CC BY
12
УДК 636.55/.58:611.013.68
ИЗМЕНЕНИЯ МОРФОЛОГИЧЕСКОГО СОСТАВА КРОВИ И НЕКОТОРЫХ ЦИТОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЭРИТРОЦИТОВ КУР В АНТЕНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ
Владимир Николаевич Корчемкин, студент
ФГБОУ ВО «Великолукская государственная сельскохозяйственная академия», Россия, г. Великие Луки
Вопрос изучения изменений клеток крови и системы кроветворения птиц в целом на данный момент изучен недостаточно. В статье приведены данные по изменению морфологического состава эмбриональной крови кур на 5-е, 10-е, 15-е и 20-е сутки инкубации. Проведена оценка изменений размеров клетки и ядра эритроцитов, установлены изменения ядер-но-цитоплазматического отношения. В процессе исследования эмбриональной крови были изготовлены мазки крови с окраской по методу Паппенгейма. На 5-е сутки инкубации в крови обнаруживаются незрелые бластные клетки, характеризующиеся большим ядром, наличием гранул в цитоплазме. На 10-е сутки отчетливо различаются эритроциты, миелоциты (предшественники гранулоцитов) и тромбоциты. На 15-е сутки инкубации наблюдаются гранулоциты, малые лимфоциты, тромбоциты. На 20-е сутки клетки крови идентичны клеткам взрослых кур, выявлены также незрелые формы эритроцитов: полихроматофиль-ные нормоциты и эритробласты. Среди гранулоцитов найдены юные, палочкоядерные и сегментоядерные формы.
Были установлены изменения в морфологии и размерах эритроцитов в антенатальном онтогенезе. Исследования показали, что в процессе развития эмбриона эритроциты становятся более вытянутыми, при этом изменяется большой диаметр клетки в 1,4 раза, малый диаметр практически не изменяется, в связи с этим площадь клетки увеличивается в
I,5 раза. В то же время уменьшается площадь ядра в 1,7 раза, причем наиболее сильно изменяется малый диаметр ядра - в 1,5 раза, в то время как большой диаметр - всего на
II,5%. Уменьшается ядерно-цитоплазматическое отношение в 3,93 раза.
Ключевые слова: эмбрионы, куры, кровь, эритроциты, антенатальный онтогенез, морфологические показатели.
Введение
Анализ крови уже давно вошел в практику ветеринарных врачей. Морфологические и биохимические показатели крови позволяют судить об изменениях, происходящих в организме в норме и в патологии. Морфологический состав крови птиц имеет существенные отличия от крови млекопитающих: эритроциты птиц больше, чем у млекопитающих, вытянутой формы, содержат ядро, нейтрофилы отсутствуют, вместо них в крови обнаруживаются псевдоэозино-филы, отличающиеся от эозинофилов структурой гранул [1]. В настоящее время имеется немного данных о морфологии незрелых клеток крови кур. В период эмбрионального развития происходит последовательная смена органов, ответственных за гемопоэз. Первые очаги кроветворения появляются на первые -вторые сутки инкубации в желточном мешке [1]. В дальнейшем активную роль
в кроветворении играет печень, а затем - красный костный мозг [3]. Также изменяется содержание клеток в крови, увеличивается содержание гемоглобина. Так, по данным Г.Ф. Задарновской, количество эритроцитов в крови за 21 день инкубации возрастает в 8-9 раз, содержание гемоглобина - в 6 раз [2]. Получение эмбриональной крови кур значительно сложнее, чем получение крови взрослой птицы. Это связано как с малым объемом получаемой крови, возможным загрязнением материала аллантоисной жидкостью, так и с трудностями по высвобождению пупочной вены на поверхность скорлупы и быстрому сбору стекающей крови.
