CC BY
115
УДК 663.951:542.943-032.1
ИЗМЕРЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ФЕНОЛОВ В ЭКСТРАКТАХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ТРАВ И ИХ СМЕСЯХ АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
© В.М. Мисин1, Н.Н. Сажина1, А.Ю. Завьялов1, Я.И. Яшин2
1 Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, ул. Косыгина, 4,
Москва, 119334 (Россия) E-mail: misin@sky.chph.ras.ru
2НПО «Химавтоматика», ул. Сельскохозяйственная, 12а, Москва, 129226
(Россия) E-mail: yashinchrom@mail.ru
Амперометрическим методом измерено суммарное содержание природных фенолов в экстрактах лекарственных трав: зверобое (Hypericum perforatum L.), мяте (Mentha piperita L.), мелиссе (Melissa officinalis L.), ромашке (Matrikaria regulita L.) и тысячелистнике (Achillea millefolium L.). Изучены зависимости суммарного содержания фенолов в экстрактах от времени экстрагирования водой и этиловым спиртом, температуры экстрагирования и исходного содержания сухих трав в экстрагирующей системе. Обнаружено отклонение экспериментально полученных величин содержания фенолов в бинарных смесях экстрактов некоторых трав от величин, рассчитанных исходя из принципа аддитивности содержания фенолов в отдельных экстрактах.
Ключевые слова: антиоксиданты, фенолы, лекарственные травы, амперометрический метод.
Введение
В настоящее время большое внимание уделяется изучению содержания антиоксидантов в лекарственных растениях, пищевых продуктах, напитках, БАДах и других объектах. Известно, что увеличение активности процессов свободнорадикального окисления в организме приводит к нарушению структуры и свойств липидных мембран. Вследствие этого возникает прямая связь между избыточным содержанием свободных радикалов в организме и возникновением опасных заболеваний [1]. Антиоксиданты относятся к классу биологически активных веществ, которые связывают излишние свободные радикалы, препятствуют ускоренному окислению липидов и образованию нежелательных продуктов окисления. Поэтому измерение содержания антиоксидантов в различных продуктах питания и лекарственных травах представляет несомненный практический интерес.
Лекарственные растения содержат сложный комплекс химических соединений, оказывающих различное и многостороннее действие на организм человека. Значительное количество природных антиоксидантов фенольного класса, входящих в состав лекарственных трав, образуется вследствие метаболизма растений [2]. Такие соединения фенольного класса являются эффективными ингибиторами цепных свободнорадикальных процессов, происходящих в жидкой фазе.
На сегодняшний день имеются публикации, посвященные исследованию содержания и активности фенольных антиоксидантов в лекарственных травах, например [3-11]. В них различными методами проанализированы антиоксидантные свойства экстрактов некоторых трав: шалфея, эхинацеи, мелиссы, зверобоя и др. Однако эти методы достаточно сложны и трудоемки, а полученные по разным методам результаты плохо сопоставимы между собой, в том числе и из-за отсутствия единых единиц измерения. Кроме того, нет публикаций, посвященных изучению величин суммарного содержания фенольных соединений в смесях экс-
* Автор, с которым следует вести переписку.
трактов различных растений. Подобные исследования могли бы обнаружить и оценить возможное влияние природных фенолов антиоксидантного действия из различных экстрактов друг на друга, так как известно, что антиоксиданты фенольного типа могут проявлять эффекты синергизма и антагонизма [12], усиливая или ослабляя тем самым свое действие.
Цель настоящей работы - определение суммарного содержания природных фенолов антиоксидантного действия в смесях экстрактов некоторых распространенных лекарственных растений с помощью амперометрического метода для обнаружения возможного взаимного влияния компонентов экстрактов растений. Предварительно было измерено суммарное содержание фенолов в индивидуальных экстрактах этих растений, а также исследована зависимость суммарного содержания фенолов от условий экстрагирования.
Известно, что природные фенолы не являются достаточно стабильными соединениями. Поэтому использование оперативного амперометрического метода [13, 14] позволило изучить динамику процесса экстракции фенолов из растений, в особенности в начальный период экстракции (минуты), а также оперативно сравнивать суммарное содержание фенольных соединений в свежеприготовленных экстрактах растений и в их смесях. Другие достаточно широко применяемые методы измерений малопригодны для таких целей, так как трудоемки и не оперативны. За время подготовки и хранения образцов, а также за время проведения измерений могут появляться значительные ошибки, связанные с нестабильностью природных фенолов, в частности с их окислением.
