Изменения пула свободных аминокислот в плазме крови и скелетных мышцах крыс при прерывистой алкогольной интоксикации Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 577.122.3:612.11:611.73:612.821.44

ИЗМЕНЕНИЯ ПУЛА СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ В ПЛАЗМЕ КРОВИ И СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦАХ КРЫС ПРИ ПРЕРЫВИСТОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ

ИНТОКСИКАЦИИ В. В. Лелевич, Ю.А. Тарасов, С. В. Лелевич, В .Ю. Смирнов

УО «Гродненский государственный медицинский университет»

Проведено исследование пула свободных аминокислот в плазме крови и скелетных мышцах крыс при различных режимах алкоголизации. Прерывистая алкогольная интоксикация характеризовалась снижением ряда аминокислот в плазме крови и их дисбалансом в скелетных мышцах. Показано наличие общих закономерностей развития метаболических нарушений при поступлении этанола в организм.

Ключевые слова: крысы, прерывистая алкогольная интоксикация, плазма крови, скелетные мышцы, свободные аминокислоты.

Алкогольная интоксикация приводит к поражению различных органов и систем. Регистрируются нарушения со стороны сердечно-сосудистой системы, желудочно-кишечного тракта, головного мозга и периферической нервной системы [7]. Анализ клинического материала свидетельствует о значительной вариабильности биохимических изменений при синдроме мышечной слабости у лиц, злоупотребляющих алкоголем. При этом выделяют две основные формы поражения мышц, вызванные алкогольной интоксикацией: острую и хроническую алкогольную миопатию.

Острая алкогольная миопатия развивается в результате токсического действия алкоголя у 1-5% лиц и проявляется слабостью (преимущественно проксимальных групп мышц с резкой болезненностью и отеком), значительным повышением в крови активности креатинфос-фокиназы (КФК) и миоглобинурией. При морфологическом исследовании выявляется некроз различных типов волокон скелетных мышц (рабдомиолиз), ассоциирующийся с высоким риском развития острой почечной недостаточности [3].

Хроническая алкогольная миопатия - часто встречающаяся (до 60%) клиническая форма и проявляющаяся слабостью мышц тазовой области, иногда плечевого пояса, затруднениями при ходьбе и болезненными судорогами мышц. Учитывая выраженный полиморфизм поражения скелетных мышц при различных формах алкоголизации, предложен собирательный термин - алкоголь-индуцированное поражение мышц (АИПМ), включающий в себя все клинические формы алкогольной миопа-тии, развивающиеся на фоне различных видов алкогольной интоксикации [16].

Однократное или хроническое поступление этанола в организм приводит к изменениям практически всех обменных процессов, в том числе и метаболизма аминокислот [6, 12]. Аминокислоты, являясь исходным материалом для биосинтеза белков и высокоактивных биологических соединений, играют также роль посредников, связывающих основные метаболические пути: гликолиз, цикл трикарбоновых кислот, глюконеогенез. В некоторых метаболических ситуациях использование аминокислот, как энергетического субстрата, более предпочтительно, т.к. они напрямую поступают в ЦТК и их биохимические пути превращения наиболее выгодны для организма [13]. Несмотря на большое количество экспериментального и клинического материала, сведения о характере аминокислотного пула скелетных мышц при прерывистой алкоголизации практически отсутствуют. Между тем, периодический способ употребления значительных количеств алкоголя наиболее распространен, что и предопределило цель данного исследования - изучение изме-

нений состояния аминокислотного пула в плазме крови и скелетных мышцах при различных режимах прерывистой алкоголизации.

