CC BY
46
УДК 577.124:577.125.3
ИЗМЕНЕНИЯ УГЛЕВОДНОГО И ЖИРНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА МИЦЕЛИЯ LENTINUS EDODES ПРИ СОВМЕСТНОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ AZOSPIRILLUM BRASILENSE
Е.А. Лощинина, О.М. Цивилева, О.Е. Макаров, В.Е. Никитина
ФГБУН Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук, 410049, Саратов, проспект Энтузиастов, 13, [email protected], [email protected].
Ранее нами впервые было показано стимулирующее влияние бактерий Azospirillum brasilense на культивируемый ксилотрофный базидиомицет Lentinus edodes. В данной работе мы изучили изменения углеводного и жирнокислотного состава мицелия L. edodes при культивировании в ассоциации с A. brasilense. Обнаружено, что в совместной культуре наблюдается значительное увеличение содержания полиола маннита по сравнению с чистой культурой: на стадии коричневой мицелиальной пленки - более чем в 30 раз, на стадии белого мицелия и примордия - в 3 раза. Содержание насыщенных жирных кислот мицелия L. edodes (С 16:0 и С 18:0) в совместной культуре оказалось соответственно в 1,7 и 1,9 раз ниже по сравнению с монокультурой гриба. Изменения состава мицелия в бактериально-грибной ассоциации по сравнению с монокультурой гриба оказались качественно схожи с соответствующими биохимическими изменениями, происходящими в мицелии шиитаке при переходе к генеративной стадии развития. Табл. 1. Библиогр.18 назв.
Ключевые слова: культивирование микробной ассоциации, ксилотрофные базидиомицеты, Azospirillum brasilense, Lentinus edodes, углеводный состав, жирнокислотный состав.
CHANGES IN CARBOHYDRATE AND FATTY-ACID CONTENT OF LENTINUS EDODES MYCELIUM IN DUAL CULTURES WITH AZOSPIRILLUM BRASILENSE
E.A. Loschinina, O.M. Tsivileva, O.E. Makarov, V.E. Nikitina
Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms RAS,
13, Entuziastov Ave., Saratov, 410049, Russia, [email protected], [email protected].
Earlier we have demonstrated for the first time a positive influence exerted by Azospirillum brasilense bacteria on the cultivable xylotrophic basidiomycete Lentinus edodes. In the present work, we have studied the changes in carbohydrate and fatty-acid content of L. edodes mycelium under the conditions of its co-culture with A. brasilense. It was shown that in the dual culture, the considerable increase in mannitol level compared to monoculture takes place, namely by more than 30 times at the step of brown mycelial film, and by 3 times at the steps of white mycelium and primordia. Saturated fatty acids (С16:0 and С18:0) content in L. edodes mycelium in joint culture appeared to be by 1.7 and 1.9 times, respectively, lower compared to the mushroom monoculture. The changes in mycelium composition of dual culture in comparison with pure fungal mycelium were observed to be qualitatively similar to the corresponding biochemical modulations taking place in shiitake mycelium on going towards the generative development step. 1 table. 18. sources.
Keywords: co-culture, xylotrophic basidiomycetes, Azospirillum brasilense, Lentinus edodes, carbohydrate composition, fatty-acid composition.
ВВЕДЕНИЕ
Lentinus edodes (шиитаке) - съедобный культивируемый базидиомицет, занимающий второе место в мире по объему промышленного производства среди грибов и обладающий ценными питательными и целебными свойствами [1-3]. Большое значение имеет вопрос о возможной оптимизации искусственного выращивания этой культуры. Улучшить технологию культивирования шиитаке, усилив скорость роста и одновременно подавив рост контаминантов можно путем выращивания гриба в ассоциации со стимулирующими рост микроорганизмами.
Бактерии рода AzospirШum, представители группы ризосферных бактерий - ассоциативные азотфиксаторы, стимулирующие рост и развитие растений посредством фиксации атмосферного азота и гормональной регуляции [4,5], обладающие бактерицидной и фунгицидной активностью в отношении ряда бактерий и микроскопических грибов [6-8].