Экспериментальная часть
Объектами исследования являлись водные и спиртовые экстракты следующих широко распространенных лекарственных трав: зверобоя (Hypericum perforatum L.), мяты (Mentha piperita L.), мелиссы (Melissa officinalis L.), ромашки (Matrikaria regulita L.) и тысячелистника (Achillea millefolium L.), собранных в 2007 г. в Западнодвинском районе Тверской области, а затем высушенных. Для проведения исследований высушенные травы измельчали в ступке до размера частиц 1-2 мм. В имеющихся рекомендациях [15, 16] по получению экстрактов из лекарственных трав приводятся различные условия экстрагирования (экстрагирующий агент, время, температура) комплекса биологически активных соединений. Это не позволяло выбрать наиболее оптимальные условия для специфической экстракции изучаемых природных фенолов антиоксидантного действия. Поэтому для сравнения эффективности различных способов экстракции проводили экстракцию трав дистиллированной водой с температурой от 20 до 95 °С без термостатирования и 70% этиловым спиртом комнатной температуры. Время экстрагирования изменяли в интервале Н60 мин. Экстракты тщательно отфильтровывали через бумажный фильтр «синяя лента» и при необходимости разбавляли. При измерениях суммарного содержания фенольных соединений в экстрактах учитывалась влажность исходной травы. Для этого она определялась для каждой травы и затем вносилась поправка в результаты измерений суммарного содержания фенолов.
В настоящей работе использовали оперативный амперометрический метод определения суммарного содержания антиоксидантов фенольного типа [13, 14] в исследуемых образцах. Измерения проводили на приборе «Цвет Яуза-01-АА» разработки НПО «Химавтоматика». Сущность данного метода заключается в измерении электрического тока, возникающего при окислении исследуемого вещества (или смеси веществ) на поверхности рабочего электрода при определенном потенциале. При этом потенциале происходит окисление только групп -ОН природных антиоксидантов фенольного типа. Предварительно строили градуировочную зависимость сигнала образца сравнения (кверцетина) от его концентрации и с помощью полученной градуировки рассчитывали содержание фенолов в исследуемых образцах в единицах концентрации кверце-тина. Погрешность измерения (относительное среднеквадратичное отклонение) суммарного содержания фенолов составила не более 5% [14]. Метод не требует использования модельной реакции, а время измерения одного образца составляет 10-15 мин при наличии градуировочной прямой.
Результаты и обсуждение
В предварительных экспериментах было обнаружено, что наибольшее количество природных фенолов антиоксидантного действия присутствует в зверобое и мяте. Поэтому динамику процессов экстракции исследовали с применением этих трав.
На рисунках 1 и 2 представлены зависимости суммарного содержания фенолов С (в мг на г сухой травы) относительно образца сравнения (кверцетина) от времени экстрагирования водой (исходная температура Т=95 °С, без термостатирования) и спиртом (20 °С) на примере двух трав: зверобоя (рис. 1) и мяты (рис. 2). Образцы готовили из расчета: 10 г травы на 1 л воды. Видно, что содержание антиоксидантов в значительной степени зависит от времени экстрагирования. Это особенно отчетливо проявляется у мяты при экстрагировании ее водой. При экстрагировании трав спиртом наблюдали увеличение содержания фенолов в экстрактах с увеличением времени экстрагирования. Максимальное содержание фенолов достигалось при времени экстрагирования 40-50 мин. В случае воды максимум отмечается в течение первых 10 мин, а далее идет постепенное уменьшение содержания антиоксидантов с выходом на постоянное значение. Этот факт объясняется, по-видимому, неустойчивостью фенольных соединений в полученных экстрактах. Подобные зависимости были получены в работе [17] при изучении зависимости содержания фенолов в чае от времени его заварки. Для исследованных трав экстрагирование водой в течение от 1 до 30 мин происходило более эффективно, чем спиртом, поэтому в дальнейшем большинство экспериментов было проведено с водными экстрактами.
На рисунке 3 приведена зависимость суммарного содержания фенолов С в водных экстрактах зверобоя (кривая 1) и мяты (кривая 2) от температуры экстрагирующей воды Т, которой заливали траву, без термостатирования. Время экстракции 10 мин, количество травы в экстрагирующей жидкости 10 г/л. Наблюдается достаточно сильная зависимость содержания фенолов от этой температуры. Полученные результаты показывают, что для наилучшего извлечения фенолов из трав необходимо заливать их водой при максимально высокой температуре.
