CC BY
51
Изменения кариотипа Rumex acetosa L. в культуре in vitro...
УДК 576.316.353.7; 575.224.23
М.В. Скапцов, М.Г. Куцев
Изменения кариотипа Rumex acetosa L. в культуре in vitro на фоне явления сомаклональной изменчивости
M.V. Skaptsov, M.G. Kutsev
Changing Rumex Acetosa L. Caryotype in the Culture in Vitro against the Background of the Somaclonal Variation Phenomenon
Установлено, что геном каллусных тканей Rumex acetosa L. претерпевает значительные изменения при культивировании in vitro уже после первого пассажа. После второго и последующих пассажей в кариотипе появляются анеуплоидии. Введение в питательные среды комплекса антиоксидантов несколько замедляет сомакло-нальную изменчивость в виде изменения хромосомного состава после второго пассажа. Наиболее существенным методом снижения сомаклональной изменчивости остается соблюдение методологических рекомендаций, а также использование прямой регенерации.
Ключевые слова: сомаклональная изменчивость, кал-лусная ткань, биотехнология, кариотип, анеуплоидия.
Введение. Щавель кислый - Rumex acetosa L. сорт Широколистный - считается удачным объектом биотехнологии и генной инженерии растений, сочетая высокую скорость восстановления биомассы, он применим для фундаментального изучения процессов, протекающих в культурах in vitro, и испытания ре-комбинантных ДНК, а также является лекарственным растением [1].
Известно, что явление сомаклональной изменчивости - это в некоторой степени следствие применения фитогормонов цитокининового и ауксинового ряда, значительного накопления в тканях in vitro полифенолов и неупорядоченного роста, также существует предположение о значительной изменчивости в культурах, к которым применяется частое субкультивирование, вследствие подверженности каллусных тканей реакциям стресса [2-5].
Вместе с тем, учитывая обширные литературные данные, демонстрирующие на цитологическом уровне значительную изменчивость генома клеток растений в культуре in vitro, остался открытым вопрос о возможности преодоления или снижения частоты сомаклональной изменчивости. Для решения этого вопроса нами были проведены исследования по снижению влияния некоторых факторов на ча стоту возникновения сомаклонов, в частности таких факторов, как окислительное воздействие полифенолов.
It was established that the genome of Rumex acetosa L. callus tissues undergoes significant changes during cultivation in vitro, even after the first passage. After the second and the following passages aneuploidies in the caryotype appear. Introduction of antioxidants into the culture media complex slows down the somaclonal variation as a change in chromosome structure after the second passage. The most important way to reduce somaclonal variation remains compliance with the methodological recommendations, as well as the use of direct regeneration.
Key words: somaclonal variation, callus tissue, biotechnology, karyotype, aneuploidy.
Материалы и методы. В работе использовали каллусы изолированных тканей и органов растений, полученные согласно общепринятым рекомендациям с вариациями [6]. На различных этапах экспериментальной работы вводили минеральную основу питательных сред MS [7] c добавлением 30 г/л сахарозы, 100 мг/л мезоинозитола, 6 г/л агара [8]. Поверхностную стерилизацию листьев проводили в течение 15 мин в 2%-ном растворе лизоформина [9]. Экспериментальные образцы культивировали на средах с 2 мкМ 6-бензиладенином (6-БА) и 20 мкМ а-нафтилуксусной кислотой (НУК), а также с добавлением 6-БА и НУК в тех же концентрациях, но с дополнительным введением в питательные среды поли-винилпирролидона в концентрации 5 г/л, 300 мкг/мл тиосульфата натрия и 50 мкг/мл дитиотреитола.
Экспериментальные образцы для хромосомного анализа забирали из кончиков корней в промежутки времени с 9.00 до 12.00, характеризующиеся наиболее активным ростом. Появления корней как на классических средах, так и на средах с антиоксиданта-ми добивались путем введения в состав сред 4 мкМ 24-эпибрассинолида и 3 мкМ НУК, что приводило к активному ризогенезу. Контрольными образцами послужили корешки пророщенных семян щавеля кислого сорта Широколистный.
Предфиксационную обработку корешков проводили, помещая последние в 0,002 М оксихинолин на
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
3 часа, затем промывали 3 раза по 5 мин в дистилиро-ванной воде. Подготовленные образцы фиксировали в растворе уксусного алкоголя (этанол 3:1 ледяная уксусная кислота) в течение суток при температуре 4 оС. После фиксации материал промывали в трех сменах 96%-ного этанола, затем материал переносили в 70%-ный спирт для хранения.
