CC BY
40
Изучение ангиотропной активности фактора роста нервов в опытах на культуре эндотелиальных клеток человека (HUVEC)
Пекельдина Е.С., Николаев С.В., Антипова Т.А., Крыжановский С.А.
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова», Москва
Резюме. В экспериментах in vitro, выполненных на культуре клеток эндотелия человека (HUVEC), изучали ангиотропные эффекты фактора роста нервов NGF. На интактной культуре клеток показано, что NGF в концентрации 10-9 M проявляет ангиогенные свойства и стимулирует начальную стадию ангиогенеза - тубулогенез, о чём свидетельствует статистически значимое по сравнению с контролем увеличение средней суммарной длины микротрубочек. В условиях оксидативного стресса NGF нивелирует повреждающее действие перекиси водорода в высокой концентрации (200 мкМ) и не только проявляет ангиопротекторное действие, но и препятствует развитию морфологических изменений ядерного хроматина, характерных для апоптоза. В этих условиях NGF (10-9 М) статистически значимо по сравнению с контролем снижает число клеток с конденсированным и фрагментированным хроматином: соответственно 44 ± 9 и 78 ± 9 (р < 0,05). Полученные в работе результаты подтверждают данные о наличии у NGF ангиогенной активности и свидетельствуют о том, что в условиях повреждения эндотелиальных клеток сосудов оксидативным стрессом он проявляет выраженную ангиопротекторную и антиапоптотическую активность.
Ключевые слова: фактор роста нерва; клетки HUVEC; перекись водорода; оксидативный стресс; ангиопротекторная активность; анти-апоптотическая активность
Для цитирования:
Пекельдина Е.С., Николаев С.В., Антипова Т.А., Крыжановский С.А. Изучение ангиотропной активности фактора роста нервов в опытах на культуре эндотелиальных клеток человека HUVEC // Фармакокинетика и фармакодинамика. - 2018. - № 1. - С. 32-35.
DOI: 10.24411/2587-7836-2018-10004.
Study of angiotropic activity of the nerve growth factor in experiments on human endothelial cell culture (HUVEC)
PekeLdina E.S., NicoLaev S.V., Antipova T.A., Kryzhanovskii S.A.
FSBI «Zakusov Institute of Pharmacology», Moscow
Resume. In vitro experiments performed on human endothelial ceLL culture (HUVEC), nerve growth factor (NGF) angiotropic effects were studied. An intact ceLL culture it was shown that NGF exhibited angiogenic properties and stimulated the initial stage of angiogenesis -tubuLogenesis at a 10-9 M concentration, as evidenced by a statisticaLLy significant increase in the average totaL Length of microtubuLes compared with the control. Under conditions of oxidative stress, NGF neutraLizes the damaging effect of hydrogen peroxide in a high concentration (200 |±M) and not onLy shows an angioprotective effect, but aLso prevents the deveLopment of morphoLogicaL changes in nucLear chromatin, characteristic for apoptosis. Under these conditions NGF (10-9 M) reduces statisticaLLy significant by comparison with the controL the number of ceLLs with condensed and fragmented chromatin: 44 ± 9 and 78 ± 9 (р < 0,05), respectiveLy. The obtained resuLts confirm the data about the NGF angiogenic activity and indicate that under conditions of the vesseLs endotheLiaL ceLLs damage by oxidative stress, it exhibits pronounced angioprotective and anti-apoptotic activity.
Keywords: nerve growth factor; HUVEC ceLLs; hydrogen peroxide; oxidative stress; angioprotective activity; antiapoptotic activity
For citations:
PekeLdina ES, NicoLaev SV, Antipova TA, Kryzhanovskii SA. Study of angiotropic activity of the nerve growth factor in experiments on human endotheLiaL
ceLL cuLture (HUVEC) . Farmakokinetika i farmakodinamika. 2018;1:32-35. (In Russ). DOI: 10.24411/2587-7836-2018-10004.
