, Shi R, et al. Nonerythropoietic Erythropoietin-Derived Peptide Suppresses Adipogenesis, Inflammation, Obesity and Insulin Resistance. Sci Rep. 2015:515134. DOI: 10.1038/srep15134.
33. Kimäkovä P, Solar P, Solärovä Z, Komel R, Debeljak N. Erythropoietin and Its Angiogenic Activity Int J Mol Sci. 2017; 18(7):1519. DOI: 10.3390/ijms18071519.
34. Michel JB, Martin-Ventura JL, Nicoletti A, Ho-Tin-Noe B. Pathology of human plaque vulnerability: mechanisms and consequences of intraplaquehaemorrhages. Atherosclerosis. 2014; 234(2) 311-319.
35. Camare C, Pucelle M, Negre-Salvayre A, Salvayre R. Angiogenesis in the atherosclerotic plaque. Redox Biol. 2017; 12:18-34. DOI: 10.1016/j.redox.2017.01.007.
Максим А. Жученко - кандидат биологических наук, начальник сектора, НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика. E-mail: maksim.zhuchenko@ pharmapark.ru
Диана С. Коршунова - младший научный сотрудник ФГБУН «Институт биологии гена РАН». ORCID ID: 0000-0002-0259-7045 E-mail: korshunova@ genebiology.ru
Марина В. Кубекина - аспирант, младший научный сотрудник Центра высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины ФГБУН «Институт биологии гена РАН». ORCID ID: 0000-0002-8834-1111. E-mail: [email protected]
Евгений Н. Коршунов - заведующий виварием, младший научный сотрудник ФГБУН «Института биологии гена РАН». ORCID ID: 0000-0001-8170-4656. E-mail: [email protected]
PHARMACY & DOI: 10.19163/2307-9266-2020-8-2-100-111
PHARMACOLOGY
Лилия В. Корокина - кандидат медицинских наук, доцент, доцент кафедры фармакологии и клинической фармакологии, ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» (НИУ «БелГУ»). ORCID ID: 0000-00015402-0697. E-mail: [email protected]
Александр Л. Куликов - научный сотрудник научный сотрудник НИИ Фармакологии живых систем, ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» (НИУ «БелГУ»). ORCID ID: E-mail: [email protected]
Полина А. Голубинская - заведующая клинико-диагностической лабораторией, Бюджетное учреждение здравоохранения Воронежской области «Воронежская областная клиническая офтальмологическая больница» (БУЗ ВО «ВОКОБ»). ORCID ID: 00000002-1765-9042. E-mail: [email protected]
Владимир М. Покровский - студент 5 курса Медицинского института, ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» (НИУ «БелГУ»). ORCID ID: 0000-00033138-2075. E-mail: [email protected]
Евгений А. Патраханов - студент 5 курса Медицинского института, ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» (НИУ «БелГУ»). Наблюдение и уход за животными, хендлинг животных, введение препаратов. ORCID ID: 0000-0002-8415-4562. E-mail: [email protected]
Петр Р. Лебедев - студент 5 курса Медицинского института, ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» (НИУ «БелГУ»). ORCID ID: 0000-0001-9102-3360. E-mail: [email protected]
Владимир В. Гуреев - доктор медицинских наук, доцент, профессор кафедры фармакологии и клинической фармакологии, ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» (НИУ «БелГУ»). ORCID ID: 0000-00031433-1225. E-mail: [email protected]
Татьяна А. Денисюк - доктор медицинских наук, доцент кафедры фармакологии, ФГБОУ ВО «Курский государственный медицинский университет» Минздрава России. ORCID ID: 0000-0003-0974-4818. E-mail: [email protected]
Вероника С. Беляева - аспирант кафедры фармакологии и клинической фармакологии, ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» (НИУ «БелГУ»). ORCID ID: 0000-0003-2941-0241. E-mail: nika.beliaeva@ yandex.ru
Евгения А. Мовчан - аспирант кафедры фармакологии и клинической фармакологии, ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» (НИУ «БелГУ»). ORCID ID: 0000-0002-6244-2563. E-mail: [email protected] Елизавета И. Лепетюха - аспирант кафедры фармакологии и клинической фармакологии ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» (НИУ «БелГУ»). E-mail: [email protected]
Михаил В. Покровский - доктор медицинских наук, профессор кафедры фармакологии и клинической фармакологии, руководитель НИИ Фармакологии живых систем, ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» (НИУ «БелГУ»). ORCID: 0000-0002-27616249. E-mail: [email protected]
