CC BY
28
УДК 619:[611.018.15:616-002.951.3](59.084)
ИЗМЕНЕНИЯ В СЕМЕННИКАХ ЛАБОРАТОРНЫХ МЫШЕЙ ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ СОМАТИЧЕСКОГО ЭКСТРАКТА ANISAKIS SIMPLEX
О.И. Лазарева, аспирант; Т.Н. Сивкова, д-р. биол. наук, профессор;
Н.А. Татарникова, д-р. ветеринар. наук, профессор,
ФГБОУ ВО Пермская ГСХА,
ул. Петропавловская, 23, г. Пермь, Россия, 614990
E-mail: ol .manina@yandex.ru
Е.С. Патлусова, канд. мед. наук,
ГБУЗ ПК «Краевая детская клиническая больница»,
ул. Баумана, 22, г. Пермь, Россия, 614066
Аннотация. Проведен опыт по изучению влияния дозозависимого эффекта экстракта личинок анизакид на семенники лабораторных животных в 2015-2016 году в лаборатории паразитологии Пермской ГСХА. Соматический экстракт внутрибрюшинно вводили в дозах 100, 200, 500 и 1000 мкг белка на голову. Убой мышей производили через 48 часов. Из семенников готовили мазки-отпечатки для последующей микроскопии, также проводили гистологическое и ультраструктурное исследование. Установлен дозозависимый эффект: с нарастанием дозы антигенного материала отмечали повышение мейотической активности, увеличивалось количество патологических форм мейоза. Изменения регистрировали при дозе в 100 мкг на голову в 2,5 раза по сравнению с контролем, при дозе в 200 мкг - в 5 раз и в 8 раз - при дозе в 500 и 1000 мкг белка на голову. Среди патологических форм определены: отставание в анафазе, че-тырехполюсная анафаза, многогрупповая метафаза, анафаза с мостами и преждевременное расхождение хромосом. При гистологическом исследовании обнаружены дистрофические изменения в клетках сперматогенного эпителия. При увеличении дозы экстракта - угнетение сперматогенеза, запустение отдельных семенных канальцев. При ультрамикроскопическом исследовании при дозе в 200 мкг белка на голову наблюдалась деструкция семенных канальцев, разрушение и гибель герминативных клеток. Наши исследования доказывают повреждающее действие белковых продуктов из личинок анизакид на герминативные клетки хозяина.
Ключевые слова: семенники, сперматогенез, соматический экстракт Аnisakis simplex, ци-топатическое и кариопатическое действие.
Введение. Появление в организме чужеродных биологических объектов и их метаболитов приводит к изменению обмена веществ и в последующем - к изменению его генетического материала [1]. Неоднократными опытами на лабораторных животных доказано отрицательное влияние Anisakis simplex на процесс сперматогенеза, а также понижение их способности к оплодотворению [2, 3]. Подобное влияние на сперматогенез, вызванное ци-тотоксическим действием на его последнюю стадию, также установлено и при других гельминтозах [4, 5, 6, 7, 8]. Белковые соматические продукты обладают сходным действием, и также их цитотоксичность определяется концентрацией биоматериала [9, 10, 11, 12, 13, 14]. Одним из ведущих механизмов повреждения клеток генома хозяина считается нарушение
хода свободнорадикального процесса с увеличением продуктов перекисного окисления [15, 16]. Для изучения влияния экстракта личинок анизакид на лабораторных животных было проведено исследование дозозависимого эффекта на семенники лабораторных мышей.
Методика. Приготовление соматического экстракта из личинок Л^Шр1ех проводили стандартными методами. Полученный материал проверяли на стерильность и безвредность, определяли в нем содержание белка. Экстракт однократно внутрибрюшинно вводили нелинейным белым мышам-самцам массой 18-22 грамма в дозах 100, 200, 500 и 1000 мкг белка на голову. Пятая группа служила интактным контролем. В каждой группе было по 5 животных. Убой лабораторных животных проводили через 48 часов по-
сле введения экстракта методом цервикальной дислокации. Готовили мазки-отпечатки из семенников, фиксировали метиленовым синим по Май-Грюнвальду и окрашивали по Романовскому-Гимзе. При микроскопировании определяли мейотический индекс (%), общее количество патологических форм мейоза (%) и отдельных их разновидностей (%). Фактический материал, полученный в результате эксперимента, обрабатывали методом вариационной статистики. Показатели считались достоверными при значениях р<0,05 (по критерию Стьюдента). Для гистологического исследования семенники промывали, фиксиро-
вали 10% раствором нейтрального формалина и подготавливали по общепринятой методике. Срезы толщиной 4-5 микрон окрашивали гематоксилином и эозином и по ван Гизон. Для электронной микроскопии семенники мышей немедленно измельчали в очищенном 2,5%-ном растворе глютарового альдегида. Готовые срезы просматривали на электронном микроскопе ЭМВ-100БР при ускоряющем напряжении 75К.