Ранее нами впервые показано, что культивирование базидиомицета Lentinus edodes в ассоциации с бактериями AzospirШum brasilense приводит к стимуляции мицелиального роста и снижению
биотического влияния на шиитаке контаминантов [9]. Стимуляция роста шиитаке под влиянием азо-спирилл неизбежно должна сопровождаться изменениями в биохимическом составе мицелия. Углеводный и жирнокислотный состав - одни из важнейших характеристик грибной культуры, тесно связанные с физиологическим состоянием грибного организма. В связи с этим цель данного исследования состояла в изучении возможных изменений, происходящих в составе пула углеводов и жирных кислот мицелия шиитаке при культивировании гриба в ассоциации с азоспириллой.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Основным объектом исследования послужил штамм 1впИпиз вбобвз F-249 из коллекции высших базидиальных грибов кафедры микологии и альгологии МГУ. Культуру гриба поддерживали на сусло-агаре (4° по Баллингу) при 4 °С. Также в работе был использован штамм ЛюврИНит ЬгазИвпвв Sp7, полученный из Института микробиологии РАН (г. Москва).
Для культивирования I вdodвs в ассоциации с Л. brasilвnsв использовали синтетическую среду следующего состава (г/л): О-глюкоза - 10; 1-аспарагин - 1; KH2PO4 - 2; K2HPO4 - 3; MgSO4•7H2O - 2,5; FeSO4•7H2O - 0,03; CaCl2•7H2O - 0,02. К культуре I вdodвs, выращенной на жидкой среде указанного состава в течение 14 сут., подсевали суспензию бактерий Л. Ьга-silвnsв в физиологическом растворе (2х107 клеток/мл).
Экстракты из мицелия для определения углеводного состава получали, промывая биомассу дистиллированной водой. Для получения водного или этанольного экстракта отмытый и высушенный мицелий механически измельчали и трижды экстрагировали в течение 30 мин кипящей дистиллированной водой или этанолом соответственно. Экстракты объединяли и высушивали досуха.
Состав углеводной фракции мицелия I вdodвs исследовали методом капиллярной газовой хроматографии на неподвижной жидкой фазе SE-54 в режиме программирования температуры, с предварительным получением силильных производных сахаров.
Триметилсилиловые эфиры исследуемых проб и соединений-стандартов получали с использованием 1,1,1,3,3,3-гексаметилдисилазана и три-метилхлорсилана в качестве катализатора [10]. Навеску сухой пробы обрабатывали следующим образом. Растворяли 10 мг пробы в 1,5 мл безводного пиридина, добавляли 0,2 мл гексаметилдиси-лазана и 0,1 мл триметилхлорсилана с помощью автоматической пипетки. Добивались полного растворения реагентов путем встряхивания и нагрева на песчаной бане до температуры примерно 80 °С (по необходимости). Затем помещали пробы в центрифужные пробирки и заклеиваливали их лентой, обеспечивая минимальное попадание вла-
ги во время экспериментов во избежание гидролиза триметилсилиловых эфиров. Центрифугировали пробирки в течение 10 мин при 4500-5000 об./мин. Стеклянными капиллярами производился отбор прозрачного слоя, объем пробы в пробирках Эппендорфа составлял 1 мл.
Хроматографию проводили на приборе «Chrom 5» (ЧССР) с пламенно-ионизационным детектором, используя кварцевую капиллярную колонку длиной 25 м, при программировании температуры в пределах от 150 до 280 °С со скоростью нагрева термостата колонок 8 °С/мин. Объем пробы составлял 1 мкл. Газ-носитель - гелий. Времена удерживания компонентов анализируемых проб и интегральные площади пиков сопоставляли с соответствующими характеристиками стандартных веществ, хроматографирование которых проводили при идентичных условиях и параметрах газохроматографического процесса. Рассчитывали содержание каждого углевода в исследуемых пробах.
