CC BY
14УДК 633.63:575.174.015. 3 doi.org/10.24412/2413-5518-2023-8-20-24
Изучение активности аскорбатпероксидазы и глутатионредуктазы у генотипов сахарной свёклы в условиях солевого стресса
Т.П. ФЕДУЛОВА, вед. научн. сотрудник, д-р биолог. наук А.В. МОИСЕЕНКО, научн. сотрудник Т.С. РУДЕНКО, мл. научн. сотрудник
А.А. НАЛБАНДЯН, канд. биолог. наук, ст. научн. сотрудник (e-mail: [email protected])
ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свёклы и сахара имени А.Л. Мазлумова»
Введение
Сахарная свёкла является важнейшей технической культурой для производства сахара. В мире в настоящее время она возделывает-ся на площади более чем 5 млн га, 25 % которой приходится на долю Российской Федерации. Для выполнения программы продовольственной безопасности страны первостепенной задачей становится увеличение продуктивности культуры.
Однако на растения сахарной свёклы сильное влияние оказывают биотические и абиотические стрессовые факторы. Абиотический стресс — основной ограничивающий фактор урожайности сельскохозяйственных культур. Засоление почвы представляется серьёзным препятствием для урожайности во многих областях земледелия [8, 12, 14]. Хотя сахарная свёкла — высокосолестойкая и засухоустойчивая сельскохозяйственная культура, стресс от соли и засухи вызывает потерю урожая и снижение роста. Следовательно, необходимо понимание механизмов ответа на абиотический стресс на молекулярном уровне для этой культуры. Сахарная свёкла может выдерживать концентрацию хлорида натрия в почве до 250 мМ,
что приводит к снижению урожайности на 50 %. По другим данным, она может выдерживать засоление до 500 мМ хлорида натрия (№С1) в течение 7 дней без потери жизнеспособности [15, 16]. Кроме того, система защиты от солевого стресса весьма эффективна: например, сообщается, что в ответ на 300 мМ растворы хлорида натрия свёкла подавляет образование активных форм кислорода путём регуляции транскрипции. Проблема, с которой сталкиваются производители, заключается в том, что сахарная свёкла чувствительна к солевому стрессу на стадии всходов, и поэтому получение ранней энергии для устойчивости к солевому стрессу является важной задачей [5, 7]. Засуха также представляет собой проблему во многих районах выращивания. Существует по крайней мере три локуса, описанных с помощью анализа локусов количественных признаков ^ТЦ), которые, как предполагается, важны для устойчивости к засухе, но до сих пор успехи в этом направлении очень ограничены. Сахарная свёкла более устойчива к абиотическому стрессу, чем большинство основных сельскохозяйственных культур, но при субоптимальной концентрации воды урожайность
резко снижается. Засухоустойчивых генотипов сахарной свёклы не выявлено, поэтому классическая селекция используется в недостаточном объёме. Стратегией создания засухоустойчивых сельскохозяйственных культур является трансформация с помощью генов, способных увеличивать содержание в клетках осмолитов или осмопротекторов (небольших гидрофильных молекул, которые растения и другие организмы накапливают в условиях засушливого стресса, чтобы избежать потери тургора) [2, 3, 17]. Солевой стресс может стать причиной обезвоживания клеток, что вызывает окислительный стресс за счёт увеличения производства активных форм кислорода (АФК) в растениях. Они могут играть сигнальные роли и вызывать структурные повреждения клеток. Чтобы преодолеть негативные последствия, жизненно важные функции в поддержании окислительно-восстановительного гомеостаза клеток выполняет система очистки растений от АФК. Перепроизводство АФК может привести к серьёзному повреждению белков, мембранных липидов, ДНК и других клеточных компонентов. Справиться с этой проблемой растениям
- 20 САХАР № 8 • 2023
ОНурналу «Сахар» - 100 мм!
помогают антиоксидантные механизмы, состоящие из ферментативных и неферментативных компонентов, регулирующих синтез и удаление АФК. Антиоксидантные ферменты, участвующие в обезвреживании АФК в растениях, в основном включают суперок-сиддисмутазу (СОД, КФ 1.15.1.1), аскорбатпероксидазу (АРХ, КФ 1.11.1.11), каталазу (КАТ, КФ 1.11.1.6), глутатионредуктазу (ГР, КФ 1.8.1.7) и тиоредоксин (Трх, КФ 1.8.1.9). Некоторые антиокси-дантные гены были клонированы из риса, арабидопсиса, кукурузы и сои, в то время как из солеу-стойчивой сахарной свёклы были получены только частичные последовательности кодирующей области гена пероксисомы АРХ и гена GOX. Однако имеется несколько сообщений о различной роли этих ферментов при солевом стрессе [6, 13].