Результаты. При микроскопии мазков-отпечатков семенников был установлен дозо-зависимый эффект. Материалы представлены в таблице.
Таблица
Изменение частоты кариопатических показателей в семенниках мышей под воздействием разных доз экстракта Л^тр1вх
Показатель Контроль 100 мкг/ голову 200 мкг/ голову 500 мкг/ голову 1000мкг/ голову
Мейотический индекс (%) 5,50±1,00 6,28±1,30 7,56±1,07 7,68±1,30 8,24±1,83
Патологии мейоза(%) 0,08±0,01 0,20±0,16 0,44±0,25 0,62±0,38 0,64±0,31*
Соотношение фаз деления про-метафаза/ана-телофаза 0,20±0,09 0,40±0,18 0,27±0,08 0,28±0,18 0,24±0,06
*Р>0,05
Отмечали дозозависимое повышение мейотической активности. Количество ана-телофаз уменьшалось, а про-метафаз - увеличивалось. Количество патологий мейоза изменялось с 0,08% - в контроле до 0,2% - при дозе в 100 мкг, при дозе в 1000 мкг - в 8 раз.
При гистологическом исследовании при дозе 100 мкг наблюдались изменения в эндо-телиальных клетках артериальных сосудов. Отмечалась гипертрофия мышечной оболочки и вакуолизация цитоплазмы миоцитов. Клетки канальцев находились в состоянии дистрофии. Местами сперматогенез был ослаблен. В се-мявыносящих протоках содержались аморфные массы белка. При дозе 200 мкг/голову в
Рис. 1. Семенник мыши. Запустение семенных канальцев. Увел. х400.
семявыносящих протоках появлялись более мелкие группы зрелых сперматозоидов. При 500 мкг и 1000 мкг белка на голову наблюдали отслоение наружной оболочки семенника за счет отека. В расширенных семявыносящих протоках группы сперматозоидов находились лишь на уровне центральных отделов. При дозе 1000 мкг сперматогенез не прослеживался (рис.1).
При ультрамикроскопическом исследовании органа отмечали деструкцию части канальцев, разрушение цитоплазмы герминативных клеток, выход органелл, наличие бесструктурных масс или отдельно лежащих клеток (рис.2).
Рис. 2. Бесструктурные массы в просвете разрушенного семенного канальца. Увел. х2200
Выводы. Уровень нарушений в половых клетках хозяина при экспериментальном введении экстракта белка Л^Шр1ех зависит от дозы и возрастает с ее увеличением. Кариопати-ческие изменения в сперматоцитах приводят к развитию дистрофии и угнетению сперматогенеза. Соматические белковые продукты ани-закид, введенные мышам внутрибрюшинно,
вызывают деструкцию семенных канальцев, разрушение цитоплазмы герминативных клеток, выход органелл из клеток с последующей их гибелью. Таким образом, наши исследования доказывают повреждающее действие белковых продуктов из личинок анизакид на герминативные клетки хозяина.
Литература
I.Черноус Е. А. Уровни коэволюционных отношений в системе «паразит-хозяин» при трихинеллезе. Адаптации паразита // Оригинальные научные публикации. БГМУ. 2012. С. 129-132.
2.Сивкова Т. Н., Бережко В. К. Кариопатическое и патоморфологическое действие продуктов метаболизма личинок анизакид : монография. Пермь : Изд-во ФГОУ ВПО Пермская ГСХА, 2011. 132 с.
3. Действие экстракта личинок анизакид на оплодотворяющую способность самцов лабораторных мышей / Т. Н. Сивкова [и др.] // Российский паразитологический журнал. 2010. № 1. С. 79-82.
4. Li C.Y., Li F., Jia X.M., Wang H., Chen L.Y. Anti-fecundity effect of soluble immature egg antigen of Schistosoma japonicum in mice. Zhongguo Ji Sheng Chong Xue Yu Ji Sheng Chong Bing Za Zhi. 2008. Vol. 26(6). pp. 462-465.
5. Бекиш В. Я., Бекиш О.-Я. Л. Механизмы генотоксических эффектов в соматических и генеративных клетках хозяина при гельминтозах // Вестник ВГМУ. 2005. № 4.С. 73-79.
6. Патологии мейоза клеток семенников белых мышей под воздействием соматического антигена Dirofilaria immitis / А.В. Согринаи [и др.] // Естественные и математические науки в современном мире. 2015. № 2 (26). С. 176-183.
7. Bekish V. J. The alterations in genetic apparatus of somatic and generative cells of the host caused by helminthes metabolites // Wiadomosc iParazytologiczne (Poland). 2001. Vol. 47(4). pp. 891-896.
