CC BY
20
Изоляция, маркировка и in vivo визуализация CD4+ Т-лимфоцитов на модели реперфузионного повреждения печени в экспериментальных условиях
Э.А.Искандаров, Д.Розентретер, А.Хандога
Научный Центр Хирургии имени академика М.А.Топчибашева, г.Баку.
Университетская Клиника Гроссхадерн, г.Мюнхен
Реперфузионный синдром является одним из основных причин неблагоприятных результатов трансплантации печени и представляет собой сложный комплекс нарушений, возникающих в результате восстановления кровотока в раннее ишемизированной ткани. Патогенез реперфузи-онных расстройств в пересаженной печени имеет многокомпонентный характер. Важнейшая роль принадлежит синтезу биологически активных веществ и массивному поступлению их в системный кровоток, характерных для воспалительного процесса [1, 2, 3, 4]. Микроциркуляторные нарушения, также являются одним из ключевых факторов при изучаемой патологии, так как именно после восстановления кровообращения начинается порочный круг разных патологических процессов. Клетки крови, такие как тромбоциты, нейтрофилы, гранулоциты а также Т-лимфоциты накапливаясь в капиллярах сопутствуют нарушению синусоидальной перфузии, что приводит к гипоксии, лизису клеток и избыточной выработки медиаторов воспаления [5, 6].
Учитывая выраженные микроциркуляторные нарушения и исходя из взаимосвязи иммунных реакций и функций Т-лимфоцитов, представляется интерес изучения роли накопления CD4+ типов в печени [7, 8, 9]. Применение фармакологических препаратов для профилактики отторжения трансплантированной печени и соблюдения равновесия в иммунной системе организма является актуальной проблемой трансплантологии.
Цель работы: Идентифицировать роль Т-кле-ток в развитии нарушений синусоидальной перфузии, а также изучить эффективность препарата ALR (Augmenter Liver Régénération) против ре-перфузионного повреждения.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Исследования проводились на мышах типа C57BL/6, весом 18-25 грам, в экспериментальных условиях, соблюдая кодексы законодательства Германии по охране подопытных животных. Для каждой серии экспериментов понадобились 2 мыши. Селезенку первой мыши изымали и ис-
пользовали как материал для изоляции Т-клеток.
Первым этапом явилось изоляция клеток. Селезенку помещали в стеклянный сосуд наполненный буфер раствором, раздавливая специальным поршенем, получали клеточный состав розового цвета. Состав разливался в другую пробирку через фильтр - пресепа-ратор, для удаления кусочков ткани селезенки. Пересчитывая клетки в аппарате Coulter, добавляли специфические магнетизированные антитела к CD4+ клеткам, которые способны прилепиться именно к этим типам лимфоцитов. После инкубации и центрифугирования, перфузат переливали в специальный MACS шприц, установленный на магнитной стойке. Во время прохождения через шприц магнетизированные антитела с CD4+ клетками застревали в фильтре, тогда как все другие клетки медленно истекались. Промывая MACS шприц буфер раствором получали коллоидный раствор желтого цвета с изолированными CD4+ Т-клетками.
Одномоментно у второй мыши под ингаляционным наркозом со смесью кислорода 30%, N2O - 68,5% и 1,5% изофлюрана (Forene; Abbott, Wiesbaden, Germany), проводилась катетеризация (внутренний диаметр - 0,28mm; Portex, Hythe, Англия) левой сонной артерии с целью регистрации сдвигов в центральной гемодинамике и для введения ALR.
Вторым этапом была маркировка Т-клеток. С этой целью использовали краску CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl ester), которая была разработана именно для окрашивания Т-лимфоцитов. Краска CFSE имеет способность проникать в Т-клетки, что создает возможность в течении нескольких месяцев наблюдать за ними и не перекрашивая другие клетки крови прилипшие к Т-клеткам. После подсчитывания клеток, добавляли краску с расчета 2 fl на 107 количество Т-клеток. Помещали тюбик в сухой лед и 10 минут держали в темноте. После центрифугирования полученную жидкость набирали в шприц и ждали момента аппликации.
Подопытных животных подразделили на 3 группы, по 6 особей в каждом. В первой основной группе брюшная полость открывалась срединным разрезом и, накладывая маленький сосудистый клип на ножку большой правой доли печени, создавали модель лобар-ной теплой ишемии. После 90 минут ишемии, до начало реперфузии 100 ¡ig ALR вводился в организм жи-
вотного, после чего начиналась 60 минутная реперфу-зия. На 50 - ой минуте вводили уже готовый раствор с окрашенными Т-клетками.