Липиды экстрагировали из мицелия модифицированным методом С. Song с соавт., включающим обработку сухого мицелия смесями метанол-в од а-хлороформ в объемном соотношении (1:2:3), высушивание в токе азота или аргона и экстракцию сухого остатка гексаном [11]. Жирные кислоты анализировали в виде метиловых эфиров методом газожидкостной хроматографии [12]. Метиловые эфиры жирных кислот разделяли на газожидкостном хроматографе «Биохром-1» на кварцевой капиллярной колонке (длина 25 м, внутренний диаметр 0,2 мм) с неподвижной фазой SE-54. Использовали режим программирования температуры термостата колонки от 130 до 270 °С со скоростью нагрева 4°С/мин. Температура испарителя -150 °С, детектора - 270 °С. Газ-носитель - гелий, скорость потока 1,6 мл/мин.
Жирные кислоты идентифицировали по временам удерживания их метиловых эфиров. В качестве стандартов метиловых эфиров жирных кислот использовали набор «Bacterial Acid Methyl Esters CP Mix» («Supelco»): 11:0; 2-OH 10:0; 12:0; 13:0; 2-OH 12:0; 3-OH 12:0; 14:0; i-15:0; a-15:0; 15:0; 2-OH 14:0; 3-OH 14:0; i-16:0; 16:19; 16:0; i-17:0; 17:0; 2-OH 16:0; 18:29,12 ;18:19 ;18:0; 19:0; 20:0, а также в дополнение другие метиловые эфиры ЖК («Sigma»): 7:0; 8:0; 9:0; 10:0; 18:1; 20:2; 21:0; 22:1; 22:0; 23:0; 24:1; 24:0.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Из биохимических особенностей грибного мицелия, в разных аспектах привлекающих внимание исследователей и определяющих способность ба-зидиомицета к плодоношению, важное место занимают его углеводный и жирнокислотный состав.
Ранее нами было обнаружено стимулирующее влияние бактерии A. brasilense на рост L. edodes. В настоящей работе высказано и подтверждено предположение, что стимуляция роста
шиитаке при совместном культивировании с азо-спириллой должна сопровождаться определенными изменениями химического состава мицелия и его биологической активности.
Углеводный состав мицелия совместной культуры L. edodes F-249 и AzospirШum brasilense Sp7 изучали в зависимости от стадии морфогенетиче-ского развития шиитаке: белый вегетативный мицелий, коричневая мицелиальная пленка (КМП), примордий, плодовое тело. Результаты анализа представлены в таблице. Анализируя данные таблицы, можно сказать, что количественное содержание углеводов на стадиях белого мицелия в чистой и совместной культурах, а также плодового тела при совместном культивировании с A. brasilense Sp7 выше в пиридин-растворимых фракциях мицелия, чем в аналогичных пробах водорастворимых фракций. Так, в плодовом теле пиридин-растворимых фракций мицелия присутствует глюкоза (0,82% от суммарного содержания углеводов) и мальтоза (3,58%). Этих соединений нет в водорастворимой фракции плодового тела, а содержание маннита более чем в 3 раза ниже по сравнению с пиридин-растворимой фракцией.
В мицелии во всех исследуемых нами пробах обнаружен водорастворимый полиол - маннит. При этом в совместной культуре наблюдается значительное увеличение содержания маннита по сравнению с чистой культурой. На стадии коричневой мицелиальной пленки смешанной культуры его более чем в 30 раз больше; на стадии белого мицелия и примордия - в 3 раза больше.
При рассмотрении особенностей углеводного состава шиитаке в случае плодоношения на коричневой мицелиальной пленке (результаты, ра-
нее полученные в нашей лаборатории) обращают на себя внимание выраженные количественные изменения О-маннита в зависимости от стадии морфогенеза. Содержание маннита в белом мицелии, пигментированном мицелии, мицелиаль-ной пленке и плодовом теле соотносится как 714:55:1:56 соответственно. Таким образом, маннит накапливается в белом мицелии перед плодоношением. Интересно, что те же последствия в плане изменения содержания маннита имеет низкотемпературный стресс.