Введение
Фактор роста нервов (nerve growth factor - NGF) относится к семейству регуляторных белков - нейротро-финов, принимающих участие в регуляции процессов пролиферации, дифференциации и миелинизации, а также поддержании функциональной активности центральных и периферических нейронов. Помимо этого, нейротрофины и, в частности NGF, играют важную роль в образовании синапсов и регуляции синапти-ческой пластичности [1, 2]. Исторически NGF и его предшественник proNGF рассматривались как одни из основных регуляторов нейрональной функции. Однако
в настоящее время накоплен большой литературный материал, свидетельствующий о том, что биологическая роль КОБ существенно шире и обусловлена его способностью регулировать процессы выживания клетки, апоптоза, клеточной пролиферации, воспаления, ангиогенеза и ремоделирования тканей [3]. В частности показано, что КОБ является одним из ключевых эндогенных регуляторов ангиогенеза и, помимо ЦНС, синтезируется и экскретируется эндотелиальными и гладкомышечными клетками сосудов, а на их клеточной мембране представлены специфичные для КОБ ТгкА рецепторы [4, 5], посредством взаимодействия с которыми КОБ реализует свои ангиогенные эффекты.
32
фармакокинетика и фшщишика
NGF-опосредованная активация TrkA рецепторов, расположенных на клеточных мембранах эндотели-альных и гладкомышечных клеток сосудов, влечёт за собой активацию PI3K-Akt, Ras-MAPK и PLCy1-IP3 внутриклеточных сигнальных путей, инициирующих неоангиогенез [6-8]. Этот феномен описан как для нормальных, так и патологически изменённых тканей.
Цель настоящего исследования - изучение ангио-генной активности NGF на интактной и повреждённой культуре изолированных клеток эндотелия человека HUVEC.
Материалы и методы
Интактные клетки. Оценку ангиогенной активности NGF (BD Bioscience) проводили на культуре клеток эндотелия человека (HUVEC). Клетки эндотелия рассаживали в среде ДМЕМ (HyClone), содержащей 20 мМ Hepes (ICN), 2 мМ L-глутамина (ICN), гепарин (5 Ед/мл) (Панфарма), ECGF (200 мкг/мл) (Sigma), 10 % FBS (Invitrogen) с плотностью 4,0 тыс. на лунку в 96-луночные планшеты, покрытые поли-Д-лизином. NGF (10-9 М) вносили через 30 мин после рассеивания клеток на планшеты и затем каждые 48 ч (всего 3 внесения) в течение недели. Через 24 ч после последнего внесения NGF клетки фотографировали с помощью микроскопа Nikon Eclipse TS100-F (Япония) в фазовом контрасте при увеличении х100. Длину микротрубочек измеряли в 5 полях зрения каждой лунки с использованием программы WCIF ImageJ и выражали в микрометрах.
Повреждённые клетки. Эксперименты проводили на модели оксидативного стресса [9] в культуре эн-дотелиальных клеток человека (HUVEC), который вызывали добавлением в культуру клеток перекиси водорода (Н2О2) в конечной концентрации 200 мкМ. Клетки культивировали в той же среде, что и интактные клетки в атмосфере 5 % СО2 при 37 °С в течение 24 ч. Далее среду, содержащую Н2О2, заменяли на нормальную и через 24 ч определяли жизнеспособность клеток с помощью МТТ-теста. Светопоглощение измеряли на спектрофотометре «Multiscan» (Thermo) при длине волны 600 нм. Ангиогенную активность NGF оценивали с помощью световой микроскопии при увеличении х200. NGF вносили после отмывки среды с Н2О2 в конечной концентрации 10-9 M и далее каждые 48 ч в течение недели. Через 24 ч после последнего внесения NGF клетки фотографировали с помощью микроскопа Nikon Eclipse TS100-F (Япония) в фазовом контрасте при увеличении х100. Длину микротрубочек измеряли в 5 полях зрения каждой лунки с использованием программы WCIF ImageJ и выражали в микрометрах. В следующей серии экспериментов оценивали анти-апоптотическую активность NGF. В качестве маркера апоптоза использовали флюоресцентный краситель Хехст (Hoechst 33258), который позволяет выявить клетки с конденсированным и фрагментированным хроматином, характерным для апоптоза и некроза.
Для этой цели клетки фиксировали метанолом. Далее проводили окрашивание клеток ядерным красителем Hoechst 33258 (10 мг/мл) (Serva, FRG) в течение 30 мин при комнатной температуре.
