CC BY
96
ИЗМЕНЕНИЯ МИКРОБИОТЫ И ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ У БОЛЬНЫХ СИНДРОМОМ РАЗДРАЖЕННОГО КИШЕЧНИКА
Иванова Е. Л.
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ
454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64
THE CHANGES OF MICROBIOTA AND GENETIC POLYMORPHISM OF CYTOKINES IN PATIENTS WITH IRRITABLE BOWEL SYNDROME
Ivanova E. L.
State budgetary educational institution of higher professional education «South Ural State Medical University» Ministry of Health care of Russian Federation, Chelyabinsk, RF Vorovskogo Str., 64, Chelyabinsk, Chelyabinsk Oblast, 454048
Иванова Е.Л. — ассистент кафедры внутренних болезней ГБОУ ВПО Южно-Уральский государственный медицинский Иванова
университет Министерства здравоохранения РФ Екатерина Леонидовна
Ivanova E. L. — lecturer of internal medicine department of SBEIHPE South Ural State Medical University, Ministry of Health of RF, Ivanova Ekaterina L.
Chelyabinsk, RF E-mail:
kate-future@mail.ru
Резюме
Целью данной работы было оценить наличие или отсутствие ассоциации между степенью изменений микробиоты и полиморфизмом генов цитокинов IL-1Ra, IL-1b, TNFa, IL-4, IL-10 у больных СРК. Материалы и методы. Выборка состояла из 81 больного, диагноз верифицировался согласно Римским критериям III. Генотипи-рование полиморфизма IL-1Ra, IL-1b, IL-4, TNFa осуществлялось методом ПЦР. Статистическая обработка: хи-квадрат, критерий Фишера, отношение шансов. Установлена взаимосвязь между гетерозиготного генотипа G/A -308 TNFa и клинически значимых микробиологических нарушений у больных синдромом раздраженного кишечника.
Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология 2014; 111 (11):35-37
Summary
The aim of this study was to assess the presence or absence of association between the degree of changes in microbiota and gene polymorphism of cytokines IL-1Ra, IL-1b, TNFa, IL-4, IL-10 in patients with IBS. Materials and methods. The sample consisted of 81 patients, the diagnosis was verified according to the Rome criteria III. Polymorphism geno-typing of IL-1Ra, IL-1b, IL-4, TNFa was carried out by PCR. Statistical processing: chi-square test, Fisher's exact test, odds ratio. The relationship between the heterozygous genotype G/A -308 TNFa and clinically relevant microbiological disorders in patients with irritable bowel syndrome was established.
Eksperimental'naya i Klinicheskaya Gastroenterologiya 2014; 111 (11):35-37
экспериментальная и клиническая гастроэнтерология | выпуск 111 | № 11 2014
клиническая гастроэнтерология | clinical gastroenterology
Введение
В настоящее время общепринята точка зрения о том, что дисбактериоз кишечника это клинико-лаборатор-ный синдром, связанный с изменением качественного и/или количественного состава микрофлоры кишечника с последующим развитием метаболических и иммунологических нарушений с возможным развитием желудочно-кишечных расстройств [1].
Дисбактериоз является важным патофизиологическим компенсаторным механизмом, отражающим временные или постоянные нарушения в системе общей защиты организма. Его появление, по-видимому, вызвано необходимостью усиления антигенной нагрузки, поддерживающей не только мобилизационную готовность эпителия кишечника, но и имуннокомпетентные клетки в состояние субактивации. Характер и степень реагирования иммунной системы на конкретный антиген является глубоко индивидуальным, генетически запрограммированным механизмом, при этом на конечный результат взаимодействия эпителиоцита кишечника и эубиотика влияет также сформировавшийся в результате действия множества факторов индивидуальный кишечный биоценоз данного индивидуума. Таким образом, дисбактериоз это вторичное состояние, отражающее изменение микрофлоры кишечника [1,2].
Сегодняшние представления о патофизиологии СРК позволяют предположить, что в основе запуска или усиления патологического процесса лежит комбинация факторов — недостаточная или избыточная активация иммунной системы и дисбиоз кишечника [2, 3].
В качестве иллюстрации можно привести данные из исследования П. Я. Григорьева, в котором
Материалы и методы
Исследуемая выборка — 81больной СРК. Пациенты находились на лечении в гастроэнтерологическом отделении Дорожная клиническая больница ОАО РЖД на станции Челябинск в период с 2001 по 2007 годы. Для диагностики заболевания использовались Римские критерии II (1999), Римские критерии III (2006). Распределение по полу среди больных было следующим (на слайде): женщины 58 человек (71,6 %), мужчины — 23 человека (28,4 %), что согласуется с литературными данными о преобладании женщин, больных СРК. Средний возраст больных — 41,9±1,3. Средний возраст начала заболевания составил 32,8±1,4 года, длительность заболевания у большинства пациентов от 3 до 10 лет.