Материалы и методы исследования

Эксперименты выполнены на белых крысах-самцах с исходной массой 180-220 г. Животные (по 8 особей в группах) находились на стандартном рационе вивария со свободным доступом к воде. При проведении опытов соблюдали правила гуманного обращения с животными. Для выполнения в дальнейшем корректной статистической обработки результатов опытные группы имели свои контроли. Группу «контроль 1» использовали для сравнения с показателями опытной группы, животным которой в желудок вводили 25% водный раствор этанола в дозе 3,5 г/кг массы тела 2 раза в день через 12 часов в течение 4 суток. Далее, в течение 3 суток, - эквиобъем-ное количество воды. Такой цикл повторялся 4 раза -группа прерывистой алкогольной интоксикации «ПАИ, 4 сут.». Группу «контроль 2» использовали для сравнения с экспериментальной группой, особям которой аналогично вводили алкоголь, но уже в течение 7 суток. Затем 7 суток вводили изообъемное количество воды. Данный цикл повторялся дважды - группа «ПАИ, 7 сут.». Контрольным животным вводили воду. Длительность эксперимента в первом и втором случаях составила 28 суток. Последние 12 часов перед декапитацией животные находились при пищевой депривации с доступом к воде. Кровь собирали в гепаринизированные пробирки, полученную плазму использовали для дальнейших исследований. Ткани незамедлительно замораживали в жидком азоте. Определяли содержание свободных аминокислот и их производных (41 показатель) на высокоэффективном жидкостном хроматографе «Agilent 1200» [2], спектр биохимических показателей в плазме - с помощью биохимического анализатора «Conelab30i», активность аланинаминотрансферазы - модифицированным кинетическим методом [17]. Содержание кортикостеро-на в плазме - методом высокоэффективной жидкостной хроматографии [11].

При статистической обработке данных нормальность распределения оценивали по критерию Колмогорова-Смирнова с поправкой Лиллиефорса. Установлена нормальность распределения выбора. В этой связи межгрупповые различия оценивали методами параметрической статистики.

Результаты и обсуждение

После прерывистой алкогольной интоксикации в плазме крови животных (табл. 1) группы «ПАИ, 4 сут.», из всего исследованного пула свободных аминокислот и их производных снизились уровни карнозина, оксипроли-

Оригинальные исследования

на, цистеиновой кислоты и повысилось содержание □ -аланина. В плазме крыс группы «ПАИ, 7 сут.» снизились уровни аспарагина, глутамина, этаноламина, оксипро-лина и 1-метилгистина. В этой же группе, при сравнении с показателями группы «ПАИ, 4 сут.», в плазме снизилось содержание аспарагина, □ -аланина, валина, этаноламина и повысилось - цистеиновой кислоты. Из индексов структуры аминокислотного фонда плазмы (табл. 2) снизился коэффициент соотношения аминокислот с разветвленной углеродной цепью / ароматические аминокислоты (АРУЦ/ААК) в группе животных «ПАИ, 7 сут.», возможно, за счет низкого (59,2% от контроля) содержания валина (табл. 1). Ранее аналогичное снижение концентрации АРУЦ в плазме крыс выявлено при синдроме отмены этанола [8]. В свою очередь, снижение содержания аминокислот с разветвленной углеродной цепью в плазме, подтверждаемое более низким коэффициентом соотношения АРУЦ/ААК (антитоксический индекс печени, индекс Фишера), является косвенным свидетельством нарушения функции печени [1].

Из других биохимических показателей в плазме (табл. 3), выше контрольных значений оказался уровень глюкозы в группе животных «ПАИ, 7 сут.». Рост уровня мочевины («ПАИ, 4 сут.» - 82,5%, «ПАИ, 7 сут.» - 112%) в плазме, интерпретируемый как степень интенсификации катаболизма белков [6, 9], предполагает использование аминокислот в синтезе глюкозы через глюкозо-аланино-вый шунт [13]. К тому же отмечено, что при алкогольном абстинентном синдроме появляется тенденция к развитию гипергликемии [10]. В свою очередь, рост активнос-

Таблица 1 - Содержание свободных аминокислот и их производных в плазме (мкмоль/л) крыс при прерывистой интоксикации алкоголем (в желудок 25% раствор этанола, 3,5 г/кг,