Стадия плодового тела не получена в глубинной чистой культуре гриба на синтетической среде. Формирование базидиом наблюдали только в двойной культуре, что еще раз свидетельствует в пользу метода совместного культивирования L. edodes с А. brasilense Sp7 как фактора, положительно отражающегося на росте шиитаке.
Значимая часть компонентов химического состава мицелия базидиомицетов представлена ли-пидами, количество которых сильно варьирует в зависимости от условий роста [13]. Известно, что погруженный мицелий шиитаке образует до 20% липидов (плодовые тела 3-4%) [14]. Исследования жирнокислотного состава липидов L. edodes этими и другими авторами [11,15], более поздние исследования липидов других базидиомицетов [16,17] обнаружили ряд закономерностей, распространение и, возможно, универсальность которых предстоит выяснить в дальнейшем.
Исследованиям бактериально-грибной культуры предшествовало выявление изменений жирнокислотного состава общих липидов шиитаке на разных стадиях морфогенетического развития гриба. На примере штамма F-249 нами показано,
Таблица
Содержание углеводов на стадиях морфогенеза в монокультуре
Стадия роста Название углевода (О-форма) Содержание углеводов (масс. долей*106)
в пиридинрастворимой фракции мицелия в водорастворимой фракции мицелия
Монокультура L. edodes Р-249
Белый мицелий маннит глюкоза 38064 5114 11842 808
КМП маннит глюкоза фруктоза 4511 56124 2153 -
Примордий маннит глюкоза 56955 269 —
Двойная культура L. edodes Р-249 и А. brasilense Sp7
Белый мицелий маннит фруктоза 119831 37 33365 37
КМП маннит глюкоза фруктоза 142481 90320 10229 705
Примордий маннит глюкоза фруктоза 201974 68703 31898 2524
Плодовое тело маннит глюкоза мальтоза 87782 1077 45455 28289
что по мере развития вегетативного мицелия происходит постепенное снижение ненасыщенности жирных кислот, а также увеличение относительного содержания короткоцепочечных кислот [18]. На стадии образования плодовых тел отмечается заметное увеличение уровня ненасыщенных жирных кислот и отсутствие кислот с короткими цепями. Резкие изменения относительного содержания короткоцепочечных жирных кислот могут быть связаны с температурой культивирования шиитаке (развитие белого мицелия происходило при 26 оС, пигментация и образование коричневой мицели-альной пленки при 4 оС, развитие плодовых тел при 18 оС). Ранее отмечалось, что у базидиальных грибов, выращенных при низких температурах, наблюдается укорачивание ацильных цепей жирных кислот липидов [16].
Достаточно высокая для базидиальных грибов концентрация пальмитиновой кислоты С16:0 отличает I вdodвs от других ксилотрофов [14]. Основная массовая доля насыщенных жирных кислот мицелия приходится на гекса- и октадека-новую (С16:0 и С18:0). В условиях нашего эксперимента с монокультурой I. вdodвs F-249 уровень пальмитиновой кислоты (% от суммы жирных кис-
лот мицелия) изменялся от 14,3 на стадии белого мицелия до 23,8% на стадии коричневой мицели-альной пленки. В дальнейшем при образовании спорофоров I вdodвs степень насыщенности жирных кислот мицелия снижается. В совместной культуре содержание пальмитиновой и октадека-новой кислот было соответственно в 1,7 и 1,9 раз ниже по сравнению с чистой культурой гриба, то есть изменения и углеводного, и жирнокислотного состава мицелия в бактериально-грибной культуре по сравнению с монокультурой гриба оказались качественно схожи с соответствующими биохимическими изменениями мицелия перед плодоношением.
ВЫВОДЫ
Таким образом, изучение совместной культуры I вdodвs и Л. brasilвnsв позволило выявить некоторые особенности биохимического состава мицелия, характерные также для монокультуры шиитаке при переходе к генеративной стадии развития. Это явление может служить одним из аспектов объяснения обнаруженного нами стимулирующего влияния Л. brasilвnsв Sp7 на рост I вdodвs F-249.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК
1. Medicinal mushroom modulators of molecular targets as cancer therapeutics / B.-Z. Zaidman [and oth.]// Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005. Vol. 67. № 4. P. 453-468.