В качестве биохимического показателя солевого стресса нами использован аскорбат-глутатио-новый цикл (Фойера-Холливела-Асада), в частности маркерный фермент данного цикла аскорбат-пероксидаза, а также глутатионре-дуктаза. Выбор данных ферментов обусловлен тем, что эти энзимы обезвреживают пероксид водорода, избыточно образующийся при солевом стрессе. При этом происходит восстановление пероксида водорода с использованием в качестве донора электронов аскорбиновой кислоты [10, 4].
Для ускорения селекционного процесса сахарной свёклы неотъемлемой частью является использование инновационных методов молекулярной генетики и биотехнологии, позволяющих создавать и подбирать перспективные родительские формы для гибридизации. Поэтому выявление и отбор на ранних этапах развития растений, несущих в своём геноме гены устойчивости к биотическому и
абиотическому стрессу — факторам окружающей среды, имеет особое значение при создании нового исходного материала.
Методика исследований
В качестве материалов для исследования влияния солевого стресса использовались следующие проростки сахарной свёклы: МС021002, О-тип ЛБО-17, ОП Льговка, выращенные при стандартных условиях температуры, освещённости и светового дня, в лабораторных условиях. Для эксперимента были выбраны следующие концентрации хлорида натрия (№С1): 150, 280, 500 мМ. Такой выбор обусловлен тем, что концентрации 150 и 280 мМ №С1 вызывают «солевой стресс», при котором происходит индукция ферментов аскорбат-глутатионо-вого цикла, а при концентрации 280 мМ наступает «солевой шок». Для лабораторных испытаний семена сахарной свёклы высевали в горшки диаметром 10 см, заполненные собранной в полевых условиях автоклавированной почвой (120 оС, 20 мин.), выращивали в теплице при 28/22 оС и продолжительности дня и ночи соответственно 16 и 8 ч. до стадии 3—4 листьев. Полив растений солевым раствором начинали, когда первая пара зрелых листьев полностью развилась. В течение первых 16 дней обработки растения поливали с двухдневными интервалами водопроводной водой с добавлением возрастающих концентраций №С1 до достижения конечной концентрации 500 мМ. Затем полив растений с добавлением 500 мМ №С1 продолжали в течение последующих 16 дней. Необработанные контрольные растения поливали водопроводной водой без добавок №С1. Растения поливали из расчёта 200 мл раствора на 2 л почвы. Растения, образовавшие вторую пару
настоящих листьев, отбирали для анализа. Было собрано 32 образца, представляющих три биологических повтора (три листа от трёх растений одного генотипа) единой экспериментальной установки, которая состояла из растений генотипов МС 021002, ОП Льговка, О-тип ЛБО-17. Активность аскорбатпероксидазы определяли по модифицированному методу, основанному на регистрации снижения оптической плотности раствора при окислении аскорбата. Для определения изоферментного состава аскорбатпероксидазы был проведён электрофорез в ПААГ по методу [1, 9]. Такое исследование необходимо для дифференциации генетически детерминированных и индуцибельных изоформ при солевом стрессе. Активность глу-татионредуктазы определяли по методу, основанному на восстановлении окисленного глутатио-на при участии НАДФН(Н+) при длине волны 340 нм [10].
Результаты исследований
Биохимический анализ генотипов сахарной свёклы в ответ на солевой стресс показал закономерное повышение активности фермента аскорбатпероксидазы на повышение концентрации №С1 в растворе до 150 мМ у всех тестируемых образцов (рис. 1).
Самый высокий прирост активности отмечен у сростноплодного опылителя ОП Льговской ОСС до 22,29 Е/г с. м. Далее, при повышении концентрации раствора №С1 со 150 до 280 мМ наблюдается незначительное понижение активности аскорбатпероксидазы у МС-формы 021002 18,69-15,84 и О-типа ЛБО-17 11,2-9,83, а также увеличение активности у ОП Льговка - 22,29-31,1. При увеличении концентрации №С1 до 500 мМ происходит уменьшение активности у всех исследуемых образцов. Тем не менее даже
№ 8 • 2023 САХАР 21
ОКуршиу «Сахар» - 100 мм!