Обследование пациентов проводилось по утвержденным Медико-экономическим стандартам Министерства Здравоохранения в соответствии с Приказом МЗ РФ № 125, 1998 г.
У 60 обследованных больных СРК при бактериологическом анализе кала был выявлен дисбактериоз толстой кишки неспецифичных изменений микрофлоры.
Степень выраженности дисбактериоза оценивалась согласно отраслевому стандарту (ОСТ 91500.11.0004-2003), у больных СРК преобладали
выявлено, что у больных, в 68,8 % случаев имеется избыточная микробная контаминация тонкой кишки и в 98,4 % случаев — дисбактериоз толстой кишки. При этом обнаруживаются гемолизирую-щая флора, кишечные палочки со слабовыражен-ными ферментативными свойствами, энтеропа-тогенные кишечные палочки и другие изменения микрофлоры толстой кишки с преобладанием условно-патогенных микробов или их ассоциаций (стафилококки, протей, дрожжеподобные грибы, лактозонегативные или гемолитические ишерихии, синегнойная палочка, клебсиеллы и др.), т.е. те или иные дисбиотические изменения микрофлоры толстой кишки в сочетании с избыточным бактериальным ростом в тонкой кишке [4]. Участие цитокинов в патофизиологических процессах при СРК подтверждают данные лабораторных исследований: снижена экспрессия иммунорегуляторных цитокинов и повышена экспрессия провоспалительных цитокинов. Как известно по данным литературы, микробиота кишечника оказывает трофическое обеспечение слизистой кишечника и, в частности, ее эпителиального слоя, а также регулирует моторику кишечника. Наличие дисбактериоза является одним из факторов развития иммунных нарушений, в том числе и при СРК в частности установлено, что уровень отдельных антивоспалительных цитокинов ЦЬ-10 и !Ь-12) при постинфекционном типе СРК оказался ниже, чем у здоровых лиц (ЗЛ) [5].
Цель: установить особенности распределения аллелей и генотипов основных цитокинов !Ь-Ша, ^-4, !Ь-1р,—308, — 863 ТОТа, —1082,—819,—592 И.-10 у больных СРК в зависимости от степени выраженности дисбактериоза.
вторая (31 человек) и третья (28 человек) степени микробиологических нарушений.
Исследование состояло из следующих этапов:
1. Пробоподготовка — выделение ДНК из цельной крови с использованием наборов П!А1оттм ЭМАРгер200 ООО «Лаборатория ИзоГен», ООО НПФ «Литех» г. Москва;
2. ПЦР-амплификация с реактивами производства ИХБИФМ СО РАН ЦЬ-1Яа, !Ь-1Ь, ^-4), ООО НПФ «Литех» ЦЬ-10);
3. Инкубация с эндонуклеазами рестрикции (для определения ЗЫРб в генах !Ь-1р, ТОТа);
4. Детекция — электрофорез в 1,5 % агарозном и 8 % полиакриламидном гелях и гель-документирование.
Для исследования полиморфизма по одному нуклеотиду (8ЫР) в 5-й экзоне гена И,-1Ь (положение +3953) использовали разновидность ПЦР -ПДРФ — анализ полиморфизма длины рестрик-ционных фрагментов. В основе метода лежит ПЦР, с последующей обработкой ампликонов ферментом эндонуклеазой рестрикции Тад I при температуре +65 °С в течение 8 часов.
