Изменения продукции цитокинов, популяционного состава и функциональной активности лимфоцитов у детей с муковисцидо3ом Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Мед и ц ипская иммунол огня 1999, Т. 1, N° 5, стр 67-70 © 1999, СПб РО РААКИ

Краткие сообщения

ИЗМЕНЕНИЯ ПРОДУКЦИИ цитокинов, ПОПУЛЯЦИОННОГО СОСТАВА И ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ У ДЕТЕЙ С МУК0ВИСЦИД030М

Осипенко A.JI.*, Пигарева Н.В., Котов А.Ю., Алферов В.П.*, Симбирцев А.С.

*Сапкт - Петербургская медицинская академия последипломного образования,

ГНЦ НИИ особо чистых биопрепаратов, Санкт-Петербург

Резюме. Хроническое воспаление в бронхолегочной системе при муковисцидозе (MB) ведет к нарушениям развития иммунных реакций па уровне организма. Целью настоящей работы явилась оценка изменений показателей иммунитета у больных MB. В связи с этим было проведено исследование иммунного статуса у 25 дегей, больных MB различной степени тяжести, в периоде обострения бронхолегочного процесса, в возрасте от 2 до 14 лет. Период обострения хронического бронхолегочного процесса у больных MB характеризовался снижением показателей клеточного иммунитета, что выражалось и уменьшении относительного количества Т-хелперон, снижении пролиферативной активности лимфоцитов на фоне низкой продукции IL-2. В то же время активный воспалительный процесс в легких сопровождался высоким уровнем спонтанной и индуцированной продукции провоспалительпых цитокинов, увеличением количества В-лимс)юцитов, натуральных киллеров, количества лимфоцитов, экспрессирующих активационные маркеры. Таким образом, воспалительный процесс развивался па ([юпе снижения показателей иммунитета. У больных с тяжелым течением заболевания по сравнению с летим и среднетяжелым течением выявлено прогрессивное снижение уровня индуцированной продукции IL-ip, снижение относительного количества Т-хелперов и количества лимфоцитов, экспрессирующих CD25, HLA-DR антигены, высокая пролиферативная активность В-лимфоцитов и Т-лимфоцитов па малые дозы ФГА.

Ключевые слова: муковисцидоз, дети, цитокины, лимфоциты

Osipenko A.L., Pigarevci N.V., Kotov A.U., Alferov V.P., Simbiitsev AS.

CHANGES IN CYTOKINE PRODUCTION, LIMPHOCYTE SUBPOPULATIONS AND LIMPHOCYTE PROLIFERATIVE ACTIVITY IN CHILDREN WITH CYSTIC FIBROSIS

Abstract. Chronic pulmonary inflammation in patients with Cystic Fibrosis (CF) promotes changes in systemic immunologic reactions. The aim of this study was to evaluate changes of immune status in children with CF. In this connection research of immune status in 25 children aged 2 to 14 with CF with acute pulmonary exacerbation was done. Patients with CF with acute pulmonary exacerbation had decrease of the peripheral blood CD4+ lymphocyte subpopulation and proliferative activity of lymphocytes. At the same time active inflammatory pulmonaty process in patients with CF was accompanied with high level of spontaneous and induced production of proinflammatory cytokines, increase of the CD201 lymphocyte subpopulation, natural killer cells and lymphocytes expressing activation markers CD25, HLA-DR. Patients with severe CF in comparison with light and moderate CF had progressive decrease of induced IL-ip production, the CD4* lymphocyte subpopulation and numbers of cells expressing activation markers CD25, HLA-DR, high proliferative activity of B-lymphocytes and T-lymphocytes in response to PHA. (Med. Immunol., 1999, vol.1, N5, pp.67-70)

Муковисцидоз (MB) - мопогенное заболевание, риппых желез жизненно важных органов и систем и

обусловленное мутацией гена трансмембранного ре- имеющее обычно тяжелое течение и неблагонрият-

гулятора MB, характеризующееся поражением экзок- ный прогноз [2J. Результатом нарушения мукоцили-

-------------------------------------------- арного клиренса является колонизация бактериаль-

Адрес для переписки: 197110, С-Петербург, Пудожская ул., IIOfj флорой С последующим развитием хропическо-

7 ГосНИИ особо чистых биопрепаратов г0 прогрессирующего инфекционного процесса в лег-