Статистическую обработку результатов проводили следующим образом: Нормальность распределения выборок проверяли с помощью критерия Шапиро-Уилка, гомогеность дисперсий - с помощью критерия Левена. Так как полученные данные были распределены по нормальному закону, а дисперсии выборок были негомогенны, то для определения статистической значимости различий использовали критерий Стьюдента в приближении для выборок с неравными дисперсиями, для учёта множественности сравнений использовали поправку Бонферрони. Результаты выражали в виде средних арифметических и их стандартных ошибок. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05.
Результаты и обсуждение
На интактной культуре изолированных клеток эндотелия человека (HUVEC) показано, что NGF в концентрации 10-9 M стимулирует начальную стадию ангиогенеза — тубулогенез, о чём свидетельствует статистически значимое (р < 0,001) по сравнению с контролем увеличение средней суммарной длины микротрубочек: контроль — 162 ± 6 мкм; NGF — 330 ± 9 мкм. Таким образом, в этой серии экспериментов нами были подтверждены известные данные литературы о том, что NGF обладает выраженной ангиогенной активностью [7, 10, 11].
В следующей серии экспериментов оценивали ангиопротекторную активность NGF на культуре клеток эндотелия человека (HUVEC), повреждённых перекисью водорода. На первом этапе исследования была отработана модель повреждения клеток сосудистого эндотелия человека высокой концентрацией перекиси водорода. Было показано, что перекись водорода в высокой концентрации (200 мкМ) инициирует повреждение клеток (HUVEC). Так, если длина интактных клеток (контроль) равнялась в среднем 125 ± 24 мкм, то в группе с Н2О2 этот показатель был статистически значимо ниже (р < 0,05), чем в контроле и составлял 87 ± 10 мкм (рис. 1). На следующем этапе изучали ангиопротекторные эффекты NGF, который вносили в лунки после отмывки клеток от Н2О2. Нами показано, что NGF (10-9 M) в условиях оксидативного стресса проявляет значимую (р < 0,05) ангиопротекторную активность: длина клеток в группе NGF практически не отличалась от таковой в интактной группе и составляла соответственно 138 ± 14 мкм и 125 ± 24 мкм (рис. 1).
В последней серии экспериментов изучали анти-апоптотические эффекты NGF на культуре (HUVEC), повреждённых перекисью водорода. Результаты экспериментов приведены на рис. 2. Как видно из приведённых данных, добавление в культуру клеток перекиси
контроль Н202 Н202 + мер
Рис. 1. Ангиопротекторное действие КОБ (10-9 М) на модели оксидативного стресса в культуре клеток сосудистого эндотелия человека (НИУЕС).
Статистическая значимость: от контроля * - р < 0,05; от перекиси водорода Л - р < 0,05
водорода вызывает повреждение ядер клеток сосудистого эндотелия: в контроле число клеток с конденсированным и фрагментированным хроматином составило 9 ± 2, а после внесения перекиси водорода - 78 ± 9 (р < 0,05), что свидетельствует о том, что оксидативный стресс оказывает проапоптотическое действие. КОБ (10-9 М) достоверно по сравнению с контролем снижает число повреждённых клеток, соответственно, 44 ± 9 и 78 ± 9 (р < 0,05), что позволяет говорить о том, что КОБ препятствует развитию морфологических изменений ядерного хроматина, характерных для апоптоза.
Известно, что КОБ-опосредованная активация ТгкА рецепторов, расположенных на клеточных мембранах эндотелиальных клетках сосудов, активирует Р13К-Ак;, Яа8-МАРК и РЬСу1-1Р3 внутриклеточные сигнальные
контроль НА Н202 + NGF
Рис. 2. Антиапоптотическое действие NGF (10-9 М) на модели оксидативного стресса в культуре клеток сосудистого эндотелия человека (HUVEC).