При гидролизе амплификационного фрагмента гена И,-1Ь выявлялось три фрагмента размерами 550, 146 и 404 п.н. Фрагмент 550 п.н. соответствует
амплификационному фрагменту, не подвергнувшемуся гидролизу, что указывает на наличие аллеля IL-1b (+3953) Т, гомозиготное состояние обозначено m/m (сокращение от mutant — мутантный аллель). При наличии аллеля C происходит разрезание ам-пликона на два фрагмента 146 и 404 п.н., гомозигот-ность по этому аллелю обозначена w/w (сокращение от wild — аллель дикого типа), а гетерозиготное состояние С/Т в данном исследовании обозначено как w/m. Для определения полиморфизма типа варьирующего числа тандемных повторов (VNTR) в гене IL-1Ra использовали ПЦР с праймерами, фланкирующими полиморфный регион в пределах второго интрона, в котором находится VNTR участка длиной 86 п.н. В результате амплификации мы идентифицировали фрагменты ДНК размерами 438, 524, 610, и 696 п.н. соответственно с 2, 3, 4 и 5 копиями тандемных повторов. Эти аллели были обозначены как 2R, 3R, 4R и 5R. Для исследования VNTR IL-4 проводили ПЦР с праймерами,
Результаты и обсуждение
Установлены статистически значимые изменения частот встречаемости генотипов SNP -308 TNFa: снижена частота гетерозиготного генотипа G/A, содержащего аллель гиперпродукции -308*А в группе со второй степенью микробиологических нарушений (19,4 % vs 42,9 %, р=0,04), на уровне тенденции повышена частота гомозиготного генотипа G/G (77,4 % vs 53,6 %, p=0,062). Однако по критерию отношения шансов, полученные различия оказались недостоверны: для генотипа G/A — 0,32 95 % CI 0,097+1,05; G/G — 2,97 95 % CI 0,94+9,35.
Можно предположить, что носительство гетерозиготного генотипа G/A -308 TNFa способствует развитию глубоких микробиологических нарушений.
Выводы
1. Установлена взаимосвязь наличия гетерозиготного генотипа G/A -308 TNFa и клинически значимых микробиологических нарушений у больных синдромом раздраженного кишечника
Литература
1. Дисбиоз кишечника: Руководство по диагностике и лечению / Под ред. Е. И. Ткаченко, А. Н. Суворова.— СПб.: Спецлит, 2007.— 238 с.
2. Клинические рекомендации. Гастроэнтерология / под ред. В. Т. Ивашкина. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008.— 182с.
3. Соловьева, Г. А. Синдром раздраженного кишечника: от патогенеза и диагностики к лечению/ Г. А. Соловьева// Внутренняя медицина.— № 2, 2007. [р/д http:// www.mif-ua.com/archive/article/524].
фланкирующими полиморфный регион в пределах 3-го интрона, в котором находится вариабельное количество тандемных повторов размером 70 н.п. В результате амплификации идентифицировали фрагменты ДНК размерами 255 и 325 н.п. соответственно с 2 и 3 копиями тандемных повторов. Эти аллели были обозначены как 2R и 3R. Типирование SNPs в гене TNF-a — ПДРФ-анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов: амплификация с последующей обработкой ампликонов эндону-клеазами рестрикции NcoI (37 °C в течение 16 часов) для положения -308 (G/A), TaiI для положения -863 (65 °C в течение 8 часов) [6]. Статистическая обработка результатов: критерии х2, X2 с поправкой Йетса, точный двухсторонний критерий Фишера, отношение шансов (OR) с расчетом 95 % доверительного интервала (CI). Во всех случаях различия считали статистически значимыми при р<0,05, незначимыми при р>0,10; для промежуточных значений р (0,05<р< 0,10) обсуждали тенденцию к различиям.
Анализ литературных данных указывает на связь между -308 полиморфизмом и тяжестью инфекционных болезней, установлено, что некоторые инфекции, вызванные внутриклеточными возбудителями (лепра, лейшмания и хламидия), ассоциированы носительством G/A -308 TNFa организма-хозяина.
Следует отметить, что в последнее время появляются работы, изучающие генетические особенности индивидов с дисбактериозом при различных патологиях кишечника, в частности у больных ВЗК установлена генетическая предрасположенность к нарушению микробиоценоза кишечника, связанная с изменением экспрессии толлподобных рецепторов (TLR3 и TLR4). Полученный феномен требует более глубокого изучения, с привлечением новых генов-кандидатов.
2. Частоты встречаемости аллелей и генотипов генов 1Ь-№а, 1Ь-1, 1Ь-4, 1Ь-10, -863 ТОТа не различались между группами СРК с разными степенями дисбактериоза.
4. http://www.proctolog.ru/articles/articles_04_04.htm
5. Ortiz-Lucas, M. Irritable bowel syndrome immune hypothesis. Part two: the role of cytokines/ M. Ortiz-Lucas, P. Saz-Peiro, J. J. Sebastian-Domingo// REV ESP EN-FERM DIG, 2010.— Vol.102.— P.711-717.
6. Сташкевич, Д. С. Вклад полиморфизма генов цитокинов IL-1RA, IL-1B, TNFA, IL-10 в вариабельность течения синдрома раздраженного кишечника/Д.С. Сташкевич, Е. Л. Иванова, А. Л. Бурмистрова// Вестник ЧелГУ. Направление Биология.— Челябинск, 2013.— № 7 (298).— С.18-20.
