CC BY
31ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ НАУКИ
Moskalenko A.M.
PhD student in Department of Nutriciology and Pharmaceutical Bromatology, National University of Pharmacy, Kharkov, Ukraine
Popova N. V.
Doctor of Pharmacy, Professor, Head of Department of Nutriciology and Pharmaceutical Bromatology,
National University of Pharmacy, Kharkov, Ukraine
Gladukh Ie. V.
Doctor of Pharmacy, Professor, Head of Industrial Pharmacy Department, National University of Pharmacy, Kharkov, Ukraine Москаленко Андрей Николаевич аспирант кафедры нутрициологии и фармацевтической броматологии Национального фармацевтического университета, Харьков, Украина Попова Наталья Вячеславовна
доктор фармацевтических наук, профессор, заведующая кафедры нутрициологии и фармацевтической броматологии Национального фармацевтического университета, Харьков, Украина
Гладух Евгений Владимирович доктор фармацевтических наук, профессор, заведующий кафедрой промышленной фармации Национального фармацевтического университета, Харьков, Украина
RESEARCH OF AMINO ACID COMPOSITION OF FLOWERS AND HERB OF IMMORTELLE
(HELICHRYSUM BRACTEATUM) ИЗУЧЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА СЫРЬЯ БЕССМЕРТНИКА ПРИЦВЕТНИКОВОГО (HELICHRYSUM BRACTEATUM)
Summary: Using a high-performance liquid chromatograph Agilent 1200 (Agilent technologies, USA), a qualitative analysis of the amino-acid composition of flowers and herb immortelle was carried out. It has been established that 16 amino acids are contained in the herbal drugs: 7 essential (threonine, valine, methionine, leucine, isoleucine, phenylalanine, lysine), 6 (asparagine acid, alanine, glycine, glutamic acid, proline, serine) and 3 semi-essential (arginine, histidine, tyrosine). Among free amino acids in large quantities in flowers and herb are proline, arginine and valine. Among the total amino acids in flowers and herb are leucine is 26.96% (flowers), 27.69% (herb), glutamic acid 22.23% (flowers), 24.48% (herb), aspartic acid 18.63 %.
Key words: immortelle, amino acid, chromatography analysis.
Аннотация: С использованием высокоэффективного жидкостного хроматографа Agilent 1200 (Agilent technologies, USA) изучен качественный состав и содержание аминокислот цветков и травы бессмертника прицветникового. Было идентифицировано 16 аминокислот: 7 незаменимых (треонин, валин, метионин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, лизин), 6 заменимых (аспарагиновая кислота, аланин, глицин, глутаминовая кислота, пролин, серин) и 3 частично заменимых (аргинин, гистидин, тирозин). Среди свободных аминокислот в большом количестве в цветках и траве находятся пролин, аргинин и валин. В общей сумме аминокислот в цветках и траве преобладают: лейцин 26,96% (цветки), 27,69% (трава), глутаминовая кислота 22,23% (цветки), 24,48% (трава), аспаргиновая кислота 18,63% (цветки), 19,46% (трава).
Ключевые слова: бессмертник прицветниковый, аминокислоты, хроматографический анализ.
Введение прицветникового имеет разнообразный состав биоБессмертник прицветниковый (Helichrysum логически активных веществ. Были обнаружены bracteatum) - многолетнее ( в культуре - однолет- флавоноиды, флавонгликозиды, гидроксикоричные нее) травянистое растение, относящиеся к семей- кислоты. Идентифицированы 15 фенольных произ-ству Астровые, (сложноцветные, Asteraceae), роду водных, включая кофейную и хлорогенные кис-Цмин (Helichrysum). Природным ареалом обитания лоты, производные лютеолина, в том числе O- и C-этого растения является Австралия, имея распро- гликозиды, а также ауроны и их гликозиды. Кроме странение по всей территории континентальной ча- этого был изучен минеральный состав. Трава и сти материка, от влажных лесов до пустынь и гор- цветки содержат 5 макроэлементов и 10 микроэле-ных территорий [1]. Наиболее распространёнными ментов, среди которых: натрий, кальций, калий, в мире сортами являются: Файербаль, Виолет, магний, фосфор, железо, алюминий, кремний, мар-Уайт, Иеллоу, Дабл Микст, Анвинс Саммер Спек- ганец [2, 3].