¡5
О
\ ■о"
0 а
1 §
I
2
Сравнение удельной активности аскорбатпероксидазы
35 -31,1
30
22,29
25 20 15 10
8,45
18,69
15,84
К 150 мМ 280мМ
Концентрация ^О
26,4
19,83 1218,91
И I'
500мМ
■ МС 021002 ■ О-тип ЛБО-17 ■ ОП Льговка
Рис. 1. Удельная активность аскорбатпероксидазы при действии солевого стресса
МС 021002
О-тип ЛБО-17
ОПЛьговка
150 280 500 4 4 4
Рис. 2. Изоферментный состав аскорбатпероксидазы в листьях сахарной свёклы в условиях солевого стресса. Р1, Р2, Р3 — изоформы аскорбатпероксидазы, F — фронт красителя
при концентрации раствора №С1 500 мМ, которая является шоковой для растений сахарной свёклы, значение активности исследуемого фермента всё равно выше 8,91— 26,4 Е/г с. м., чем в контроле у всех изученных образцов. В результате проведённого электрофореза в по-лиакриламидном геле определены генетически детерминированные ииндуцибельные изоформы АПО при солевом стрессе. Установлено, что в контрольных образцах АПО представлена в виде двух изоформ. По имеющимся данным, это хлоропластные формы фермента. По литературным данным, хлоропласты имеют две изоформы АПО: тилакоид-связанные и стро-мальные [11]. Значения электро-форетической подвижности Щ этих изоформ составляют 0,65 и 0,75. Однако в условиях солевого стресса происходит индукция дополнительной изоформы, которая может быть вовлечена в детокси-кацию Н202 (рис. 2). Предположительно это цитозольная изо-форма с Щ 0,71. Данная изоформа с Щ 0,71 проявилась у растений линии МС021002, подвергавшихся воздействию №С1 в концентрациях 150, 280 и 500 мМ. У растений закрепителя стерильности О-типа ЛБО-17 были обнаружены лишь две хлоропластные изофор-мы, индуцибельных проявлено не было. У растений сростноплодно-го опылителя ОП Льговка помимо хлоропластных изоформ были обнаружены индуцибельные-цито-зольные изоформы, которые проявились во всех образцах, кроме контрольного варианта.
Результаты электрофоретиче-ского исследования коррелируют с данными по измерению активности АПО. Активность аскорбат-пероксидазы выше у растений линий МС021002 и ОП Льговка, чем у ЛБО-17.
Изучение активности глутати-онредуктазы выявило увеличение
активности данного фермента у всех генотипов: от 0,47 до 0,86 у МС 021002; от 0,21 до 0,49 у О-типа ЛБО-17; от 0,52 до 0,74 у ОП Льговка при повышении концентрации №С1 (рис. 3).
В аскорбат-глутатионовом цикле (Фойера-Холливела-Асада) (рис. 4) происходит детоксикация пероксида водорода за счёт действия аскорбиновой кислоты и
глутатиона как восстанавливающих субстратов. Нами были изучены два фермента этого цикла: аскорбатпероксидаза и глутати-онредуктаза. Установлено, что при высоких концентрациях №С1 наблюдается индукция дополнительной изоформы аскорбатпе-роксидазы, это может являться частью адаптивного ответа при засолении. Отмечалось также увели-
22 САХАР № 8 • 2023
ОНурналу «Сахар» - 100 мм!
чение активности глутатионредук-тазы при засолении.
Следующим шагом в изучении аскорбат-глутатионового цикла станет изучение DHAR-дегидроаскорбатредуктазы как фермента, связывающего между собой окисление глутатиона и аскорбиновой кислоты.
Заключение
В результате проведённых экспериментов установлено увеличение активности аскорбатперокси-
дазы и глутатионредуктазы у всех изученных генотипов сахарной свёклы, находящихся в условиях повышенных концентраций NaQ. При засолении наблюдается индукция дополнительной изофор-мы аскорбатпероксидазы. Предположительно это цитозольная изоформа с электрофоретической подвижностью Щ 0,71, которая может быть вовлечена в детокси-кацию перекиси водорода Н202 и являться частью адаптивного ответа при солевом стрессе.
Сравнение удельной активности глутатионредуктазы
0,86
0,74
МС 021002
0,47 0,52
0,61
0,68
150 мМ
280мМ
Концентрация NaCl ■ О-тип ЛБО-17
0,49
500 мМ
ОП Льговка
Рис. 3. Удельная активность глутатионредуктазы при солевом стрессе
Рис. 4. Цикл Фойера-Холливела-Асада. Ферменты и промежуточные продукты цикла (цикл ASC-GSH). Ферменты: APX — аскорбатпероксидаза, GR — глутатионредуктаза, DHAR — дегидроаскорбатредуктаза, MDHAR — монодегидроаскорбатредуктаза; ASC — аскорбиновая кислота, DHA — дегидроаскорбиновая кислота, GSH — глутатион, GSSH — окисленный глутатион
Список литературы
1. Гены устойчивости к засолению у сахарной свёклы / Т.П. Фе-дулова, Т.С. Руденко, А.А. Налбан-дян, А.В. Моисеенко // Аграрный научный журнал. — 2023. — № 1. — С. 64-70. URL: http://10.28983/asj. y2023i1pp64-70 (дата обращения: 07.06.2023).