2. An examination of antibacterial and antifungal properties of constituents of Shiitake (Lentinula edodes) and Oyster (Pleurotus ostreatus) mushrooms / R. Hearst [and oth.] // Complementary Therapies in Clinical Practice. 2009. Vol. 15, Issue 1. P. 5-7.
3. Wasser S.P. Current findings, future trends, and unsolved problems in studies of medicinal mushrooms // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2011. Vol. 89. № 5. P. 1323-1332.
4. Bashan Y., de-Bashan L.E. How the Plant Growth-Promoting Bacterium Azospirillum Promotes Plant Growth -A Critical Assessment // Advances in Agronomy. 2010. Vol. 108. P. 77-136.
5. Steenhoudt O., Vanderleyden J. Azospirillum, a free-living nitrogen-fixing bacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and ecological aspects // FEMS Microbiology Reviews. 2000. Vol. 24, Issue 4. P. 487-506.
6. Red'kina T.V. Fungistatic Activity of Bacteria of the Genus Azospirillum // Agrokemia es Talajtan (Agrochemis-try and Soil Science). 1990. Vol. 39. № 3-4. P. 465-468.
7. Никитина В.Е. Лектины азоспирилл : свойства, биологическая активность и перспективы их практического использования : дис. ... д-ра биол. наук. Саратов, 2001. 310 с.
8. Антимикробная и регенерирующая способность биокомпонентов гриба Lentinus edodes (шиитаке) /Е.В. Милькова [и др.] // Успехи медицинской микологии / под общ. науч. ред. акад. РАЕН Ю.В. Сергеева. М. : Национальная академия микологии, 2003. Т. I. С. 284-285.
9. Никитина В.Е., Цивилева О.М., Лощинина Е.А.
Взаимоотношения ксилотрофных базидиомицетов и почвенных азотфиксирующих бактерий рода Azospirillum // Успехи медицинской микологии / под общ. науч. ред. акад. РАЕН Ю.В. Сергеева. М. : Национальная академия микологии, 2006. Т. VII. С. 293-294.
10. Пецев Н., Коцев Н. Справочник по газовой хроматографии / пер. с болг. Муллера В.М.; под ред. В.Г. Березкина, К.И. Сакодынского. М. : Мир, 1987. 260 с.
11. Growth stimulation and lipid synthesis in Lentinus edodes / C.H. Song [and oth.] // Mycologia. 1989. Vol. 81. No. 4. P. 514-522.
12. Хроматография : практическое приложение метода / пер. с англ. А.В. Родионова; ред. пер. В.Г. Берез-кин; под ред. Э. Хефтмана. М. : Мир, 1986. : 422 с.
13. Беккер З.И. Физиология и биохимия грибов. М. : Изд-во МГУ, 1988. 227 с.
14. Липидный состав плодовых тел и глубинного мицелия Lentinus edodes (Berk.) Sing. [Lentinula edodes (Berk.) Pegler]/ Е.П. Феофилова [и др.] // Микробиология. 1998. № 5. Т. 67. С. 655-659.
15. Состав и биологическая активность глубинного мицелия ксилотрофного базидиомицета Lentinus edodes / А.Г. Лобанок [и др.] // Прикл. биохимия и микробиология. 2003. № 1. Т. 39. С. 69-73.
16. О различных механизмах биохимической адаптации мицелиальных грибов к температурному стрессу: изменения в составе липидов / Е.П. Феофилова [и др.] // Микробиология. 2000. № 5. Т. 69. С. 612-619.
17. Прорастание базидиоспор Agaricus bisporus / Е.П. Феофилова [и др.] // Прикл. биохимия и микробиология. 2004. № 2. Т. 40 С. 220-226.
18. Изменение жирнокислотного состава общих липидов и лектиновой активности Lentinus edodes в процессе морфогенеза / О.М. Цивилева [и др.] // Микол. и фитопатол. 2007. № 5. Т. 41. 450-455.
Поступило в редакцию 4 июля 2012 г