Препарат ALR является экстрактом из печени новорожденных крысят, которое после 830 000-кратной очистки было названо усилителем регенерации печени (augmenter of liver regeneration - ALR). Исследования проводимые in vitro показали, что ALR как специфический протеин важен для функционирования гепатоцитов, способный повлиять на основные ферментные системы оксидативного стресса.
Вторая группа была как контрольная, где все манипуляции проводились как в основном, за исключением того, что вместо ALR вводили теплый физиологический раствор того же объема. Третья группа была Sham - где вся процедура заканчивалось открытием и закрытием брюшной полости, с перерывом несколько секунд.
После 40-45 минут с момента начала реперфу-зии, применяя эффект иллюминации методом интра-витальной флюросцентной микроскопии, изучали микроциркуляцию печени. Микроскопия проводилась в темноте. Полученные изображения с помощью CCD video камеры передавались в видеосистему, где все записывалось на ленту. Изучали кровообращение в синусоидах на нескольких участках поверхности печени и отток крови от них к центрально расположенным печеночным венам. Для выявления степени тяжести реперфузионного повреждения, изучали интенсивность синусоидальной перфузии в 5-7 ацинусах и производили online наблюдение крашеных Т-клеток. Все изображения, фиксированные на ленте, обрабатывались специальной компьютерной программой (CAPIMAGE; Dr Zeintl, Heidelberg, Германия) и производилась статистическая обработка полученных результатов. Вычисляли общее число синусоидов в наблюдаемом ацинусе и количество синусоидов, в которых не идет перфузия. Недостаточность синусоидальной перфузии вычисляли по формуле:
Процент неперфузируемых синусоидов = непер-фузируемые синусоиды / общее количество синусодов в одном ацинусе Х100%.
Интравитальная микроскопия продолжалась 2030 минут, после чего брали кров из сердца для биохимического анализа и куски печеночной ткани для гис-томорфологического исследования. Стандартные ферменты (АЛТ, АСТ, ЩФ, у-ГГТ) и количество общего билирубина измеряли на биохимическом анализаторе. Изменения в структуре органа изучали под световым микроскопом в лаборатории той же клиники.
Статистическая обработка данных производилась с помощью параметрических (Стюдент) и непа-раметричеких (Манна-Уитни) методов. При р<0,05 разница между группами считалась достоверной.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. Интравитальная микроскопия является самым современным и информативным методом исследования печеночной микроциркуляции. Первичные обзоры показали грубые нарушения в кровообраще-
ние органа в фазе реперфузии как в основной, так и в контрольной группе. В контрольной группе после 60 - и минутной реперфузии соотношение неперфузированных синусоидов был 32.9±4.5%, тогда как после 240 минутной реперфузии этот процент был 29.3±0.4%. В группе ALR процент неперфузированных синусоидов было достоверно меньше как после 60 (21.5±4.5%), так и после 240 минут (18.2±1.6%) с начала реперфузии.
При микроскопии CD4+ Т-клетки в мониторе видны как большие круглые светящиеся точки. В контрольной группе было заметное увеличение количество неподвижных Т-клеток, наблюдалось аккумуляция этих клеток к внутренней стенки терминальной артериолы с последующим понижением интенсивности кровотока в бассейне этого сосуда. Неподвижными Т-клетками принято считать те клетки, которые пересекают воображаемую перпендикулярную ось сосуда и скорость вращения которых ниже скорости тока крови. Клетки, цепко прилипшие к стенке сосуда в течении 20-ти секунд обозначали как адгерент-ные и число их вычисляли по количеству клеток, прилипавших на 1 мм2 эндотельного покрытия. Неподвижные клетки в синусоидах подсчитывали и обозначали как n CD4+ Т-клетки/ацинус. В контрольной группе число неподвижных CD4+ Т-клеток в одном ацинусе был равен 9.2±0.7. Применение ALR существенно повлиял на миграцию Т-клеток, в связи с чем число неподвижных CD4+ Т-клеток в одном ацинусе снизился примерно на 70% и насчитывался 0.8±01/ацинус.