Аналогичные измерения были проведены в работе [11], в которой методом FRAP определена антиоксидантная активность (в терминах авторов [11]) экстрактов мелиссы для двух значений температуры экстракции - 20 и 98 °С. На самом деле по методике [11] находили не антиоксидантную активность, а суммарное содержание фенолов, способных восстанавливать Fe3+ до Fe2+. Кроме того, в работе [11] определяли содержание фенолов в этих же экстрактах по методу [18]. С применением обеих методик был обнаружен рост измеряемой величины суммарного содержания фенолов в 2,5-3,0 раза, что хорошо совпадает с результатами, полученными в данной работе.
В настоящей работе была также изучена зависимость суммарного содержания фенолов в водных экстрактах зверобоя и мяты от массы навески травы m при одинаковом объеме экстрагирующей воды V с начальной температурой экстрагирования Т=95 °С и временем экстракции 10 мин (условия выбраны из предыдущих экспериментов). Полученная зависимость представлена на рисунке 4. Видно, что ярко выраженные максимальные значения суммарного содержания экстрагированных фенолов С для указанных трав достигаются при m/V = 5-8 мг/л, а далее резко уменьшаются. Это, по-видимому, объясняется перенасыщением фенолов в водных экстрактах при увеличении навески травы и ухудшением условий экстрагирования.
с, мг/г
35
30
25
20
15
10
-> 1 А
7
t.MHH
20
15
10
ЙгМГ/Г
1 ^
■ /X —^ ;—' ^ ~2
/ ;*х/
t, мин 1
10
20
30
40
50
10
20
30
40
50
Рис. 1. Зависимость суммарного содержания фенолов С в мг/г от времени экстрагирования 1 зверобоя спиртом (1) и водой (2)
Рис. 2. Зависимость суммарного содержания фенолов С от времени экстрагирования 1 мяты спиртом (1) и водой (2)
Рис. 3. Суммарное содержание фенолов С в водных Рис. 4. Зависимость суммарного содержания
экстрактах зверобоя (кривая 1) и мяты (кривая 2) в фенолов С от количества травы m в 1 л
зависимости от температуры воды Т экстрагирующей воды: зверобой (1), мята (2)
Для выяснения возможного взаимного влияния компонентов экстрактов различных лечебных растений было определено суммарное содержание фенольных соединений в их бинарных смесях. Используя приведенные выше результаты, были подготовлены свежие водные экстракты этих трав. Для этого 1 г каждой из трав заливали 100 мл дистиллированной воды с температурой 95 °С. После экстрагирования трав в течение 30 мин экстракты тщательно отфильтровывали через бумажный фильтр «синяя лента» и при необходимости разбавляли. Для изучения антиоксидантных свойств бинарных смесей экстракты перемешивали в течение 5 мин в соотношении 1 : 1.
На рисунке 5 приведена диаграмма, показывающая суммарное содержание фенолов С в указанных травах. Как и раньше, оно достигает наибольшего значения для экстракта зверобоя. И это не случайно, так как зверобой содержит большое количество биологически активных веществ, в том числе кверцетин, рутин и другие флавоноиды, аскорбиновую и никотиновую кислоты.
На рисунке 6 приведена диаграмма, построенная по результатам измерения суммарного содержания фенолов в 10 комбинациях смесей экстрактов рассматриваемых трав (левая колонка). Правая колонка - значение содержания фенолов С, вычисленное из условия аддитивности содержания фенолов в отдельных парах экстрактов (результаты взяты из рисунка 5). Сравнительный анализ полученных результатов показывает, что в некоторых бинарных смесях экстрактов трав наблюдается отклонение экспериментально полученных значений суммарного содержания фенолов от вычисленных значений как в сторону увеличения измеренных значений (порядка 12-15% в смесях 9 и 10), так и в сторону их уменьшения (порядка 10-20% в смесях 1, 6,
7, 8). Величины отклонений превышают ошибку эксперимента (5% в [14]). Данные результаты могут быть проявлением химического синергизма и антагонизма фенольных компонентов экстрактов этих трав [12]. А возможно, такие результаты объясняются неустойчивостью во времени природных фенолов, которые, как известно, достаточно быстро окисляются на воздухе. Объяснение наблюдаемого отклонения от аддитивности требует проведения дополнительного исследования экстрактов методами хроматографии с учетом устойчивости экстрагируемых компонентов во времени.
Рис. 5. Суммарное содержание фенолов С в экстрактах трав: 1 - зверобой, 2 - мята,
3 - мелисса, 4 - ромашка, 5 - тысячелистник
1 23456789 10
Рис. 6. Суммарное содержание фенолов С в 10 бинарных смесях водных экстрактов трав. Левый столбик - измеренное значение в указанных смесях, правый - вычисленное значение из условия аддитивности содержания антиоксидантов в парах экстрактов. 1 - зверобой + мята, 2 - зверобой + мелисса, 3 - зверобой + ромашка, 4 - зверобой + тысячелистник, 5 - мята + мелисса, 6 - мята + тысячелистник, 7 - мята + ромашка, 8 - мелисса + ромашка, 9 - мелисса + тысячелистник,
10 - ромашка + тысячелистник
Выводы
Амперометрическим методом измерено суммарное содержание природных фенолов антиоксидантного действия в водных и спиртовых экстрактах пяти распространенных лекарственных трав и в смесях водных экстрактов.