Данные окрашивания Hoechst 33258. Статистическая значимость: от контроля * - р < 0,05; от перекиси водорода Л - р < 0,05
пути, стимулирующие пролиферацию, миграцию и инвазию эндотелиальных клеток, т. е. инициирует ангиогенез [6-8 и др.]. Помимо этого, КОБ может стимулировать ангиогенез посредством активации фактора роста эндотелия сосудов - УЕОБ-А [11]. Активированный КОБ фактор роста эндотелия сосудов (УЕОБ-А) взаимодействует с БЬК-1 рецепторами, в результате чего происходит экспрессия урокиназы и/или её рецепторов [12]. Экспрессия урокиназы является начальным этапом программы, связанной с миграцией клеток, и необходима для перемещения клеток из одного тканевого компартмента в другой [13]. Ключевым моментом процесса клеточной инвазии является взаимодействие урокиназы со специфичным для неё урокиназным рецептором — иРАЯ. иРАЯ рецепторы фиксируются к клеточной мембране липидным «якорем» - инозитол-фосфогликаном, — и способны латерально перемещаться в фосфолипидном слое клеточной мембраны и, в случае активации, концентрируются в её определённых участках, в частности в случае миграции клетки на её «лидирующем» полюсе. Такие свойства активированных иРАЯ рецепторов позволяют осуществлять строго направленную локальную деградацию внеклеточного матрикса, что необходимо для миграции и инвазии клеток [13, 14].
Если ангиогенные эффекты КОБ достаточно хорошо известны, то его ангиопротекторное действие практически не изучено. В библиотеке РиЬ.Ме^ представлена только одна, опубликованная в 2017 г. статья, свидетельствующая о способности КОБ защищать эндотелиальные клетки сосудов от повреждающего действия индометацина [15]. Авторы статьи полагают, что ангиопротекторное действие КОБ может быть связано с его способностью препятствовать деполяризации митохондриальной мембраны и/или стимулировать экспрессию 1ОБ-1 (инсулиноподобный фактор роста 1) в эндотелиальных клетках. Близкая ситуация наблюдается в отношении изучения влияния КОБ на апоптоз эндотелиальных клеток. В литературе имеются единичные противоречивые сообщения о наличии у КОБ или антиапототической [16], или проапототической активности [17].
Заключение
Результаты настоящего исследования подтверждают данные о наличии у КОБ ангиогенной активности и свидетельствуют о том, что в условиях повреждения эндотелиальных клеток сосудов оксидативным стрессом он проявляет выраженную ангиопротекторную и антиапоптотическую активность.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Крыжановский Сергей Александрович Автор, ответственный за переписку
e-mail: SAK-538@yandex.ru ORCID ID: 0000-0003-2832-4739 SPIN-код: 6596-4865
д. м. н., зав. лабораторией фармакологического скрининга ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова», Москва
Пекельдина Евгения Сергеевна
SPIN-код: 3225-9216 н. с. лаборатории фармакологического скрининга ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова», Москва
Kryzhanovskii Sergey Corresponding author
e-mail: SAK-538@yandex.ru ORCID ID: 0000-0003-2832-4739 SPIN code: 6596-4865
DM, Head of Laboratory of pharmacological screening FSBI "ZAKUSOV INSTITUTE OF PHARMACOLOGY", Moscow
Pekeldina Еvgeniya
SPIN code: 3225-9216
Researcher Scientist of Laboratory of pharmacological screening FSBI "ZAKUSOV INSTITUTE OF PHARMACOLOGY", Moscow
Николаев Сергей Владимирович
ORCID ГО: 0000-0003-4584-746Х SPIN-код: 1144-0269
н. с. лаборатории нейропротекции ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В.Закусова», Москва
Nicolaev Sergey
ORCID ID: 0000-0003-4584-746X SPIN code: 1144-0269
Researcher Scientist of Laboratory of neuroprotection pharmacology FSBI "ZAKUSOV INSTITUTE Of PHARMACOLOGY", Moscow
Антипова Татьяна Алексеевна
ORCID ГО: 0000-0002-9309-4872 SPIN-код: 7723-6008
к. б. н., зав. лабораторией нейропротекции ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова», Москва
Antipova Tatyana
ORCID ID: 0000-0002-9309-4872 SPIN code: 7723-6008
Candidate of Biological Sciences, Head of Laboratory of neuroprotection pharmacology FSBI "ZAKUSOV INSTITUTE OF PHARMACOLOGY", Moscow
Литература / References
1. Poo MM. Neurotrophins as synaptic modulators. Nat Rev Neurosci. 2001 Jan;2(1):24-32. DOI: 10.1038/35049004
2. Bradshaw RA, Pundavela J, Biarc J, et al. NGF and proNGF: Regulation of neuronal and neoplastic responses through receptor signaling. Adv Biol Regul. 2015 May;58:16-27. DOI: 10.1016/j.jbior.2014.11.003
3. Schenck K, Schreurs O, Hayashi K, Helgeland K. The role of nerve growth factor (NGF) and its precursor forms in oral wound healing. Int J MolSci. 2017 Feb 11;18(2). pii: E386. DOI: 10.3390/ijms18020386
4. Saygili E, Kluttig R, Rana OR, et al. Age-related regional differences in cardiac nerve growth factor expression. Age (Dordr). 2012 Jun;34(3):659-667. DOI: 10.1007/s11357-011-9262-0
5. Retamales-Ortega R, Orostica L, Vera C, et al. Role of nerve growth factor (NGF) and miRNAs in epithelial ovarian cancer. Int J Mol Sci. 2017 Feb 26;18(3). pii: E507. DOI: 10.3390/ijms18030507
6. Nico B, Mangieri D, Benagiano V, et al. Nerve growth factor as an angiogenic factor. MicrovascRes. 2008 Mar;75(2):135- 141.