8. Detection by the comet assay of apoptosis induced in lymphoid cell lines after growth factor deprivation / M. Florent [et al] // Cell Biol Toxicol. 1999. vol. 15(3). pp.185-192.
9. Анисимова Е. И. , Полоз С. В., Субботин А. М. Гельминты хищных млекопитающих (семейство Canidae, Fischer, 1817) в естественных условиях и на зверофермах. Издательский дом «РУП Белорусская Наука», 2011. 237с.
10. Бекиш В. Я., Коневалова Н. Ю., Бекиш О.-Я. Л. Метаболиты гельминтов как индукторы апоптоза клеток хозяина // Вестник ВГМУ. 2005. № 2.С. 80-85.
II. Бекиш О.-Я. Л., Бекиш В. Я., Побяржин В. В. Генотоксические и цитотоксические эффекты в организме хозяина при гельминтозных инвазиях // Достижения медицинской науки Беларуси.-2006. [Электронный ресурс]. Систем. требования: Adobe Acrobat Reader. URL: http://med.by/dmn/book.php?book=06-11_2(дата обращения: 30.05.2016).
12. Колмогоров В. И., Бекиш В. Я. Повреждение генома хозяина при экспериментальном токсокарозе и при сенсибилизации белковым продуктом из тканей Toxocara canis // Вестник ВГМУ. 2004. Т. 3. № 3. С. 81-89.
13. Chow S. C., Brown A., Pritchard D. The human hookworm pathogen Necator americanus induces apoptosis in T lymphocytes // Parasite Immunology. 2000. Vol. 22. pp. 29-37.
14. Бекиш В. Я., Колмогоров В. И., Побяржин В. В. Микроядерный тест в клетках костного мозга и семенников мышей линии СВА при гельминтозах // Вестник ВГМУ. 2003. № 2. С. 67-72.
15. Бекиш В. Я., Колмогоров В. И., Бекиш Л. Э. Влияние комбинированной терапии экспериментального ток-сокароза на состояние генома хозяина и свободнорадикальные процессы в семенниках // Вестник фармации. 2003. № 3. С. 45-51.
16.Tripathi R., Jaiswal N., Sharma B., Malhotra S.K. Helminth Infections Mediated DNA Damage: Mechanisms and Consequences // Single Cell Biol. 2015. vol. 4(3). pp. 1-7.
CHANGES IN THE TESTES OF LABORATORY MICE UNDER THE INFLUENCE OF SOMATIC EXTRACT ANISAKIS SIMPLEX
O. I. Lazareva, Post-Graduate Student; T. N. Sivkova, Dr. Bio. Sci., Professor;
N. A. Tatarnikova, Dr. Vet. Sci., Professor,
Perm State Agricultural Academy
23 Petropavlovskaya St., Perm, 614990 Russia
E. S. Patlusova, Сand. Med. Sci.,
Perm Regional Children's Clinical Hospital,
22 Baumana St., Perm, 614066 Russia
E-mail: ol .manina@yandex.ru
ABSTRACT
Somatic extract Anisakis simplex larvae were injected intraperitoneally in doses of 100, 200, 500, and 1000 ^g of protein per head to laboratory mice. After 48 hours mice were slaughtered. Microscope study smears of mice testes were prepared. Histological examination and electron microscopy were
performed. Dose-dependent effect was set meiotic activity increased with increasing doses of the antigenic material, the increase in abnormalities meiosis, some of its forms, was noted. Histological examination of the seminiferous epithelium of the degenerative changes in the cells was detected. Increasing the dose of the extract spermatogenesis weakened, individual seminiferous tubules were empty. At doses of 200 ^g protein per head at ultramicroscopic study, the destruction of the seminiferous tubules was observed, germinal cells died and were destroyed. Research carried out by us has shown the damaging effect of the protein products of larval Anisakis simplex on germ cells. Keywords: testis, spermatogenesis, somatic extract of Anisakis simplex, cytopathic and kariopatic effects.
References
1. Chernous E. A. Urovni kojevoljucionnyh otnoshenij v sisteme «parazit-hozjain» pri trihinelleze. Adaptacii parazita (Levels of co-evolutionary relationships in the system "parasite - host" at trichinosis. The adaptation of the parasite), Origi-nal'nye nauchnye publikacii, BGMU, 2012, pp. 129-132.
2. Sivkova T. N., Berezhko V. K. Kariopaticheskoe i patomorfologicheskoe dejstvie produktov metabolizma lichinok anizakid (Cariopatic and pathomorphological effects larvae metabolic products anisakids: monograph), monografija, Perm', Izd-vo FGOU VPO Permskaja GSHA, 2011, 132 p.
