CC BY
28
УДК 611.814.1:575.332)-092.9
ИЗМЕНЕНИЯ В РАСПРЕДЕЛЕНИИ НЕЙРОНОВ, СОДЕРЖАЩИХ СИНТАЗУ № В ГИПОТАЛАМУСЕ И ПРОДОЛГОВАТОМ МОЗГЕ В ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ У ЗРЕЛОРОЖДАЮЩИХСЯ МЛЕКОПИТАЮЩИХ В.И. Дунай, к.б.н. Кафедра психофизиологии гуманитарного факультета УО «Белорусский государственный университет»
Установлено, что у морских свинок к двадцатому дню постнатального развития формируются основные черты в распределении предполагаемых NO-синтезирующих нервных клеток, характерные для взрослого организма.
Ключевые слова: онтогенез, NO-синтаза, гипоталамус.
It has been found out that in guinea-pigs the basic features in the distribution ofprobable NO-synthesizing nerve cells have been formed by the twentieth day of the postnatal development. These features are typical of the adult organism.
Keywords: ontogenesis, NO-synthesis, hypothalamus.
Оксид азота (N0) является одним из наиболее важных биологических медиаторов, который вовлечен во множество физиологических и патофизиологических процессов. Он представляет собой уникальный по своей природе и механизмам действия вторичный мессенджер в большинстве клеток организма. В частности, оксид азота участвует в реализации многих физиологических функций, таких как вазодилатация, нейротрансмиссия, снижение агрегации тромбоцитов, реакции иммунной системы, регуляция тонуса гладких мышц, состояние памяти и др., а также некоторых патологических процессов [1-4]. В организме N0 синтезируется клетками из аминокислоты L-аргинин [5, 6]. Этот процесс представляет собой комплексную окислительную реакцию, катализируемую ферментом синтазой N0 ^N0), которая присоединяет молекулярный кислород к конечному атому азота в гуанидиновой группе L-аргинина.
Данные литературы свидетельствуют, что N0-синтезирующие нейроны широко распространены в ЦНС млекопитающих [7]. Имеются предположения о том, что N0 может являться одним из важнейших факторов, участвующих в развитии структуры и функции центральной нервной системы, являясь молекулой, вызывающей гибель определенных клеточных структур, а также играя важную роль в механизмах роста нервных окончаний и формирования синапсов [8]. Получены доказательства участия N0 в центральных механизмах терморегуляции при перегревании и экспериментальной лихорадке [9].
Несмотря на обилие фактов, свидетельствующих об участии N0 в регуляции различных физио-
логических функций, а также в развитии центральной нервной системы, становление центральных NO-ергических систем в онтогенезе остается совершенно неизученным.
Целью данной работы явилось изучение созревания NO-ергических систем мозга в раннем по-стнатальном онтогенезе у морских свинок, как представителей зрелорождающихся млекопитающих.
Материалы и методы исследования.
Эксперименты выполнены на 32 морских свинках. Первая группа - животные в возрасте 1 дня, вторая группа - в возрасте 3 дней, третья группа -в возрасте 10 дней, четвертая - в возрасте 20 дней.
Специальными исследованиями было доказано, что нейронная синтаза NO является никотинами-дадениндинуклеотидфосфат-диафоразой (НАДФН-д) [10]. Во-первых, локализация в центральной и периферической нервной системе НАДФН-д-со-держащих нейронов, окрашенных гистохимически, соответствует локализации нервных клеток, содержащих CNO, окрашенных с применением методов иммуногистохимии. Во-вторых, CNO и НАДФН-д обнаруживают сходные иммунохимические и биохимические свойства. В-третьих, НАДФН-д активность выявляется de novo у клеток с трансформированной кДНК к CNO. Использование гистохимической реакции для идентификации CNO-содержащих нейронов возможно только при условии, что исследуемая ткань проходит фиксацию в параформальдегиде. Установлено [10], что при фиксации с использованием параформальдегида инактивируются все НАДФН-зависимые ферменты-окислители, за исключением CNO. Таким об-
Журнал ГрГМУ 2008 № 1
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
разом, при условии фиксации ткани в параформаль-дегиде, использование гистохимической реакции на НАДФН-д для идентификации NO-синтезирующих нервных клеток является адекватным методом и широко используется в настоящее время.
В работе использован метод идентификации НАДФН-д-содержащих нейронов, разработанный Scherer-Singler et al. [11], в модификации Hope и Vincent [12].