трум. В Украине созданы сорта Сомбреро, Сафари По результатам предварительных фитохимии Мореска и др. ческих исследований, а также с учетом наличия сы-
Предварительными фитохимическими иссле- рьевой базы, бессмертник прицветниковый явля-
дованиями установлено, что сырье бессмертника ется перспективным растением для дальнейшего
изучения химического состава и создания на его основе лекарственных препаратов и диетических добавок.
Аминокислоты являются веществами первичного синтеза в растениях, они имеют важное функциональное значение для жизнедеятельности растения. Прежде всего, аминокислоты являются субстратом для синтеза функциональных белков. Кроме этого, из аминокислот в растениях образуются в процессе биосинтеза вещества вторичного синтеза, которые в основном и обуславливают фармакологическое действие растения. Также аминокислоты самостоятельно обладают фармакологическим действием [4].
Целью исследование является определение качественного состава и количественного содержания аминокислот с помощью хроматографических методов в сырье (трава и цветки) бессмертника при-цветникового (Helichrysum braceatum).
Материалы и методы исследования
В качестве объекта исследования использовали цветки и траву бессмертника прицветнико-вого, которая была заготовлена в период цветения на фармакопейном участке ботанического сада НФаУ (2017 г). После сбора сырьё сушили, приводили в стандартное состояние в соответствии с общими требованиями GACP [5].
Предварительный анализ качественного состава аминокислот проводили методом хроматографии на бумаге. Аналитическую пробу сырья (цветки и трава бессмертника) измельчали до размера частиц 1-2 мм. Далее 10,0 г измельченного сырья помещали в колбу, заливали 70% спиртом (1:10) и экстрагировали на водяной бане. Полученный экстракт упаривали в вакууме до состояния густого экстракта и его наносили на хроматограмму.
Хроматографический анализ проводили методом восходящей бумажной хроматографии на бумаге «Filtrak» FN-4 в системе растворителей н-бу-танол-уксусная кислота - вода (4:1:2). Для проведения сравнения использовали стандартный набор аминокислот (ТУ 6-09-3147-83) в концентрации 0,1%. После прохождения в системе растворителей, хроматограммы обрабатывали 0,2% спиртовым раствором нингидрина в ацетоне и помещали в сушильный шкаф, где высушивали при температуре 60-80 °С. Аминокислоты идентифицировали по окраске пятен и величине Rf в сравнении с достоверными образцами [4, 6].
Определение содержания аминокислот осуществляли на высокоэффективном жидкостном хроматографе Agilent 1200 (Agilent technologies, USA), хроматографическая колонка Zorbax AAA (150 мм x 4,6 мм, 3 мкм). Хроматографирование
проводили с использованием мобильных фаз: А -40 mM Na2HPO4, pH 7,8; В - ACN: MeOH: вода дистиллированная (45:45:10, v/ v/v), температура термостата колонки 40 °С. Предколонковую деривати-зацию аминокислот осуществляли в автоматическом программируемом режиме с использованием FMOC реагента 9-флуоренилметоксикарбонил хлорид (Agilent 5061-3337) и ОРА реагента о-фталевый альдегид (Agilent 5061-3335). Дериватизованые производные детектировали с помощью флуоресцентного детектора [6, 7].
Для определения свободных аминокислот около 0,1 г (точная навеска) предварительно измельчённого растительного сырья бессмертника помещали у виалу, добавляли 2 мл водного раствора 1М хлористоводородной кислоты, помещали на ультразвуковую баню, выдерживали в течение 3 часов при 50 °С.
Для определения суммы аминокислот к навеске сырья добавляли 2 мл водного раствора 6М хлористоводородной кислоты и помещали в термостат при 110 °С. Кислотный гидролиз проводили в течение 24 часов.
Идентификацию исследуемых аминокислот проводили путем сравнения времени удерживания пиков на хроматограмме испытуемого раствора с временем удерживания веществ - стандартов аминокислот на хроматограмме раствора сравнения. Количественное содержание связанных аминокислот определяли путем вычитания содержания свободных аминокислот от их общего содержания [7, 8].
Расчет содержания аминокислот (Х, мкг / мг) проводили по формуле:
C ■ V
__р-Ра
m
преп
где С - концентрация в мкг / мл, полученная из расчета хроматограммы раствора сравнения и испытуемого раствора; Vр-ра - объем растворителя для экстракции, мл; тпреп - навеска сырья, мг [6, 7, 8].