Получены оптимальные условия экстрагирования фенолов из лекарственных трав.
Для некоторых смесей водных экстрактов исследованных трав наблюдали отклонение экспериментально полученных величин содержания фенолов в смесях экстрактов трав от величин, рассчитанных исходя из принципа аддитивности содержания фенолов в отдельных экстрактах.
Список литературы
1. Бурлакова Е.Б. Биоантиоксиданты: вчера, сегодня, завтра // Биологическая кинетика: Сб. обзорных статей. М., 2005. Т. 2. С. 10-45.
2. Dillard C.J., German J.B. Phytochemicals: nutraceuticals and human health // J. Sci. Food Agiic. 2000. V. 80. P. 1744-1756.
3. Еськин А.П., Левданский В.А., Полежаева Н.И. Метод количественного фотометрического определения дигид-рокверцетина // Химия растительного сырья. 1998. №3. С. 41-46.
4. Андреева В.Ю., Калинкина Г.И. Разработка методики количественного определения флавоноидов в манжетке обыкновенной Alchemilla Vulgaris L.S.L. // Химия растительного сырья. 2000. №1. С. 85-88.
5. Proestos C., Chorianopoulos N., Nychas G.-J. E., Komaitis M. RP-HPLC analysis of the phenolic compounds of plant extracts. Investigation of their antioxidant capacity and antimicrobial activity // J. Agric. Food Chem. 2005. V. 53. N4. P. 1190-1195.
6. Zaporozhets O.A., Krushynska O.A., Lipkovska N.A., Barvinchenko V.N. A new test method for the evaluation of total antioxidant activity of herbal products // J. Agric. Food Chem. 2004. V. 52. N1. P. 1-25.
7. Mimica-Dukic N., Bozin B., Sokovic M., Simin N. Antimicrobial and antioxidant activities of Melissa officinalis L.
(Lamiaceal) essential oil // J. Agric. Food Chem. 2004. V. 52. N9. P. 2485-2489.
8. Autoui Ali K., Mansouri A., Boskou G., Refalas P. Tea and herbal infusions: Their antioxidant activity and phenolic
profile // Food Chem. 2005. V. 89. N1. P. 27-36.
9. Skerget M., Kotnik P., Hadolin M., Hras A.R., Simonic M., Knez Z. Phenols, proanthocyanidins, flavones and fla-vonols in some plant materials and their antioxidant acnivities // Food Chem. 2005. V. 89. N2. P. 191-198.
10. Capecka E., Mareczek A., Leja M. Antioxidant activity of fresh and dry herbs of some Lamiaceal species // Food Chem. 2006. V. 93. N2. P. 223-226.
11. Katalinic V., Vilos M., Kulisic T., Jukic M. Screening of 70 medicinal plant extracts for antioxidant capacity and total phenols // Food Chem. 2006. V. 94. N4. P. 550-557.
12. Карпухина Г.В., Эмануэль Н.М. Классификация синергических смесей антиоксидантов и механизмов синергизма // Докл. АН СССР. 1984. Т. 276. N5. С. 1163-1167.
13. Яшин А.Я., Яшин Я.И., Черноусова Н.И., Пахомов В.П. Экспрессный электрохимический метод определения антиоксидантной активности пищевых продуктов // Пиво и воды. 2004. №6. С. 44-46.
14. Яшин А.Я. Инжекционно-проточная система с амперометрическим детектором для селективного определения антиоксидантов в пищевых продуктах и напитках // Российский химический журнал. 2008. Т. LII. №2. С. 130-135.
15. Турова А.Д. Лекарственные растения СССР и их применение. М., 1974. 425 с.
16. ГОСТ 22840-77, ГОСТ Р 51299-99.
17. Liebert M., Licht U., Bohm V., Bitsch R. Antioxidant properties and total phenolics content of green and black tea under different brewing conditions // Z. Lebensm. unters Forsch. A. 1999. V. 208. P. 217-220.
18. Singleton V.L., Rossi J.A. Colorimetry of totalphenolics with phospho-molybdic-phosphotungstic acid reagents //
Amer. J. of Ecology and Viticulture. 1965. V. 16. P. 144-158.
Поступило в редакцию 5 февраля 2009 г.