Для выделения гипоталамуса у животных целиком извлекали головной мозг. Отделяли гипоталамус и продолговатый мозг и дополнительно фиксировали, согласно рекомендации Matsumoto et al. [13] 90 минут в 4% параформальдегиде на фосфатном буфере (0.1M, pH 7.4). Участки мозга шесть раз по 30 мин. отмывали на холоде с использованием 0,1 М раствора Трис-НС1 (pH 8,0) и инкубировали в 10% и 25% растворах сахарозы на Трис-НС1 (0,1M, pH8,0) в течение 1,5 и 12 часов, соответственно.
Объекты помещали на охлажденные металлические блоки, которые ставили в криостат (-25oC) на 20 минут для замораживания. Из замороженной ткани готовили серийные срезы толщиной 25 мкм, которые наклеивали на предметные стекла, предварительно подвергшиеся хром-желатиновой обработке, и высушивали.
Срезы отмывали от сахарозы в 0,1 М растворе Трис-НС1 (pH 8.0) в течение 5 мин. Гистохимическая процедура заключалась в инкубации срезов в растворе 0,1 М Трис-HCI (рН 8,0), содержащем НАДФН (1 мМ), нитросиний тетразолий (0.5 мМ), Тритон X-100 (0,3 %) и дикумарол (0,1мМ) на протяжении 1-2 ч. при 22оС и относительной влажности 95-100 %. По окончании гистохимической реакции срезы промывали в растворе Трис-НС1 в течение 5 минут, обезвоживали в этаноле, заключали в канадский бальзам и накрывали покровными стеклами.
Специфичность гистохимической реакции проверялась инкубацией нескольких срезов в растворах, не содержащих нитросиний тетразолий или НАДФН, а также в растворе, содержащем НАДФ вместо НАДФН. Химическая основа реакции заключается в образовании преципитата формазана при восстановлении солей тетразолия НАДФН-диафоразой в присутствии НАДФН. Таким образом, гистохимическая реакция не должна наблюдаться в случае отсутствия в инкубационной среде любого из основных компонентов (нитросиний тетразолий, НАДФН), а также в случае использования НАДФ вместо НАДФН.
Результаты
Опыты показали, что у морских свинок в первые дни после рождения в гипоталамической об-
ласти происходят значительные изменения в распределении нервных клеток, содержащих НАДФН-д/СNO (таблица).
Таблица. Распределение нервных клеток, содержащих НАДФН-д/СМО, в структурах гипоталамуса у морских свинок в разные сроки постнатального онтогенеза
№ п/п CipyKTypa 1 день 3 день 10 день 20 день
1. Medial preoptic area - + + +
2. Lateral preoptic area + + + +
3. Supraoptic nucleus - - - +
4. Paraventricular nucleus + + + +
5. Periventricular nucleus - - + +
6. Lateral hypothalamic area + + + +
7. Medial mammillary nucleus - + + +
8. Supramammillary nucleus + + + +
«+» - структура содержит НАДФН-д/СМО-позитивные нервные клетки; «-» - структура не содержит НАДФН-д/СМО-позитивные нервные клетки.
При изучении серийных срезов гипоталамуса морских свинок в возрасте одного дня после рождения обнаружены НАДФН-д/СМО-позитивные нейроны в латеральной преоптической области, паравентрикулярном ядре, латеральной гипотала-мической области и в супрамаммилярном ядре.
У морских свинок в возрасте одного дня после рождения не обнаружены НАДФН-д/СМО-пози-тивные нейроны в ряде структур гипоталамуса, содержащих такие нейроны у взрослых организмов. Так, не обнаружены НАДФН-д/СМО-позитив-ные нейроны в медиальной преоптической области, супраоптическом ядре, перивентрикулярном ядре и медиальном маммилярном ядре.
У морских свинок в возрасте трех дней после рождения так же, как и у однодневных морских свинок, гипоталамус не содержит НАДФН-д/СМО-позитивных нейронов в супраоптическом ядре и перивентрикулярном ядре.
Гипоталамическая область трехдневных морских свинок содержит НАДФН-д/СМО-позитивные нейроны в тех же структурах, что и у однодневных (в латеральной преоптической области, пара-вентрикулярном ядре, латеральной гипоталамичес-кой области и в супрамаммилярном ядре). Кроме того, названные нейроны обнаружены в медиальной преоптической области и медиальном мамми-лярном ядре.
В период между третьим и десятым днем формируются основные черты в распределении НАДФН-д/СМО-позитивных нейронов гипотала-мической области, характерные для взрослого организма.