DOI: 10.1016/j.mvr.2007.07.004
7. Ahluwalia A, Jones MK, Brzozowski T, Tarnawski AS. Nerve growth factor is critical requirement for in vitro angiogenesis in gastric endothelial cells. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2016 Nov 1;311(5):G981-G987. DOI: 10.1152/ajpgi.00334.2016
8. Lazarovici P, Lahiani A, Gincberg G, et al. Nerve growth factor-induced angiogenesis: 1. Endothelial cell tube formation assay. Methods Mol Biol. 2018;1727:239-250. DOI: 10.1007/978-1-4939-7571-6_18
9. Mu P, Liu Q, Zheng R. Biphasic regulation of H2O2 on angiogenesis implicated NADPH oxidase. Cell Biol Int. 2010 Oct;34(10):1013- 1020. DOI: 10.1042/CBI20090092
10. Diao YP, Cui FK, Yan S, et al. Nerve growth factor promotes angiogenesis and skeletal muscle fiber remodeling in a murine model of hindlimb ischemia. Chin Med J (Engl). 2016 Feb 5;129(3):313-319. DOI: 10.4103/0366-6999.174496
11. Wang J, Fu X, Yu L, et al. Preconditioning with VEGF enhances angiogenic and neuroprotective effects of bone marrow mononuclear cell transplantation in a rat model of chronic cerebral hypoperfusion. Mol Neurobiol. 2016 Nov;53(9):6057- 6068. DOI: 10.1007/s12035-015-9512-8
12. Herkenne S, Paques C, Nivelles O, et al. The interaction of uPAR with VEGFR2 promotes VEGF-induced angiogenesis. Sci Signal. 2015 Nov 17;8(403):ra117. DOI: 10.1126/scisignal.aaa2403
13. Breuss JM, Uhrin P. VEGF-initiated angiogenesis and the uPA/uPAR system. Cell AdhMigr. 2012 Nov-Dec;6(6):535-615. DOI: 10.4161/cam.22243
14. Montuori N, Ragno P. Role of uPA/uPAR in the modulation of angiogenesis. Chem Immunol Allergy. 2014;99:105- 122. DOI: 10.1159/000353310
15. Ahluwalia A, Jones MK, Hoa N, Tarnawski AS. NGF protects endothelial cells from indomethacin-induced injury through activation of mitochondria and upregulation of IGF-1. Cell Signal. 2017 Dec;40:22-29. DOI: 10.1016/j.cellsig.2017.08.006
16. Urban D, Lorenz J, Meyborg H, et al. Proprotein convertase furin enhances survival and migration of vascular smooth muscle cells via processing of pro-nerve growth factor. JBiochem. 2013 Feb;153(2):197-207.
DOI: 10.1093/jb/mvs137
17. Han Y, Qi Y, Kang J, et al. Nerve growth factor promotes formation of lumen-like structures in vitro through inducing apoptosis in human umbilical vein endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 2008 Feb 15;366(3):685- 691. DOI: 10.1016/j.bbrc.2007.11.160