Результаты исследования и их обсуждение
Предварительные результаты хроматографи-ческого анализа аминокислот травы и цветков бессмертника представлены в таблице 1.
Образцы ВЖХ-хроматограмм, полученные при проведении анализа определения содержания аминокислот в траве и цветках бессмертника при-цветникового, приведены на рисунках 1, 2, 3, 4, а сведенные результаты определения приведены в таблице 2.
Таблица 1
Хроматографическая характеристика аминокислот
Аминокислота Общая формула Молекулярная масса Величина КГ* * *
Аланин** С3Н7Ш2 89 0,04
Аргинин** СбНмМ4О2 174 0,20
Аспаргиновая кислота** С4Н7Ш4 133 0,16
Валин* С5Н11 N02 117 0,43
Гистидин** СбН9№02 155 0,10
Глицин** С2Н5Ш2 75 0,21
Глутаминовая кислота** С5Н9Ш4 147 0,17
Изолейцин* СвН1э02М 131 0,72
Лейцин* СвН1зШ2 146 0,63
Лизин* С^Н^ОЬ 146 0,05
Метионин* СзНцО^Б 149 0,39
Пролин** С5Н9N02 115 0,24
Серин** СзН7N0з 105 0,15
Тирозин** С9Н11Ш3 181 0,57
Треонин* С4Н9N0з 119 0,18
Фенилаланин* СН^ОЪ 165 0,32
Примечание:
* - незаменимые аминокислоты; ** - заменимые аминокислоты.
***Система для хроматографироестия: бутанол-уксусная кислота-вода 4.
1:2
Рис. 1. ВЭЖХхроматограмма, полученная в условиях определения свободных аминокислот в цветках
бессмертника прицветникового
Рис. 3. ВЭЖХхроматограмма, полученная в условиях определения свободных аминокислот в траве
бессмертника прицветникового
Рис. 4. ВЭЖХхроматограмма, полученная в условиях определения общего количества аминокислот в
траве бессмертника прицветникового
Таблица 2
Аминокислоты цветков и травы бессмертника прицветникового (Helichrysum bracteatum)
Название аминокислоты Содержание аминокислот, мг/100г
Свободные Связанные Общее количество
цветки трава цветки трава цветки трава
незаменимые (эссенциальные) аминокислоты
Валин 32,3 29,6 98,1 195,5 130,4 225,1
Изолейцин 17,9 19,8 87,3 166,3 105,2 186,1
Лейцин 16,4 10,2 185,5 341,0 201,9 351,2
Лизин 19,1 8,7 46,0 32,5 65,1 41,2
Метионин 0 0 0 32,5 0 32,5
Треонин 19,9 15,8 99,7 186,9 119,6 202,7
Фенилаланин 19,9 19,6 106,8 209,9 126,7 229,5
Всего незаменимых аминокислот 125,5 103,7 623,4 1164,6 748,9 1268,3
заменимые аминокислоты
Алании 0 0 183,1 280,8 183,1 280,8
Аргинин 128,2 81,7 85,1 178,9 213,3 260,5
Аспаргиновая кислота 47,1 24,6 294,1 457,1 341,2 481,8
Гистидин 30,8 20,0 59,4 73,1 90,2 93,1
Глицин 11,7 6,3 174,6 218,2 186,4 224,6
Глутаминовая кислота 28,1 19,3 379,1 586,8 407,2 606,1
Пролин 130,9 140,5 25,0 22,5 155,9 163,0
Серин 44,0 30,2 137,9 216,6 181,9 246,8
Тирозин 8,8 5,9 63,8 113,7 72,6 119,6
Всего заменимых аминокислот 429,6 328,5 1402,1 2147,7 1831,8 2476,3
Соотношение: незаменимые аминокислот / заменимые аминокислот 0,29 0,32 0,44 0,54 0,41 0,51
Как видно из рисунков хроматограмм 1, 2, 3, 4 и результатов (таблицах 1, 2), в цветках и траве бессмертника прицветникового было идентифицировано 16 аминокислот: 7 незаменимых (треонин, валин, метионин, лейцин, изолейцин, фенилаланин,
лизин), 6 заменимых (аспарагиновая кислота, ала-нин, глицин, глутаминовая кислота, пролин, серин) и 3 частично заменимых (аргинин, гистидин, тирозин). Доля каждой аминокислоты от общей суммы аминокислот в сырье бессмертника показана в таблице 3.