Так, у десятидневных морских свинок выявляются НАДФН-д/СМО-позитивные нейроны почти во всех структурах гипоталамуса, содержащих такие нервные клетки у взрослых животных. В отличие от третьего дня, к 10-му дню развития НАДФН-д/СМО-позитивные нейроны появляются в перивентрикулярном ядре. Обнаружено, что ги-
Рисунок - НАДФН-д-позитивные нервные клетки в переднем гипоталамусе морской свинки. Микрофото (х100)
поталамус десятидневного животного не содержит НАДФН-д/СКО-позитивных клеток в супраопти-ческом ядре.
Крупные, интенсивно окрашенные НАДФН-д/ СКО-позитивные нейроны появляются в супраоп-тическом ядре в период между десятым и двадцатым днем после рождения. Таким образом, не существует различий в распределении НАДФН-д/ СКО-позитивных нейронов в гипоталамусе 20-дневного животного по сравнению с взрослыми животными (рисунок).
Полученные данные свидетельствуют о том, что, по-видимому, между десятым и двадцатым днем после рождения происходит окончательное структурное формирование КО-зависимых систем нервных центров гипоталамуса морских свинок.
При изучении серийных срезов продолговатого мозга, окрашенных на НАДФН-д, у морских свинок в разные сроки после рождения, НАДФН-д/ СКО-позитивные нервные клетки обнаружены во всех изучаемых структурах.
По-видимому, еще до рождения завершается формирование КО-зависимых систем нервных центров продолговатого мозга, структурное и функциональное развитие которых должно обеспечивать в первые дни жизни важнейшие вегетативные функции (дыхание, кровообращение).
Обсуждение результатов
В ходе выполненных экспериментов установлено, что в первые дни после рождения у морских свинок в гипоталамической области происходят значительные изменения в распределении НАДФН-д/СКО-позитивных нервных клеток. Полученные данные свидетельствуют о том, что, по-видимому, между десятым и двадцатым днем после рождения происходит окончательное структурное формирование NO-зависимых систем нервных центров гипоталамуса зрелорождающихся млекопитающих.
Литература
1. Lowenstein C.J., Dinerman J.L., Snyder S.H. Nitric oxide: a physiologic messengers. Ann. intern.Med. - 1994. - Vol. 120. - P . 227-237.
2. Moncada S., Higgs A. Mechanisms of disease: the L-arginine - nitric oxide pathway. New Engl.J.Med. - 1993. - Vol. 329. - P. 2002-2012.
3. Nakaki T. Physiological and clinical significance of NO (nitric oxide) - a review. Keio J.Med. - 1994. - Vol. 43. - P. 15-26.
4. Snyder S.H. Janus faces of nitric oxide. Nature. - 1993. - Vol. 364. - P. 577.
5 . Nathan C. Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells. FASEB J - 1992. - Vol. 6. - P. 3051-3064.
6. Wang Y., Marsden P.A. Nitric oxide synthases: biochemical and molecular regulation. Curr.Opin.Nephrol.Hypertens. - 1995. -Vol. 4. - P. 12-22.
7. Dawson T. M., Hwang P. M., Snyder S. H. Nitric oxide synthase and neuronal NADPH diaphorase are identical in brain and peripheral tissues// Proc. Natl. Acad. Sci USA. - 1991. - Vol. 88, N.17. - P. 7797-7801.
8. Gourine A. V. Role of nitric oxide in lipopolysaccharide-induced fever in conscious rabbits// J.Physiol. - 1994. - Vol. 475. -P.28.
9. Dunai V. I., Gourine A. V. Effect of the NO synthase inhibitor, L-NAME, on body temperature in birds in different periods of postnatal ontogenesis// Recent advances in thermal biology. Edited by V. N. Gourine. -Minsk.-1999. - P.18-19.
10. Pasqualotto B. A., Hope B. T., Vincent S. R. Citrulline in the rat brain - immunohistochemistry and coexistence with NADPH-diapho-rase// Neurosci.Lett. -1991. - Vol. 128, N.2. - P. 155-160.
11. Scherer-Singler U., Vincent S. R., Kimura H., McGeer E. G. Demonstration of a unique population of neurons with NADPH-diaphorase histochemistry// J.Neurosci.Methods.-1983.-Vol.9,N.3.-P.229-234.
12. Hope B. T., Vincent S.R. Histochemical characterization of neuronal NADPH-diaphorase //J.Histochem.Cytochem.-1989. -Vol.37. - P.653-661.
13. Matsumoto T., Kuk J. E., Forstermann U. A correlation between soluble brain nitric oxide synthase and NADPH-diaphorase activity is nly seen after exposure of the tissue to fixative// Neurosci.Lett. - 1993. - Vol. 155, N.1. - P. 61-64.
Поступила 27.08.07