2. Physiological and Transcrip-tome Analysis of Sugar Beet Reveals Different Mechanisms of Response to Neutral Salt and Alka-line Salt Stresses / G. Geng, R. Li, P. Stevana-to, Zh. Lu [et al.] // Salt Tolerance: Molecular and Physiological Mechanisms and Breeding Applications, Sec. Plant Abiotic Stress. 2020. -№ 11. - Р. 1-15.
3. Transcriptome and Metabolome Analyses Revealed the Response Mechanism of Sugar Beet to Salt Stress of Different Durations / J. Cui, J. Li, C. Dai, L. Li // International Journal of Molecular Sciences. - 2022. - № 23 (17). - Р. 9599. URL: https://doi.org/10.3390/ ijms23179599 (дата обращения: 10.06.2023).
4. Foyer, C. The presence of glu-tathione and glutathione reductase in chloroplasts: a proposed role in ascorbic acid metabolism / C. Foyer, B. Holliwell // Planta. - 1976. -№ 13. - Р. 21-25.
5. Redox and Reactive Oxygen Species Network in Acclimation for Salinity Tolerance in Sugar Beet / M. Hos-sain, A. El Sayed, M. Moore, K.J. Di-etz // J. Exp. Bot. - 2017. - № 68. -Р. 1283-1298. DOI: 10.1093/jxb/ erx019
6. Functional Characterization of Sugar Beet M14 Antioxidant Enzymes in Plant Salt Stress Tolerance / J. Li, B. Yu, C. Ma [et al.] // Antioxidants. - 2023. - № 12 (1). - Р. 57. doi: 10.3390/antiox12010057.
7. Maruta, T. Ascorbate Perox-idase Functions in Higher Plants: The Control of the Balance Between Oxidative Damage and Signaling / T. Maruta // Springer Internation-
№ 8 • 2023 САХАР 23 -
Журналу «Сахар» - 100 мм!
al Publishing. Cham. - 2018. -P. 41-59. DOI: 10.1007/978-3-319-75088-0_3.
8. Mulet, J. Sugar Beet Cultivation, Management and Processing. Shaping the Sugar Beet of Tomorrow: Current Advances in Sugar Beet Biotechnology and New Breeding Techniques / J. Mulet. — Germany, 2022. - P. 49-74.
9. Mittler, R. Detection of ascorbate peroxidase activity in native gels by inhibition of the ascorbate-dependent reduction of nitroblue tetrazolium / R. Mittler, B.A. Zilinskas // Anal Bi-ochem. - 1993. - № 212. - P. 540.
10. Nagalakshmi, N. Responses of glutathione cycle enzymes and glutathione metabolism to copper stress in Scenedesmus bijuga-tus / N. Nagalakshmi, M. Prasad // Plant Sei. - 2001. - № 160. -P. 291-299. DOI: 10.1016/s0168-9452(00)00392-7.
11. Nakano, Y. Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate peroxidase in spinach chloroplasts / Y. Nakano, K. Asada // Plant Cell Physiol. -1981. - № 22. - P. 867-880.
12. Pandey, S. Abiotic Stress Tolerance In Plants: Myriad roles of Ascorbate Peroxidase / S. Pandey // Front. Plant Sci. - 2017. - № 8. -P. 581. https://doi.org/10.3389/ fpls.2017.00581.
13. Rajput, V. Recent Developments in Enzymatic Antioxidant Defence Mechanism in Plants with Special Reference to Abiotic Stress / V. Rajput, R. Singh, K. Verma [et al.] // Biology. - 2021. - № 10. -P. 267. https://doi.org/ 10.3390/biol-ogy10040267.
14. Skorupa, M. Salt stress vs. salt shock - the case of sugar beet and its halophytic ancestor / M. Skorupa, M. Gol^biewski, K. Kurnik [et al.] // BMC Plant Biology. - 2019. -№ 19. - P. 57.