Теп. 230 48 88; Факс 230 49 48; E-mail: sim@inshpb.spb.su

ких [4,5]. Для МВ характерен "нснтрофильный” тип воспаления, которое сопровождается высоким уровнем в тканях и бронхиальном секрете провоспали-тельных цитокинов 11,-1, ТЫР-а, 1Ь-8 [9]. Активированные нейтрофилы также способны синтезировать и секретировать медиаторы воспаления, способные непосредственно повреждать легочную паренхиму, обусловливая непрерывное прогрессирование хронического воспалительного процесса [14]. Хроническое воспаление при МВ ведет к нарушениям развития иммунологических реакций на уровне организма, что становится дополнительным фактором патогенеза поражения легких. В связи с этим целью настоящей работы явилась оценка изменений показателей иммунитета у больных МВ.

Материалы и методы

Были обследованы 25 детей: 14 мальчиков и 11 девочек больных МВ, в возрасте от 2 до 14 лет. Смешанная (легочно-кишечная) форма диагностирована у 21 ребенка (84%), преимущественно кишечная - у 3 детей (12%), преимущественно легочная - у 1 ребенка (4%). Заболевание чаще всего начиналось в периоде новорожденное™ - у 53%, на первом году жизни - у 35%, после года - у 12%. На основании клинической оценки по шкале Швахмана-Брасфильда, особенностей высеваемой флоры в мокроте, длительности ан-тибиотикотерапии, наличия осложнений (цирроза печени, легочной гипертензии) были выделены следующие группы больных: 1-ю группу составили дети с легким течением МВ (п”7), 2-ю группу-со средней степенью тяжести (п=9),3-ю группу- с тяжелым течением (п“9). Контрольную группу составили 23 ребенка, не имевшие на момент обследования и в течение месяца проявлений острых инфекций, заболеваний и обострений хронической патологии.

Продукция 1ИР, 1Ь-8 лейкоцитами крови в культуре определялась с использованием тест-систем, разработанных ТОО “Цитокии” (Санкт-Петербург), основанных на “сэндвич"-методе твердофазного имму-ноферментиого анализа [3]. Продукция 1Ь-2 определялась методом биологического тестирования с использованием 1Ь-2-зависимой клеточной линии СТи_-2 [8]. Изучение иммунного статуса включало: оценку популяционного состава лимфоцитов периферической крови СБЗ*, СБ4\ С08+, СБ20\ СБ25\ НЬА-ОИ*, СБ16* клеток в комплемент-зависимом лимфоцитотоксическом тесте [13]. При проведении теста использовались моноклональные антитела фирмы “Медбиоспектр” (Москва). Пролиферативная активность лимфоцитов оценивалась в реакции бласт-граисформации (РБТЛ) по интенсивности включения НЗ-тимидина под действием фитогемагглюти-нина (ФГА) и митогена лаконоса (МЛ).

Результаты и обсуждение

При анализе уровня провоспалительных цитоки-иов у больных МВ различной степени тяжести нами было выявлено, что спонтанная и индуцированная продукция 1Ь-8 клетками периферической крови была значительно выше по сравнению с контрольной группой (табл.1). При этом уровень индуцированной продукции зависел от тяжести течения заболевания (г=0,926, р<0,001). Содержание 1Ь-8 в сыворотке крови находилось примерно на одном уровне и не зависело от тяжести течения заболевания. При легком и среднетяжелом течении уровень П.-8 в сыворотке был равен 50,0+10,6 пг/мл и48,7±10,7 пг/мл, соответственно, при тяжелом течении - 70,0±20,3 пг/мл.

1Х-8, продуцируемый как эпителиальными клетками дыхательных путей, так и альвеолярными макрофагами, выполняет роль доминирующего хе-моаттрактанта для нейтрофилов при МВ [10]. Доказано повышенное содержание 1Ь-8 в мокроте, в жидкости бронхоальвеолярного ланажа и в сыворотке крови у больных МВ, выявлена прямая корреляция его уровня в мокроте с тяжестью бронхолегочных поражений [6,12].