3. Sivkova T. N., Markova L. N., Patlusova E. S., Potemkina A. P. Dejstvie jekstrakta lichinok anizakid na oplodotvor-jajushhuju sposobnost' samcov laboratornyh myshej (Effect of anisakids extract larvae on the fertilizing capacity of male laboratory mice) Rossijskij parazitologicheskij zhurnal, 2010, No. 1, pp. 79-82.
4. Li C.Y., Li F., Jia X.M., Wang H., Chen L.Y. Anti-fecundity effect of soluble immature egg antigen of Schistosoma japonicum in mice, Zhongguo Ji Sheng Chong Xue Yu Ji Sheng Chong Bing Za Zhi, 2008, Vol. 26(6), pp. 462-465.
5. Bekish V. Ja., Bekish O.-Ja. L. Mehanizmy genotoksicheskih jeffektov v somaticheskih i generativnyh kletkah hozjaina pri gel'mintozah (Mechanisms of genotoxic effects in somatic and generative cells of the host at helminthoses), Vestnik VGMU, 2005, No. 4, pp. 73-79.
6. Sogrina A. V., Berezhko V. K., Sivkova T. N., Napisanova L. A. Patologii mejoza kletok semennikov belyh myshej pod vozdejstviem somaticheskogo antigena Dirofilaria immitis (Pathology of testes cells meiosis in albino mice by somatic antigen of Dirofilaria immitis), Estestvennye i matematicheskie nauki v sovremennom mire, 2015, No. 2 (26), pp. 176-183.
7. Bekish V. J. The alterations in genetic apparatus of somatic and generative cells of the host caused by helminthes metabolites, Wiadomosc iParazytologiczne (Poland), 2001, Vol. 47(4), pp. 891-896.
8. Detection by the comet assay of apoptosis induced in lymphoid cell lines after growth factor deprivation, M. Florent [et al], Cell Biol Toxicol, 1999. Vol. 15(3), pp.185-192.
9. Anisimova E. I. , Poloz S. V., Subbotin A. M. Gel'minty hishhnyh mlekopitajushhih (semejstvo Canidae, Fischer, 1817) v estestvennyh uslovijah i na zverofermah (Helminthes in carnivorous mammals (family Canidae, Fischer, 1817) under natural conditions and in fur farms), Izdatel'skij dom «RUP Belorusskaja Nauka», 2011, 237 p.
10. Bekish V. Ja., Konevalova N. Ju., Bekish O.-Ja. L. Metabolity gel'mintov kak induktory apoptoza kletok hozjaina (Metabolites of worms as inducers of apoptosis of host cells), Vestnik VGMU, 2005, No. 2, pp. 80-85.
11. Bekish O.-Ja. L., Bekish V. Ja., Pobjarzhin V. V. Genotoksicheskie i citotoksicheskie jeffekty v organizme hozjaina pri gel'mintoznyh invazijah (Genotoxic and cytotoxic effects in a host organism with helminth invasions) Dostizhenija medicinskoj nauki Belarusi.-2006 [Jelektronnyj resurs]. Sistem. trebovanija: Adobe Acrobat Reader. URL: http://med.by/dmn/book.php?book=06-11_2(data obrashhenija: 30.05.2016).
12. Kolmogorov V. I., Bekish V. Ja. Povrezhdenie genoma hozjaina pri jeksperimental'nom toksokaroze i pri sensibil-izacii belkovym produktom iz tkanej Toxocara canis (Damage to the host genome in experimental toxocarosis and sensitiza-tion of the protein product of the tissue Toxocara canis), Vestnik VGMU, 2004, T. 3, No. 3, pp. 81-89.
13. Chow S. C., Brown A., Pritchard D. The human hookworm pathogen Necator americanus induces apoptosis in T lymphocytes, Parasite Immunology, 2000, Vol. 22, pp. 29-37.
14. Bekish V. Ja., Kolmogorov V. I., Pobjarzhin V. V. Mikrojadernyj test v kletkah kostnogo mozga i semennikov myshej linii SVA pri gel'mintozah (Micronucleus test in bone marrow cells of the testes and CBA mice in helminthiasis), Vestnik VGMU, 2003, No. 2, pp. 67-72.
15. Bekish V. Ja., Kolmogorov V. I., Bekish L. Je. Vlijanie kombinirovannoj terapii jeksperimental'nogo toksokaroza na sostojanie genoma hozjaina i svobodnoradikal'nye processy v semennikah (Effect of combination therapy of experimental toxocariasis in the genome of the host state and free-radical processes in the testes), Vestnik farmacii, 2003, No. 3, pp. 45-51.
16.Tripathi R., Jaiswal N., Sharma B., Malhotra S.K. Helminth Infections Mediated DNA Damage: Mechanisms and Consequences, Single Cell Biol, 2015, vol. 4(3), pp. 1-7.