Материал и методы
Материалом для исследований послужили яйца кур кросса «Хайсекс Браун», одного из наиболее часто используемых в яичном птицеводстве. Перед инкубацией яйца проверялись на овоскопе, отбраковывались яйца с трещинами, выраженной мраморностью скорлупы. Инкубацию проводили в инкубаторе ИЛБ-0,5, рассчитанном на 770 яиц, при термостабильном режиме с постоянной температурой 37,6±0,1 °С и относительной влажностью 55% [6]. Яйца вскрывались на 5-е, 10-е, 15-е и 20-е сутки инкубации по 5 штук при каждом вскрытии. Кровь собиралась из пупочной вены в вакуумную пробирку с антикоагулянтом КЗ ЭДТА. Проводили окрашивание по методу Паппенгейма с использованием краски-фиксатора Май-Грюнвальда и раствора азур-эозина [5]. Просматривали мазки под микроскопом «Микмед-3» с использованием объектива 40х и иммерсионного объектива 100х увеличения. Микрофотоснимки картины крови выполнены с помощью видеонасадки Digital Camera for Microscope «DCM 300» к микроскопу «Микмед-3». Определение цитометрических показателей - большой и малый диаметры клетки, большой и малый диаметры ядра, площадь клетки, площадь ядра и ядерно-цитоплазматическое отношение - проводилось в программе ScreenMeter. В каждом мазке учитывались размеры пятидесяти эритроцитов.
Статистическую обработку данных производили в программе Microsoft Office Excel 2019.
Результаты и обсуждение
На 5-е сутки инкубации (рисунок 1) в эмбриональной крови кур присутствуют незрелые клетки, которые можно идентифицировать по морфологическим признакам как базофильные и полихроматофильные эритробласты. Эти клетки округлой формы с большим ядром, цитоплазма неоднородна, прокрашивается базофильно, в ней присутствуют базофильные и ацидофильные гранулы. На данном этапе сложно определить принадлежность клеток крови к определенному ростку кроветворения.
Рисунок 1 - Картина крови на 5-е сутки инкубации Окраска по Паппенгейму. Объектив 100х
На 10-е сутки инкубации (рисунок 2) эритроциты округлой, овальной или слегка яйцевидной формы, цитоплазма не прокрашена или прокрашивается ба-зофильно, ядро небольшое относительно размеров клетки, прокрашивается ба-зофильно, располагается по центру клетки. Выражены анизоцитоз (разный размер клеток), пойкилоцитоз (клетки не идентичны по форме) и анизохромия (клетки разные по окраске цитоплазмы) эритроцитов.
Рисунок 2 - Картина крови на 10-е сутки инкубации Окраска по Паппенгейму. Объектив 100х
В крови наблюдаются миелоциты - небольшие клетки округлой формы, с округлым ядром, окрашивающимся базофильно, занимающим большую часть цитоплазмы, в некоторых обнаруживаются небольшие гранулы. Исследования показали, что диаметр гранулоцитов находится в пределах от 3,6 до 5,6 мкм. Обнаруживаются тромбоциты - округлые или слегка сплюснутые клетки, различается грануляция цитоплазмы, окрашиваются равномерно. Размеры тромбоцитов варьируют от 2 до 3 мкм в диаметре.
На 15-е сутки инкубации (рисунок 3) в крови эмбриона встречаются эритроциты разных размеров и окраски - большие и малые клетки овальной формы с округлым ядром, окрашивающимся базофильно, в цитоплазме не наблюдается зернистости.
Рисунок 3 - Картина крови на 15-е сутки инкубации Окраска по Паппенгейму. Объектив 100х
В мазках крови наблюдались гранулоциты и малые лимфоциты, моноциты. Среди зернистых наблюдались миелоциты и юные формы с округлым ядром, небольшой зернистостью, окрашивающейся базофильно (рисунок 4 А) или ацидофильно. Диаметр гранулоцитов колебался в пределах 3,2-5,1 мкм. Малые лимфоциты - незернистые мелкие округлые или неправильной формы клетки с большим круглым ядром, занимающим большую часть площади клетки. Диаметр малых лимфоцитов колебался в промежутке 2,3-4 мкм. Моноциты - клетки округлой или неправильной формы, ядро которых может принимать различную форму; особенностью этих клеток является ярко выраженная базофилия цитоплазмы. Эти клетки обеспечивают захват инородных агентов, их нейтрализацию, кроме того, они принимают участие в сложном процессинге и презентации антигена, благодаря которому происходит развертывание гуморального иммунного ответа. Обнаруживаются тромбоциты (рисунок 4 Б) - клетки, имеющие веретеновидную форму с тупыми концами, в цитоплазме различаются светлая и темная части, последняя занимает практически весь объем клетки и прокрашивается базофильно. В мазках тромбоциты располагаются группами. Средние размеры тромбоцитов: большой диаметр - 3,53±0,10 мкм, малый диаметр - 2,42±0,08 мкм, площадь - 6,07±0,28 мкм . На рисунке 3, где представлена микрофотография мазка крови на 15-е сутки инкубации, хорошо видны тромбоциты. Обнаруживаются тени клеток (рисунок 4 В), которые могут отражать как стадии эмбриогенеза некоторых клеток крови, так и клетки, пострадавшие во время нанесения и фиксации мазка [4].