15. Hesadi, P. Selection for Drought Tolerance in Sugar Beet Geno-
types (Beta vulgaris L.) / P. Hesadi, D. Fathollah Taleghani, A. Shirani-rad [et al.] // Biol Forum. - 2015. -№ 7. - P. 1189-1204.
16. Wang, Y. The physiological and metabolic changes in sugar beet seedlings under different levels of salt stress / Y. Wang, P. Stevana-to, L. Yu [et al.] // J. Plant Res. -
2017. - № 130 (6). - P. 1079-1093. DOI: 10.1007/s10265-017-0964-y.
17. Yang, L. Salt stress induced proteome and transcriptome changes in sugar beet monosomic addition line M14 / L. Yang, C. Ma, L. Wang [et al.] // J. Plant Physiol. - 2012. -№ 169. - P. 839-850. DOI: 10.1016/j. jplph.2012.01.023
Аннотация. Цель исследований - изучение активности аскорбатпероксидазы (КФ 1.11.1.11) и глутатионредуктазы (КФ 1.8.1.7) у генотипов сахарной свёклы в условиях солевого стресса. В качестве материалов для исследования влияния данного абиотического фактора использовались следующие образцы сахарной свёклы: МС021002, О-тип ЛБО-17, ОП Льговка. Самый высокий прирост активности отмечен у сростноплодного опылителя ОП Льговской ОСС до 22,29 Е/г с. м. При повышении концентрации раствора NaCl со 150 до 280 мМ наблюдается незначительное понижение активности аскорбатпероксидазы у МС-формы 021002 с 18,69 до 15,84 и О-типа ЛБО-17 с 11,2 до 9,83; увеличение активности у ОП Льговка с 22,29 до 31,1. При повышении концентрации NaCl до 500 мМ происходит увеличение активности у всех исследуемых образцов. При концентрации раствора NaCl 500 мМ, шоковой для растений сахарной свёклы, значение активности исследуемого фермента выше по сравнению с контролем у всех изученных образцов. В результате проведённого электрофореза в полиакриламидном геле определены генетически детерминированные индуцибельные изоформы аскорбатпероксидазы при солевом стрессе. Установлено, что в контрольных образцах аскорбатпероксидаза представлена в виде двух изоформ. При засолении наблюдается индукция дополнительной изоформы аскорбатпероксидазы. Предположительно это цитозольная изоформа с электрофоретической подвижностью Rf 0,71, которая может быть вовлечена в детоксикацию перекиси водорода H2O2 и являться частью адаптивного ответа при солевом стрессе. По степени выраженности активности ферментов аскорбатпероксидазы и глутатионредуктазы можно отбирать генотпы сахарной свёклы с повышенной устойчивостью к засолению.
Ключевые слова: сахарная свёкла, спектрофотометрия, изоформа, аскорбатпероксидаза, глутатионредуктаза.
Summary. Aim of the investigations is to study activity of ascorbate peroxidase (EC 1.11.1.11) and glutathione reductase (EC 1.8.1.7) in sugar beet genotypes under conditions of salt stress. As materials for the study of this abiotic factor influence, the following sugar beet samples have been used: MS021002, O-type LBO-17, and OP Lgovka. The greatest activity increase, up to 22.29 U/g of row mass, has been noted in multigerm pollinator OP of Lgovskaya OSS. When concentration of NaCl in solution increases from 150mM to 280 mM, insignificant decline of ascorbate peroxidase activity in the MS-form No.021002 (from 18.69 to 15.84) and O-type LBO-17 (from 11.2 to 9.83) is observed, and increase of its activity in OP Lgovka (from 22.29 to 31.1) is registered. With increase of NaCl concentration up to 500 mm, the activity falls in all the samples investigated. With NaCl concentration in solution being 500mM (shock for sugar beet plants), value of the studied enzyme activity is more, in comparison with the control, in all studied samples. As a result of polyacrylamide gel electrophoresis, genetically determined induced isoforms of ascorbate peroxidase under salt stress conditions have been revealed. It has been determined that, in control samples, APO is presented as two isoforms. On salinization, induction of the ascorbate peroxidase additional isoform is observed. Hypothetically, it is a cytosolic isoform with electrophoretic mobility Rf of 0.71 which can be involved in detoxification of hydrogen dioxide (H2O2) and is a part of the adaptive answer to salt stress. Sugar beet genotypes with great resistance to salinization can be selected by an expression degree of activity of the ascorbate peroxidase and glutathione reductase enzymes.
Keywords: sugar beet, spectrophotometry, isoform, ascorbate peroxidase, glutathione reductase.
- 24 САХАР № 8 • 2023
Журналу «Сахар» - 100 мм!