Уровень спонтанной продукции 1Ь-1(3 клетками периферической крови у больных МВ достоверно превышал его уровень у здоровых детей (р<0,01). Выявлена обратная зависимость уровня спонтанной продукции 1Ь-1Р от тяжести течения заболевания (г = -

0,896, р<0,001). Как видно из данных, представленных в табл.1, при легком и среднетяжелом течении заболевания также имело место достоверное повышение уровня индуцированной продукции 1Ь-1(3 по сравне-

Таблица 1. ПРОДУКЦИЯ ЦИТОКИНОВ ЛЕЙКОЦИТАМИ КРОВИ В КУЛЬТУРЕ У БОЛЬНЫХ С МВ.

Показатель ГРУППА ОБСЛЕДУЕМЫХ ДЕТЕЙ

Легкое течение МВ Среднетяжелое течение МВ Тяжелое течение МВ Контроль

и-ір Спонтанная (пг/мл) Индуцирован. (пг/мл) 27531532** 6463+1532* 268311353* 76531975*' 10731268* 3353±907А 4031116 3963+576

1-8 Спонтанная (пг/мл) Индуцирован. (пг/мл) 6710±2440* 1460012520* 7560±990* 1860013830* 842012190* 1710012660* 18801183 700011220

1-2 Спонтанная (ед/мл) Индуцирован. (ед/мл). 0 2,6210,59** 0 5,26±1,53** 0 5,4311,45** 0 11,711,42

* - достоверные различия с контрольной группой л - достоверные различия между группами *;Л - р<0,05 **;ля - р<0,001

нию с тяжелым течением МВ (р<0,05) и контрольной группой (р<0,05). Уровень IЬ-13 в сыворотке больных МВ не зависел от тяжести течения заболевания и достоверно не отличался от контрольной группы (при легком течении уровень 1Ь-1Р в сыворотке был равен 19,7±13,6 пг/мл, при среднетяжелом - 6,25±4,2 пг/мл, при тяжелом течении - 0 пг/мл, в контроле - 0 иг/ мл).

Аналогичные данные приводятся в работе КгопЬогйе(:. а!.(1993), где было показано, что у больных МВ уровень циркулирующих провоспалитель-11ых цитокинов (1Ь-1(3, 1Ь-6, ТЫР-а) был низким, практически неопределяемым. При этом имела место высокая концентрация этих цитокинов в мокроте [11]. Возможно, при МВ синтез провоспали-тельных цитокинов осуществляется главным образом клетками очага воспаления и при обострении бронхолегочного процесса они имеют важное значение при развитии местного воспаления. Практически у всех обследуемых больных отсутствовали системные реакции (лихорадка, нейтрофилез), опосредованные 1Ь-1. Вероятно, низкий уровень 1Ь-1(3 в сыворотке крови сочетается с повышенным содержанием в сыворотке неспецифических и специфических ингибиторов цитокинов, в частности растворимого рецепторного антагониста 1Ь-1 (1Ь-111А), что характерно для хронического воспаления [7].

У всех обследуемых больных нами выявлено увеличение абсолютного и относительного количества лимфоцитов в периферической кропи по сравнению с контрольной группой (табл.2). При оценке популяционного состава лимфоцитов имело место снижение относительного количества Т-лимфоцитов (С03‘), которое зависело от тяжести течения заболевания (г = -0,522, р<0,05) и было обусловлено снижением содержания С04*-хелиеров. Относительное количество С08+-цитотоксичсских лимфоцитов достоверно не отличалось от контрольной группы. Описанные различия в содержании регуляторных субпопуляций лимфоцитов в зависимости от тяжести течения заболевания обусловливают различия в значениях соотношения CDA/CDЯ, пониженного у больных с тяжелым течением заболевания (1,0±0,07) по сравнению с легким (1,13±0,09), среднетяжелым течением (1,2±0,06) и контрольной группой (1,3±0,07). Повышение относительного и абсолютного количества В-лимфоцитов (С020‘) и натуральных киллеров (СШ6*) отмечено у всех больных по сравнению со здоровыми детьми (р<0,001). Относительное и абсолютное количество клеток, экспрессирующих активационные маркеры С025, НЬА-БК было значительно выше у детей с МВ по сравнению с контролем, при этом нами выявлена обратная корреляционная взаимосвязь с тяжестью течения заболевания (г=-0,723, р<0,01; г=-0,885, р<0,001, соответственно).