_
А - базофильный гранулоцит; Б - два агрегированных тромбоцита;
В - тень клетки
Рисунок 4 - Клетки крови куриного эмбриона на 15-е сутки инкубации Окраска по Паппенгейму. Объектив 100х
На 20-е сутки инкубации клетки крови эмбриона идентичны клеткам взрослой курицы (рисунок 5). Эритроциты овальной формы с небольшим вытянутым ядром. Ядро хорошо прокрашивается. Виден гетерохроматин в виде глыбок в ядре базофильной окраски.
Рисунок 5 - Картина крови на 20-е сутки инкубации Окраска по Паппенгейму. Объектив 100х
Среди клеток эритроцитарного ряда обнаруживаются полихроматофиль-ные нормоциты (рисунок 6 А), полихроматофильные нормобласты, полихрома-тофильные эритробласты (рисунок 6 Б) - клетки, сохранившие часть базофиль-ной субстанции цитоплазмы. В полученных мазках присутствуют юные и па-лочкоядерные формы гранулоцитов (рисунок 6 В), большие и малые лимфоциты (рисунок 6 Г), моноциты (рисунок 6 Д). Лимфоциты - округлые клетки, ядро которых занимает практически всю площадь клетки и окрашивается базофиль-но. Выявлены моноциты (макрофаги), клетки, выполняющие роль захвата и уничтожения инородных веществ, участвуют в презентации антигена. В полученных мазках клеток лимфоцитарного ряда очень мало, что, скорее всего, связано с интактностью эмбриона внутри яйца. Малые лимфоциты в среднем имеют диаметр 2,5-3,5 мкм, большие - 5,5-7 мкм. Гранулоциты юные, палочко-
ядерные и сегментоядерные, в цитоплазме четко выражена грануляция. Диаметр - в среднем 5,1-5,4 мкм.
Тромбоциты на 20-е сутки (рисунок 6 Е) инкубации имеют размеры: большой диаметр - 3,38±0,14 мкм, малый диаметр - 2,45±0,07 мкм, площадь -6,56±0,38 мкм2.
А - полихроматофильный нормоцит; Б - полихроматофильный эритробласт; В - эозинофил; Г - малый лимфоцит; Д - моноцит; Е - агрегированные тромбоциты Рисунок 6 - Клетки крови куриного эмбриона на 20-е сутки инкубации Окраска по Паппенгейму. Объектив 100х
Данные по морфометрическим показателям эритроцитов обобщены в таблице 1.
Таблица 1 - Морфометрические показатели клеток красной крови на разные сутки инкубации
Сутки инкубации Размеры клетки, М±т Размеры ядра, М±т Ядерно-цитоплазма-тическое отношение
большой диаметр клетки, мкм малый диаметр клетки, мкм площадь клетки, 2 мкм большой диаметр ядра, мкм малый диаметр ядра, мкм площадь ядра, 2 мкм
5 5,93±0,10 5,03±0,12 23,69±0,11 3,78±0,08 3,23±0,07 9,75±0,38 0,79±0,05
10 6,75±0,11 4,87±0,09 25,92±0,78 3,13±0,05 2,43±0,05 6,01±0,17 0,31±0,01
15 7,98±0,14 5,14±0,08 32,27±0,78 3,27±0,07 2,29±0,05 5,89±0,17 0,23±0,01
20 8,46±0,09 5,03±0,07 35,36±0,69 3,39±0,06 2,15±0,05 5,78±0,18 0,201±0,008
На основании полученных данных и их анализа можно прийти к выводу, что существует зависимость между сутками инкубации и цитометрическими показателями эритроцитов. Так, большой диаметр эритроцита на 20-е сутки инкубации увеличивается на 42% в сравнении с большим диаметром эритробласта на 5-е сутки инкубации. Малый же диаметр клетки практически не изменяется (рисунок 7). Площадь клетки увеличивается в среднем в 1,5 раза.