Примечание: * - р <0,05 по отношению к соответствующему по сроку контролю. # - р <0,05 по отношению к показателю группы «ПАИ, 4 сут.», оцениваемая методом 2-факторного дисперсионного анализа. Приведены только показатели со статистически значимыми различиями

Таблица 2 - Индексы структуры аминокислотного фонда плазмы крови крыс при прерывистой интоксикации алкоголем (в желудок 25% раствор этанола, 3,5 г/кг, 2 раза в сутки; 4 цикла / 4 дня -«ПАИ, 4 сут.» и 2 цикла / 7 дней - «ПАИ, 7 сут.»)

ти АлАТ в крови крыс (в % от соответствующего контроля: «ПАИ, 4 сут.» - 88,5%, «ПАИ, 7 сут.» - 107%) как показатель повреждения мембран гепатоцитов, возможен через усиление синтеза фермента под действием глюкокортикоидов и может означать не что иное, как готовность биологических систем трансаминировать ала-нин в пируват [10], для синтеза глюкозы (глюконеогенез). В группе «ПАИ, 7 сут.» это подтверждает высокая концентрация глюкозы в крови (табл. 3). Кроме того, известно, что нагрузка этанолом активирует адренокортикаль-ную систему [5], а в данном случае содержание кортико-стерона в крови крыс этой группы, по сравнению с соответствующим контролем, спустя 7 суток от последней алкогольной нагрузки продолжает оставаться на уровне 137,3% (табл. 3).

Известно [14, 15], что этанол и ацетальдегид оказывают прямое повреждающее действие на скелетную мускулатуру за счет активации процессов перекисного окисления липидов. Показано, что хроническая алкогольная интоксикация сопровождается снижением содержания белков в скелетных мышцах [3] за счет уменьшения биосинтеза и усиления деградации [14]. Следствием этих двух процессов становится повышение фонда свободных аминокислот в ткани. В данном исследовании, после прерывистой алкогольной интоксикации крыс группы «ПАИ, 4 сут.», в мышцах возрастает содержание цистатионина и цистеинсульфоновой кислоты, а в группе «ПАИ, 7 сут.» - фосфоэтаноламина и 1-метилгистидина (табл. 4). При сравнении пула аминокислот опытных групп (табл. 4), в мышцах крыс группы «ПАИ, 7 сут.» более высокой оказалась концентрация оксилизина. Рост концентрации 1-метилгистидина и оксилизина свидетельствует об усилении процессов протеолиза белков, что происходит обычно при миопатиях критических состояний [3]. Индексы структуры аминокислотного фонда в мышцах исследованных групп крыс не различались (табл. 5).

Выявленные изменения пула свободных аминокислот плазмы крови и мышц, некоторых биохимических показателей плазмы свидетельствуют об этанол-индуци-рованных начальных этапах развития патологических процессов в миоцитах. Это позволяет полагать, что продолжение циклов алкоголизации может вести к дальнейшей деградации мышечных белков, усилению метаболического дисбаланса и изменению основных гомеостати-ческих параметров организма.

Таким образом, анализируя данные, полученные в экспериментах с прерывистой алкоголизацией крыс, которая рассматривается как чередование различных по длительности периодов алкогольной интоксикации и абстиненции [4], можно сделать следующие выводы. 1. По индексам структуры фонда аминокислот плазмы более негативное влияние алкогольная интоксикация оказала в группе «ПАИ, 7 сут.», т.к. здесь произошло снижение ко-

Таблица 3 - Некоторые биохимические показатели плазмы крови при прерывистой интоксикации алкоголем (в желудок 25% раствор этанола, 3,5 г/кг, 2 раза в сутки; 4 цикла / 4 дня - «ПАИ, 4 сут.» и 2

Показатели Контроль 1 к ПАИ, 4 сут. ПАИ, 4 сут. Контроль 2 к ПАИ, 7 сут. ПАИ, 7 сут.