Таблица 2. СОДЕРЖАНИЕ СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ

Показатель Группа обследуемых детей

Легкое течение МВ Среднетажел. теч. МВ Тяжелое течение МВ Контроль

ЛейкоцишКЯ/мл 7,9±0,99 8,1710,43* 9,8111,16** 6,7610,34

Лимфоциты Относит.(%) Абсол. (мм1) 49,3±4,18** 40631791* 55,514,25** 23201269* 44,813,45 42501332** 38,8+1,71 25401162

соз’ Относит.(%) Абсол. (мм1) 51,1+1,55* 2090±442 50,311,03* 23201269* 45,911,52*** 19731194* 58,011,67“ 1630И67

СМ ОТ110СИТ.(%) Абсол. (мм1) 26,1 ±1,16* 1070±109 2611,15* 12201164* 24,311,65* 10401117* 31,311,76 7981109

С08* Относит. (%) Абсол. (мм!) 23,3±0,9 935±173 21,111,84 991+157* 21,110,7 907186,3* 24,411,55 632158,6

С04/С08 1,13±0,09 1,210,06 1,010,07 1,3510,08

С020* Отнош\(%) Абсол. (мм1) 24,911,5** 10001191** 2311,61** 10801146** 24,111,3** 10301113** 12,910,75 333+29,7

С016* Относит.|%) Абсол. (мм1) 20±1,54** 747181,3** 17,111,1* 798+113** 19,311,12** 808175,1** 13,511,22 362+47,1

С025* 0тносит.(%) Абсол. (мм1) 2712,1**“ 10901257* 2212,12*“ 11201222** 23,712,32*“ 10301153** 16,2+1,2 426147,5

Н1А-0Р* Относит.(%) Абсол. (мм1) 28,711,84**" 1150+217** 23,210,75**'' 11001126** 23,812,12*“ 10401151** 16,911,26 451152,9

* - достоверные различия с контрольной группой л - достоверные различия между группами *;Л - р<0,05 **;ЛЛ - р<0,005

На фоне дефицита Т-хелперов, которые являются основными клетками продуцирующими 1Ь-2, выявлен достоверно низкий уровень продукции ИЛ-2 моно-нуклеарами периферической крови в ответ на стимуляцию по сравнению с контрольной группой (табл.1). 1Ь-2 является ключевым фактором развития иммунного ответа, поскольку он стимулирует пролиферацию Т- и В- лимфоцитов, вызывает функциональную активацию клеток [1]. Таким образом, уровень 1Ь-2 отражает пролиферативную способность лимфоцитов в культуре. При легком и среднетяжелом течении МВ пролиферативный ответ Т-лимфоцитов а РБТЛ на ФГА в концентрации 2,5 мкг/мл был достоверно снижен по сравнению с контрольной группой (р<0,005). При легком течении МВ индекс пролиферации Т- лимфоцитов был равен 5,83±1,55, при средней степени тяжести - 6,91±1,24, в контрольной группе - 16,4±2,46 (см.табл.З). При тяжелом течении МВ пролиферативная активность Т- лимфоцитов на малые дозы митогепов достоверно не отличалась от контроля. При использовании высоких доз митогенов (ФГА в концентрации 15 мкг/мл) наблю-

Таблица 3. ИНДЕКСЫ СТИМУЛЯЦИИ ВЛАСТНОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ ЛИМФОЦИТОВ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ЛЕКТИНОВ

Группа Индекс стимуляции

обследуемых детей ФГА 2,5 мкг/мл ФГА 15,0 мкг/мл МЛ 5,0 мкг/мл

Легкое течение МВ 5,83+1,55**А 41,3+5,64* 5,74+1,02**

Среднетяжел. Течение МВ 6,91+1,24**' 46,4+4,99* 6,15+0,552*“

Тяжелое течение МВ 13,7+2,53 * 39,4+6,47* 8,79+1,62"

Здоровые 16,4+2,46 59,4 + 6,67 12,1+5,6

* - достоверные различия с контрольной группой

* - достоверные различия между группами *; * - р<0,05

**;лл - р<0,001

далось достоверное снижение пролиферативной активности Т- лимфоцитов у всех обследуемых больных но сравнению со здоровыми детьми (р<0,05) и не зависело от тяжести течения заболевания. При исследовании функциональной активности В-лимфо-цитов у больных с легким и среднетяжелым течением МВ было выявлено достоверное снижение индексов пролиферации В-лимфоцитов в ответ на стимуляцию митогеном лаконоса по сравнению с аналогичным показателем у здоровых детей (табл. 3). У детей с тяжелым течением заболевания индекс пролиферации В-лимфоцитов достоверно не отличался от контрольной группы (табл.З).