Рисунок 7 - Изменения большого и малого диаметров эритроцита в процессе
инкубации
Меняются также и цитометрические показатели ядра, происходит уменьшение малого диаметра ядра эритроцита, колебания в длине большого диаметра эритроцита несущественны. Площадь ядра с 5-х по 20-е сутки инкубирования уменьшается почти на 70%, причем большие изменения в сторону уменьшения площади ядра происходят в период с 5-х по 10-е сутки инкубации (рисунок 8).
4 3,5 3 2,5 2 1,5 1
0,5 0
10 15
Сутки инкубации
Большой диматер —•—Малый диаметр
20
5
Рисунок 8 - Изменение большого и малого диаметров ядра эритроцита
в процессе инкубации
Ядерно-цитоплазматическое отношение за время инкубации уменьшилось в среднем в 3,93 раза, причем наибольшие изменения происходят в период с 5-х по 10-е сутки инкубации. Предполагаем, что это связано со снижением активности метаболизма и синтеза белков, проходящих в эритроците.
Выводы
Гемопоэз у кур в антенатальном периоде характеризуется значительными изменениями в морфологических параметрах эритроцитов. Исследования показали, что в процессе развития эмбриона эритроциты становятся более вытянутыми, при этом изменяется большой диаметр клетки в 1,4 раза, малый диаметр практически не изменяется, в связи с этим площадь клетки увеличивается в 1,5 раза. В то же время уменьшается площадь ядра в 1,7 раза, причем наиболее сильно изменяется малый диаметр ядра - в 1,5 раза, в то время как большой диаметр - всего на 11,5%. Уменьшается ядерно-цитоплазматическое отношение в 3,93 раза. На 10-х и 15-х сутках инкубации у эритроцитов выявлены такие явления, как анизоцитоз и пойкилоцитоз, базо- и полихроматофилия. На последних сутках инкубации в крови присутствуют незрелые эритроциты на разных стадиях развития: полихроматофильные нормоциты и полихроматофильные эритробласты.
Автор искренне выражает особую признательность за чуткое руководство и помощь в подготовке и оформлении работы своему научному руководителю -доктору ветеринарных наук, профессору Сулейманову Фархату Исмаиловичу.
Библиографический список
1. Болотников, И. А. Гематология птиц / И. А. Болотников, Ю. В. Соловьев. - Ленинград : Наука. Ленинградское отделение, 1980. - 116 с. - Текст : непосредственный.
2. Задарновская, Г. Ф. Сравнительные материалы по эмбриогенезу домашних птиц : автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук / Задарновская Г. Ф. - Краснодар, 1966. - 50 с. - Место защиты: Кубанский сельскохозяйственный институт. - Текст : непосредственный.
3. Корчемкин, В. Н. Изменение органов иммунной системы и морфологического состава крови кур в онтогенезе / В. Н. Корчемкин, Ф. И. Сулейманов. - Текст : непосредственный // Известия Великолукской государственной сельскохозяйственной академии. - 2021. - №1. -С. 18-27. - ISSN 2308-8583.
4. Никитин, В. Н. Атлас клеток крови сельскохозяйственных и лабораторных животных. - Москва : Государственное издательство сельскохозяйственной литературы, 1949. - 120 с. -Текст : непосредственный.
5. Полозюк, О. Н. Гематология : учебное пособие / О. Н. Полозюк, Т. М. Ушакова. -Персиановский : Донской ГАУ, 2019. - 159 с. - Текст : непосредственный.
6. Фисинин, В. И. Методические рекомендации по инкубации яиц сельскохозяйственной птицы / В. И. Фисинин, Л. Ф. Дядичкина. - Сергиев-Посад, 2001. - 64 с. - Текст : непосредственный.