Сумма протеи- ногенных аминокислот 4663 ± 160 4727±248 5381±196 4864±287

АРУЦ /ААК 2,61 ± 0,08 2,51 ± 0,09 2,89 ± 0,17 2,32±0,12*

Заменимые / незаменимые аминокислоты 0,787 ± 0,0259 0,803 ± 0,0407 0,823 ± 0,0320 0,839 ± 0,0401

Гликогенные / кетогенные аминокислоты 1,54 ± 0,05 1,59 ± 0,08 1,63 ± 0,08 1,76 ± 0,10

Примечание: * - р<0,05 по отношению к соответствующему по сроку контролю

цикла / 7 дней - «ПАИ, 7 сут.»)

Показатели Контроль 1 к ПАИ, 4 сут. ПАИ, 4 сут. Контроль 2 к ПАИ, 7 сут. ПАИ, 7 сут.

Глюкоза, ммоль/л 7,28 ± 0,11 7,21 ± 0,17 7,84± 0,24 8,71±0,29*

Мочевина, ммоль/л 5,68 ± 0,38 4,69 ± 0,31 4,76 ± 0,37 5,33 ± 0,23

АлАТ, Ед/л 62,7 ± 3,94 55,5 ± 5,75 69,4 ± 5,24 74,0 ± 2,30

Кортикостерон, нмоль/л 1660,9± 258,3 1685,9± 189,1 1452,2± 294,9 1998,3± 197,1

Примечание: * - р <0,05 по отношению к соответствующему по сроку контролю

2 раза в сутки; 4 цикла / 4 дня - «ПАИ, 4 сут.» и 2 цикла / 7 дней -«ПАИ, 7 сут.»)____

Показатели Контроль 1 к ПАИ, 4 сут. ПАИ, 4 сут. Контроль 2 к ПАИ, 7 сут. ПАИ, 7 сут.

Аспарагин 50,3 ± 1,6 50,8 ± 1,7 56,1 ± 2,1 47,0 ± 2,3*#

Валин 162,0±12,0 167,4±10,6 186,6±11,1 110,4±34,0#

Глутамин 259,0 ± 8,3 265,4 ± 8,2 313,1 ± 11,7 267,0±17,4*

Карнозин 32,1 ± 8,8 10,3 ± 2,6* 66,2 ± 23,3 29,3 ± 7,9

Оксипролин 18,2 ± 0,5 15,7 ± 1,1* 19,7 ± 0,9 15,7 ± 1,3*

Цистеиновая 0,501± 0,330± 0,482± 0,567±

кислота 0,068 0,030* 0,022 0,081#

Этаноламин 18,9 ± 1,1 19,5 ± 2,2 22,0 ± 1,8 16,2 ± 1,0*#

□ -аланин 4,51 ± 0,25 5,68 ± 0,40* 6,07 ± 0,63 5,15 ± 0,28#

1-метил- 1,96 ± 0,16 1,68 ± 0,33 2,26 ± 0,34 1,69 ± 0,10*

гистидин

Оригинал'ь н ые исследования

Таблица 4 - Содержание свободных аминокислот и их производных в скелетных мышцах (нмоль/г) крыс при прерывистой интоксикации алкоголем (в желудок 2,5% раствор этанола, 3,5 г/кг, 2 раза в сутки; 4 цикла / 4 дня - «ПАИ, 4 сут.» и 2

Примечание: * - р <0,05 по отношению к соответствующему по сроку контролю. # - р <0,05 по отношению к показателю группы «ПАИ 4 сут.», оцениваемая методом 2-факторного дисперсионного анализа. Приведены только показатели со статистически значимыми различиями.

Таблица 5 — Индексы структуры аминокислотного фонда скелетных мышц крыс при прерывистой интоксикации алкоголем (в желудок 25% раствор этанола, 3,5 г/кг массы, 2 раза в сутки; 4 цикла /4 дня - «ПАИ, 4сут.» и 2 цикла / 7 дней «ПАИ, 7 сут.»)