Из приведенных данных следует, что период обострения хронического бронхолегочного процесса у больных МВ характеризовался снижением показателей клеточного иммунитета, что выражалось в уменьшении относительного количества Т-хелперов, снижении пролиферативной активности лимфоцитов на фоне низкой продукции 1Ь-2. В то же время активный воспалительный процесс в легких сопровождался высоким уровнем спонтанной и индуцированной продукции провоспалительных цитокинов, увеличением количества В-лимфоцитов, натуральных киллеров, количества лимфоцитов, экспрессирующих активационные маркеры. Таким образом, неспецифическое воспаление развивалось па фоне снижения показателей иммунитета.

У больных с тяжелым течением заболевания по сравнению с легким и среднетяжелым течением выявлено прогрессивное снижение уровня индуцированной продукции 1Ь-1р, снижение относительного количества Т-хелперов и количества лимфоцитов, экспрессирующих СБ25, НЬА БЯ антигены, высокая пролиферативная активность В-лимфоцитов и Т-лимфоцитов на малые дозы ФГА.

Список литературьі

1. Кетлипский С.А., Симбирцев А.С. Зпдогспньїе им-мупомодуляторьі.- Санкт-Петербург.: Гпппократ, 1992. -255с.

2. Консенсус по муковисцидозу.// Мед. Газета. - 1995. -

№41.

3. Котов А.Ю., Трофимов А.Н., Иерумов Н.Д. и соавт.

Получсние, характеристика и использовапие мопо-клопальпьіх антител к иптерлейкину-lb человека./ / Иммупология,- 1993.-№4.-С.41 -44.

4. Bedard М. et. al. Release of IL-8, IL-6 and colonystimulating factors by upper airways epithelial cells: implication for cystic fibrosis. // Am. J. Respir Cell Microbiol. - 1993. - Vol.9, №4. - P. 455 - 462.

5. Berger M. Infection, immunity and inflammation in the

lung in cystic fibrosis. // Pediatr. Pulmonol.. - 1998. -Suppl.2. - P. 71 - 73.

6.Dean T.P., Dai Y., Shute J.K., Church M.K. et. al. IL-8 concentrations are elevated in broncoalveolar lavage, sputum and sera of children with cystic fibrosis. // Pediatr. Research. - 1993. - Vol. 34. №2. - P. 159 - 161.

7. Dinarello C. A. Interleukin-1 and interleukin-1 antagonism. // Blood. - 1991. - Vol.77, №8. - P. 1627

- 1652.

8. Gillis S., Ferm M.M., Ou W.,Smith K.A. T cell growth

factor parameters of production and quantitative assay for activity.//J. Immimol.-1978.-Vol.l20.-P.2027-2032.

9. Guidot D.M., Stevens E.E., Repine M.J. et al. Intratracheal but not intravascular interleukin-1 caused acute edematous injury in isolated neutrophil-perfused lung through an oxygen radical-mediated mechanism. //J. Lab. Clin. Med.-1994.-Vol.123, №4.-P.605-609.

10. Konstant M., Berger M. Infection and inflammation in the lung in cystic fibrosis. // Cystic fibrosis / ed P.B.Davis. - New York: Marcel Dekker, 1993. - P.386.

11. Kronlwrg G., Hansen M.B., Sveason M. Et. al. Cytokines in sputum and serum from patients with cystic fibrosis and Pseudomonos aeruginosa infection as markers of destructive inflammation in the lungs. // Pediatr. Pulmonol.. - 1993. - Vol. 15, №5. - P. 292 - 297.

12. Schuster A., Haarmann A., Wahn V. Cytokines in neutrophil-dominated airway inflammation in patients with cystic fibrosis. // Eur. Archiv. of oto-rhino-laryngol.

- 1995. - Suppl.l. - P.59 - 60.

13.Terasaki P.I, McCurdy В and McClelland J. Microdroplet lymphocyte cytotoxicity test. Manual of tissue typing techniques. // In National Institutes of Health, Betheda, Maryland.-1972.- pp 50-55.

14. Wilson R., Dowling R.B., Jackson A.D. The biology of bacterial colonization and invasion of respiratory mucosa. // Eur Respir. J. - 1996. - №9. - P. 1523 -1530.

поступила в редакцию 19.07.99 принято к печати 01.10.99