CHANGES IN THE BLOOD MORPHOLOGY AND SOME CYTOLOGICAL PARAMETERS OF CHICKEN RED BLOOD CELLS IN ANTENATAL ONTOGENESIS
Korchemkin Vladimir Nickolaevich, student
State Agricultural Academy of Velikie Luki FGBOU VO, Velikie Luki, Russia
The problem of changes in blood cells and blood-forming system of birds as a whole is currently insufficiently studied. The article presents data on changes in the morphological composition of the chicken embryonic blood on the 5th, 10th, 15th and 20th days of incubation. Changes in the cell size and that of the red blood cell nucleus were evaluated, and changes in the nuclear-cytoplasmic ratio were established. During the embryonic blood analysis, Pappenheim-colored blood smears were made. On the 5th day of incubation, immature blast cells were found in the blood, they were characterized by a large nucleus and granules in the cytoplasm. On the 10th day, red blood cells, myelocytes (granulocyte precursors) and platelets were clearly distinguished. On the 15th day of incubation, granulocytes, small lymphocytes, and platelets were observed. On the 20th day, the blood cells were identical to those of adult chickens, and immature forms of red blood cells were also detected: polychromatophilic normocytes and erythroblasts. Among the granulocytes, young, rod-shaped and segmental forms were found.
Changes in the morphology and size of red blood cells in the antenatal ontogenesis were established. The study has shown that in the process of the embryo development red blood cells become more elongated, while the large cell diameter changes by 1.4 times, the small diameter does not change considerably, therefore, the cell area increases by 1.5 times. At the same time, the core area decreases by 1.7 times, and the small diameter of the core changes significantly - by 1.5 times, while the large diameter - by only 11.5%. The nuclear-cytoplasmic ratio decreases by 3.93 times.
Key-words: embryos, chickens, blood, red blood cells, antenatal ontogenesis, morphological parameters.
Bibliograficheskij spisok
1. Bolotnikov, I. A. Gematologiya pticz / I. A. Bolotnikov, Yu. V. Solov'ev. - Leningrad : Nauka. Len-ingradskoe otdelenie, 1980. - 116 s. - Tekst : neposredstvenny'j.
2. Zadarnovskaya, G. F. Sravnitel'ny'e materialy' po e'mbriogenezu domashnix pticz : avtoreferat dis-sertacii na soiskanie uchenoj stepeni doktora biologicheskix nauk / Zadarnovskaya G. F. - Krasnodar, 1966. - 50 s. - Mesto zashhity': Kubanskij sel'skoxozyajstvenny'j institut. - Tekst : neposredstvenny'j.
3. Korchemkin, V. N. Izmenenie organov immunnoj sistemy' i morfologicheskogo sostava krovi kur v ontogeneze / V. N. Korchemkin, F. I. Sulejmanov. - Tekst : neposredstvenny'j // Izvestiya Velikolukskoj gosudarstvennoj sel'skoxozyajstvennoj akademii. - 2021. - №1. - S. 18-27. - ISSN 2308-8583.
4. Nikitin, V. N. Atlas kletok krovi sel'skoxozyajstvenny'x i laboratorny'x zhivotny'x. - Moskva : Gosudarstvennoe izdatel'stvo sel'skoxozyajstvennoj literatury', 1949. - 120 s. - Tekst : neposredstvenny'j.
5. Polozyuk, O. N. Gematologiya : uchebnoe posobie / O. N. Polozyuk, T. M. Ushakova. - Per-sianovskij : Donskoj GAU, 2019. - 159 s. - Tekst : neposredstvenny'j.
6. Fisinin, V. I. Metodicheskie rekomendacii po inkubacii yaicz sel'skoxozyajstvennoj pticy / V. I. Fisinin, L. F. Dyadichkina. - Sergiev-Posad, 2001. - 64 s. - Tekst : neposredstvenny'j.
E-mail: korchemkin@internet.ru
182112, Псковская область, г. Великие Луки, пр. Ленина д. 2, ФГБОУ ВО Великолукская ГСХА
Тел.: +7 (81153) 7-28-51