эффициента соотношения АРУЦ/ААК, свидетельствующее о нарушении функции печени. 2. Более выраженный дисбаланс аминокислотного пула плазмы произошел также в группе «ПАИ, 7 сут.». 3. В скелетных мышцах, на фоне стабильных индексов структуры фонда аминокислот, в группе «ПАИ, 7 сут.» произошло повышение уровня 1-метилгистидина и концентрации оксилизина (28,7% от контроля - «ПАИ, 4 сут.», 102,7% - «ПАИ, 7 сут.»), что можно рассматривать как свидетельство активизации протеолиза белков в миоцитах.

Список использованной литературы

1. Адаменко, Е.И. Характеристика спектра свободных аминокислот сыворотки крови у больных циррозом печени / Е.И. Адаменко, Н.Н. Силивончик, О.И. Попова и др. // Весщ НАН Беларуси Сер. мед. навук. - 2005. - № 2 - С. 63-68.

2. Дорошенко, Е.М. Методологические аспекты и трудности анализа свободных (физиологических) аминокислот и родственных соединений в биологических жидкостях и тканях / Е.М. До-

рошенко [и др.] // Сборник тезисов Республиканской научной кон -ференции по аналитической химии с международным участием «Аналитика РБ-2010» - Минск, 2010. - С. 126.

3. Зиновьева, О.Е. Алкогольная миопатия / О.Е. Зиновьеав, Б.С. Шенкман // Неврологический журнал. - 2007. - № 5. - С. 48.

4. Лелевич, В.В. Новые подходы в моделировании алкогольной интоксикации / В.В. Лелевич, А.Н. Бородинский, О.В. Арте-мова и др. // Современные аспекты изучения алкогольной и наркотической зависимости. Материалы международного симпозиума. Научн. ред. В.В. Лелевич. - Гродно, 2004. - С. 86-90.

5. Михайлов, В.И. Влияние острой и хронической алкогольной интоксикации на секрецию гормонов и регуляцию углеводного обмена / В.И. Михайлов, В.И. Ревенко, Г.Ф. Ракицкий и др. /

/ Вестник неврол., психиатр. и нейрохирургии. - 2009. - № 4. -С. 61-64.

6. Островский, Ю.М. Аминокислоты в патогенезе, диагностике и лечении алкоголизма / Ю.М. Островский, С.Ю. Островский. - Минск, 1995.

7. Пауков, В.С. Алкоголизм и алкогольная болезнь / В.С. Пауков, Н.Ю. Беляева, Т.М. Веронина // Терапевтический архив. -2001. - Т. 73, № 2. - С. 65-67.

8. Разводовский, Ю.Е. Влияние тавамина и гепатила на фонд свободных аминокислот плазмы крови при синдроме отмены этанола / Ю.Е. Разводовский, В.Ю. Смирнов, Е.М. Дорошенко, В.М. Шейбак // Весщ НАН Беларуси Сер. мед. навук. - 2006. - № 1. -

C. 49-52

9. Рослый, И.М. Биохимия и алкоголизм (III): длительная алкоголизация как механизм развития белковой дистрофии / И.М. Рослый, С.В. Абрамов, В.Р. Агаронов и др. // Вопросы наркологии. - 2004. - № 4. - С. 70-80.

10. Рослый, И.М. Биохимия и алкоголизм (IV): типовые клин ико-би охим иче ски е си нд ромы при хрони ческой алкогольной интоксикации / И.М. Рослый, С.В. Абрамов, В.Р. Агаронов и др. /

/ Вопросы наркологии. - 2004. - №5. - С. 46-56.

11. Чумаченко, С.С. Функциональная активность адренокор-ти ка льной системы и связыв аю ща я спо собн ость тран скорти на плазмы крови крыс при развитии толерантности к наркотическому действию этанола / С.С. Чумаченко, Ю.А. Тарасов, Л.И. На-дольник // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2000. - № 3. - С. 14-17.