Таблица 3
Доля аминокислот в сырье бессмертника прицветникового
_(от общей суммы аминокислот)_
Название аминокислоты Содержание, %
Цветки Трава
Незаменимые аминокислоты
Валин 17,41 17,75
Изолейцин 14,05 14,67
Лейцин 26,96 27,69
Лизин 8,69 3,25
Метионин 0 2,56
Треонин 15,97 15,98
Фенилаланин 16,92 18,10
Заменимые аминокислоты
Аланин 10,00 11,34
Аргинин 11,64 10,52
Аспаргиновая кислота 18,63 19,46
Гистидин 4,92 3,76
Глицин 10,18 9,07
Глутаминовая кислота 22,23 24,48
Пролин 8,51 6,58
Серин 9,93 9,97
Тирозин 3,96 4,83
Среди незаменимых аминокислот в цветках бессмертника преобладает лейцин 26,96%, а среди заменимых аминокислот в цветках доминируют глутаминовая и аспаргинова кислоты 22,23% и 18,63% соответственно. В траве среди незаменимых аминокислот больше всего представлены лейцин 27,69% и фенилаланин 18,1%. Среди заменимых аминокислот - глутаминовая и аспаргинова кислоты 24,48% и 19,46% соответственно.
Значительное содержание незаменимых аминокислот повышает биологическую ценность сырья при создании лекарственных средств и диетических добавок.
Выводы
1. Впервые было проведено исследование аминокислотного состава травы и цветков бессмертника прицветникового с использованием методов хроматографии. Установлен качественный состав и содержание свободных и связанных аминокислот.
2. В результате анализа в исследуемом сырье определено 16 аминокислот, в том числе 7 незаменимых, 6 заменимых и 3 частично заменимых.
3. Среди свободных аминокислот в большом количестве в цветках и траве находятся пролин, аргинин и валин. Среди связанных аминокислот в цветках и траве преобладают глутаминовая и аспаргинова кислоты, а также лейцин.
4. Полученные данные могут быть использованы при разработке новых лекарственных препаратов и диетических добавок на основе цветков и травы бессмертника прицветникового.
Список литературы:
1. Gardner CA. Wildflowers of Western Australia (17th ed.) / Perth, Western Australia: St. GeorgBooks, 1990. - 144 p.
2. Дослвдження мшерального складу сиро-вини безсмертника приквггкового (Helichrysum bracteatum) / A. M. Москаленко, Н. В. Попова // Укранський бюфармацевтичний журнал. - 2018. -№ 1(54). - C. 72—76.
3. Виды бессмертника в медицине и фармации / Н.В. Попова, В.И. Литвиненко, Л.А. Бобриц-кая, А.Н. Москаленко, Н.Ю. Бондаренко // Застосу-вання методiв лжування i ашпрепарапв у медичнш, фармацевтичнш та косметичнш практицг Мат-ли всеукрашсько! наук-прак. конф с мiжнарод. уч. (Харшв 29-30 березня). / Х. : 2018 - C. 400 - 407.
4. Аминокислоты глазами химиков, фармацевтов, биологов: в 2-х т. Том 1 А.О. Сыровая, Л.Г Шаповал, В.А. Макаров [и др.] - Х. : «Щедра садиба плюс», 2014 - 228 с.
5. WHO guidelines on good agricultural and collection practices (GACP) for medicinal plants // World Health Organization Geneva - 2003. - 72 р.
6. Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии : в 2 ч. / М. Шаршунова, В. Шварц, Ч. Михалец. - М. : Мир.Ч. 2. - 1980 - 297 с.
7. Rapid, accurate, sensitive and reproducible HPLC analysis of amino acids. Amino acids analysis using zorbax eclipse - AAA columns and the agilent 1100 HPLC. / J. Henderson, R. Ricker, B. Bidling-meyer et al // Agilent Technical Note -1999. - P. 980 -1193.
8. Amino acid analysis by high-performance liquid chromatography after derivatization with 9-fluore-nylmethyloxycarbonyl chloride. / A. Jambor, I MolnarPerl // Journal of Chromatography A - 2009 - 1216. -P. 3064-3077.