В результате исследований оптимальным красителем в нашем случае был ацетокармин. Корешки после предобработки, хранившиеся в 70%-ном спирте, согревали и переносили в фиксатор 3:1, приготовленный на 45%-ной уксусной кислоте на 30 мин. Затем переносили в ацетокармин и выдерживали на кипящей водяной бане 6 мин, после чего оставляли для окрашивания на 30 мин при комнатной температуре [10].
Для получения монослоя клеток проводили раздавливание наиболее интенсивно окрашенных участков материала в 45%-ной уксусной кислоте под покровным стеклом. Полученные препараты исследовали методом прямой световой микроскопии и подсчитывали хромосомные числа клеток контрольных (кончики корешков пророщенных семян) и экспериментальных (кончики корешков каллусных тканей, выращенных на классических средах и средах с антиоксидантами) образцов.
Результаты исследований. По данным литературы, хромосомное число R. acetosa L. 2n равно 14, 16 [11].
Рис. 2. Хромосомный набор щавеля кислого сорта Широколистный из каллусных тканей. А - 2n -2; B - 2n + 1
Нами было выяснено, что хромосомное число щавеля кислого сорта Широколистный 2п равно 16 (рис. 1).
Рис. 1. Хромосомный набор щавеля кислого сорта Широколистный в норме
В результате наших исследований установлено, что после введения щавеля кислого сорта Широколистный в культуру клеток и тканей in vitro после первого пассажа (20 дней культивирования) обнаруживаются изменения кариотипа клеток в виде анеуплоидии (2n -1,2n + 1,2n - 2,2n + 3) (рис. 2).
Изучая реакцию кариотипа на внесение антиокси-дантов, установлено, что хромосомные перестройки происходят в большинстве случаев после 2 и 3 пассажей, что свидетельствует о замедлении процесса со-маклональной изменчивости.
Анализируя процентное соотношение изменений кариотипа клеток, выращенных без добавления ан-тиоксидантов, можно сделать вывод, что 43% исследованных клеток имеют хромосомные перестройки уже после первого пассажа, а в тканях, выращенных на средах с антиоксидантами, после первого пассажа
9% клеток имеют хромосомные перестройки, а после второго и третьего - 34 и 47% соответственно (табл.)
Зависимость частоты хромосомных изменений от количества пассажей
№ пасса- Кол-во клеток с измененным кариотипом, %
жа без антиоксидантов с антиоксидантами
1 43 9
2 59 34
3 70 47
Изменения кариотипа Rumex acetosa L. в культуре in vitro..
Библиографический список
1. Ai-fang Y., Su-yun J., Xiao-guang D., Ju-ren Z. High efficient in vitro propagation and salt tolerant plantlet regeneration in Rumex // Acta Pratacultural Sinica. - 2005. -V. 14, №2.
2. Benzion G., Phillips R.L. Cytogenetic stability of maize tissue culture: a cell line pedigree analysis // Genome. -1988. - V. 30.
3. Todd J., Cooke R., Racusen H., Cohen J.D. The role of auxin in plant embryugenesis // The Plant Cell. - 1993. - V. 5.
4. Hossain Z., Kalam A., Mandal A., Shukla R., Datta S.K. NaCl stress - its chromotoxic effects and antioxidant behavior in roots of Chrysanthemum morifolium Ramat // Plant Sci. -2004. - V. 166.
5. Kaeppler S.M., Kaeppler H.F., Rhee Y Epigenetic aspects of somaclonal variation in plants // Plant Mol. Biol. - 2000. - V 43.
6. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе: учеб. пособие. - М., 1999.
7. Вечернина Н.А. Биотехнология растений: учеб. пособие. - Барнаул, 2009.
8. Муратова С.А., Шорников Д.Г., Янковская М.Б., Па-пихин Р.В. Совершенствование метода клонального микроразмножения актинидии и лимонника китайского // Современное садоводство. - 2010. - №1.
9. Murashige T. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. -1962. - V. 15, №13.
10. Барыкина Р.П. Справочник по ботанической микротехнике. Основы и методы. - М., 2004.
11. Крогулевич Р.Е. Роль полиплоидии в генезисе флоры Путорана // Флора Путорана: сб. науч. тр. - Новосибирск, 1976.