12. Шейбак, В.М. Обмен свободных аминокислот и КоА при алкогольной интоксикации / В.М. Шейбак. - Гродно: ГрГМУ, 1998.

13. Эллиот, В. Биохимия и молекулярная биология / В. Эллиот, Д. Эллиот. - Москва, 1999.

14. Lang, C. Alcohol impairs leucine-mediated phosphorilacion of 4E-BPI, S6KI, elF4G and mTOR in skeletal muscle / C. Lang, R. Frost, N. Deshpande et al. // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. -2003. - Vol. 285. - P. E1205-E1215.

15. Mantle, D. Effect of ethanol and acetaldehyde on intracellular protease activities in human liver, brain and muscle tissues in vitro /

D. Mantle, G. Falkous, T. Peters, V. Preedy // Clin. Chim. Acta. -1999. - Vol. 281. - P. 101-108.

16. Preedy, V.R. Alcoholic skeletal muscle myopathy: definition, fea tu res, contribu tion of neuropa thy, impa ct a nd dia gnosis / V.R. Preedy, J. Addachi, Y. Ueno et al. // Eur. J. Neurol. - 2001. - Vol. 8. -P. 677-687.

1 7 . Schu mann, G . N ew IFCC reference procedu res for the determina tion of ca ta lytic activity concentra tions of five enzymes in serum: preliminary upper reference limits obtained in hospitalized subjects / G. Schumann, R. Klauke // Clin. Chem. Acta. - 2003. - Vol. 327, N 1-2. - P. 69-79.

цикла / 7 дней - «ПАИ, 7 сут.»)

Показатели Контроль 1 к ПАИ, 4 сут. ПАИ, 4 сут. Контроль 2 к ПАИ, 7 сут. ПАИ, 7 сут.

Фосфоэтаноламин 101,6 ± 10,0 134 ± 26,9 77,1 ± 13,7 122,9 ± 13*

Цистатионин 88,5 ± 12,4 151,9 ± 26,2* 233,0 ± 66,9 330,8 ± 181

Цистеиновая кислота 3,01 ± 0,16 4,35 ± 0,54* 5,20 ± 0,48 7,99 ± 2,77

1-метилгистидин 3,84 ± 0,77 4,21 ± 0,88 3,28 ± 1,1 6,50 ± 1,1*

Оксилизин 64,5 ± 17,1 18,5 ± 7,1* 50,3 ± 6,5 53,9 ± 0,6#

Показатель Контроль 1 К ПАИ 4 сут. ПАИ 3 сут. Контроль 2 К ПАИ 7 сут. ПАИ 7 сут.

Сумма протеи- ногенных аминокислот 14716± 1168 15142± 1728 18851± 1132 18351± 2137

АРУЦ/ААК 2,88 ± 0,13 2,86 ± 0,12 2,76 ± 0,09 2,72 ± 0,17

Заменимые/ незаменимые аминокислоты 6,34 ± 0,36 6,33 ± 0,36 7,38 ± 0,46 7,09 ± 0,49

Гликогенные/ кетогенные аминокислоты 16,0 ± 1,4 14,9 ± 1,0 18,6 ± 1,4 19,8 ± 2,3

Alteration of free amino acids pool in blood plasma and skeletal muscles of rats at interrupted alcohol intoxication V.V. Lelevich, Yu.A. Tarasov, S.V. Lelevich, V.Yu. Smirnov EE «Grodno State Medical University»

The investigation of the contents offree amino acids pool ssin blood plasma and skeletal muscles of rats at different types of alcohol administration has been performed. Interrupted alcohol intoxication was characterized by the diminishing of some amino acids in plasma and changes in their contents in muscles. The general patterns in the development of metabolic disturbances caused by ethanol intake have been shown.

Key words: rats, interrupted alcohol intoxication, blood plasma, skeletal muscles, free amino acids.

Поступила 09.02.2012