Биохимический анализ крови в контрольной группе показал высокие цифры подъёма активности АСТ и АЛТ (3938±610 и 1615±457 U/L соответственно) по сравнению с группой Sham. В группе, где применяли ALR, в крови мышей 60 минут после начала реперфузии активность ферментов было 2-2,5 раза меньше, а на показателях после 240 минутной ишемии наблюдалось отчетливое снижение активности, а различие между результатами в группах сравнения было статистически достоверным (p<0,001).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Исходя из результатов, с уверенностью можно сказать что CD4+ Т-лимфо-циты играют важную рол в патогенезе реперфу-зионного повреждения. В первые 30 минут после восстановления кровотока, наблюдался значительная аккумуляция CD4+ Т-клеток в микрокапиллярах, что непосредственно после скопления и других кровяных клеток создавая сладж, воспрепятствует нормальной перфузии. Применение ALR препятствует скоплению и прилипанию к сосудистой стенки CD4+ Т-клеток, увеличивая
скорость миграции клеток, улучшает микроциркуляцию, и тем самым уменьшает агрессивность реперфузионного повреждения. Механизм этого объясняется, способностью ALR блокировать свободные радикалы, которые служат спусковым механизмом для избыточного высвобождения Т-клеток.
ЛИТЕРАТУРА
1. Lock J., Schwabauer E., Martus P. et al Early Diagnosis of Primary Nonfunction and Indication for Reoperation After Liver Transplantation // Liver Transplantation, 2010, Vol 16, p.172-180.
2. Ramsay M. The Reperfusion Syndrome: Have We Made Any Progress? // Liver transplantation, 2008, Vol.14, p.412-414.
3. Kelly D., Shiba H., Nakagawa Sh. et al. Hepatic Blood Flow Plays an Important Role in Ischemia-Reperfusion Injury // Liver Transplantation, 2011, Vol. 17, p.1448-1456.
4. Cursio R., Gugenheim J. Ischemia-Reperfusion Injury and Ischemic-Type Biliary Lesions following Liver Transplantation // Journal of Transplantation Volume 2012, Article ID 164329, 17 pages.
5. Khandoga A., Huettinger S, Khandoga AG. et al. Leukocyte transmigration in inflamed liver: A role for endothelial cell-selective adhesion molecule // Journal Hepatology, 2009, Apr;50(4): p. 755765.
6. Vollmar B., Menger MD. The hepatic microcirculation: mechanistic contributions and therapeutic targets in liver injury and repair // Physiol Rev., 2009, Oct;89(4). p.1269-1339.
7. Zhang Y, Ji H., Shen X. et al. Targeting TIM-1 on CD4 T cells depresses macrophage activation and overcomes ischemia-reperfu-sion injury in mouse orthotopic liver transplantation // Am. J. Transplant., 2013, v.13(1):p.56-66.
8. Uchida Y, Ke B., Freitas MC. et al. The emerging role of T cell immunoglobulin mucin-1 in the mechanism of liver ischemia and reperfusion injury in the mouse // Hepatology, 2010, Apr;51(4):p.1363-1372.
9. Hanschen M, Zahler S, Krombach F. et al. Reciprocal activation between CD4+ T cells and Kupffer cells during hepatic ischemia-reperfusion // Transplantation, 2008, Sep 15;86(5):p. 710-718.
SUMMARY
Isolation, labelling and in vivo visualization of CD4+ T-cells on the experimental model of reperfusion injury
E.Iskandarov, D.Rosentreter, A.Khandoga
Scientific Center of Surgery named after
M.A. Topchubashov, Baku;
University Hospital Grosshadern, Munich
Hepatic ischemia-reperfusion injury is the most common cause for organ dysfunction and failure after liver transplantation. The aims of this research were to evaluate the role of T-cell in reperfusion injury and test the hypothesis that ALR exerts a protective effect on hepatic injury in vivo. Plasma activity of the enzymes ALT and AST was used as a parameter of liver necrosis. Hepatic microcirculato-ry perfusion failure is a determinant of liver dysfunction. CD4+ T-cells have been shown to play a critical role during hepatic reperfusion injury. They accumulate rapidly (30 min of reperfusion) in hepatic sinusoids, are able to activate platelets intravascular and can influence Kupffer cell functions. The protective effect of ALR was mostly pronounced after 4h of reperfusion. We can say, that the antiox-idative effect of ALR is responsible for the attenuation of CD4+ T-cell recruitment in the hepatic microvessels. In conclusion, our in vivo data show that ALR has a therapeutic potential against postis-chemic liver injury.
Поступила 04.04.2014
