CC BY
23
УДК 612.015.1:[6П.813.1+6П.817.1]:616.36-008.8П.6]-092.9
ИЗМЕНЕНИЯ ИММУНОРЕАКТИВНОСТИ АТФ-СИНТАЗЫ В НЕЙРОНАХ КОРЫ МОЗГА И МОЗЖЕЧКА КРЫС ПРИ ХОЛЕСТАЗЕ © Емельянчик С.В.1, Карнюшко О.А.2, Зиматкин С.М.2
1УО «Гродненский государственный университет им. Я. Купалы», Беларусь, 230023, Гродно, ул. Ожешко, 22
2УО «Гродненский государственный медицинский университет», Беларусь, 230015, Гродно, ул. Горького, 80
Резюме
Цель. Выяснения возможной роли АТФ-синтазы при холестазе, изучали содержания АТФ-синтазы в нейронах коры мозга (фронтальная и теменная), клетках Пуркинье мозжечка в разные сроки экспериментального холестаза у крыс.
Методика. Исследование выполнено на 60 беспородных белых крысах-самцах массой 200-250 г. Опытным животным проводили перевязку общего желчного протока, контрольным - ложную операцию, то есть имел место физиологических ток желчи в 12-перстную кишку.
Результаты. Установлено, что при холестазе экспрессия в перикарионах нейронов коры и клеток Пуркинье мозжечка меняется волнообразно: во фронтальной коре мозга в перикарионах нейронов она повышена на 2-5-е сут., затем - уменьшение (минимальное - на 10-е сут.) и нормализация с 45-х сут. В теменной коре: повышение на 2-5 сут., затем, уменьшение (минимальное - на 10-е сут.), однако нормализация происходит только к 90 сут. В клетках Пуркинье - на 2 сут. -повышение, а с 5 по 20 сут. опыта - уменьшение экспрессии (минимальные значения на 5-10-е сут.), с 45-х сут. выявлена нормализация данного показателя.
Заключение. После перевязки общего жёлчного протока экспрессия АТФ-синтазы в перикарионах нейронов коры мозга (фронтальная и теменная) и клеток Пуркинье мозжечка меняется волнообразно: она значительно повышается в условиях холестаза и постепенно нормализуется при самоустранении холестаза.
Ключевые слова: АТФ-синтаза, нейроны коры, клетки Пуркинье, мозжечок, холестаз, крысы
CHANGES IN THE IMMUNOREACTIVITY OF ATP-SYNTHASE IN NEURONS OF CEREBRAL CORTEX AND CEREBELLUM OF RATS WITH CHOLESTASIS Emelyanchik S.V.1, Karnyushko O.A.2, Zimatkin S.M.2
1Yanka Kupala State University of Grodno, 22, Ozheshko St., 230023, Grodno, Belarus 2Grodno State Medical University, 80, Gorkogo St., 230015, Grodno, Belarus
Abstract
Objective. To study of the possible role of ATPase in cholestasis studied the content of ATP synthase in neurons of the cerebral cortex (frontal and parietal), Purkinje cells of the cerebellum at different times of experimental cholestasis in rats.
Methods. The study was performed on 60 outbred white male rats weighing 200-250 g. Experimental animals were subjected to the common bile duct ligation, control - a sham operation, when there have a physiological bile outflow to the duodenum.
Results. It was found that after the common bile duct ligation, expression in the pericarions of neurons of the cortex and in the Purkinje cells of the cerebellum changes wavy: in the frontal cortex of the brain in the pericarion of the neurons, it is increased by 2-5 days, then by a decrease (minimal - on the 10th day) and normalization from the 45th day. In the parietal cortex: increase by 2-5 days, then, decrease (minimal - on the 10th day), however, the normalization only to 90 days. In Purkinje cells - on the 2nd day - an increase, and from 5 to 20 days of the experiment - a decrease in expression (minimum values on the 5-10th day), from the 45th day the normalization of this indicator was revealed.
Conclusions. After the common bile duct ligation, the content of ATP synthase in the perikaryons of neurons of the cortex (frontal and parietal) and in the Purkinje cells perikaryons of the cerebellum changes wavy: it is increased in conditions of cholestasis and decreased in conditions of its elimination.
Keywords: ATP-sintase, neurons of the brain, Purkinje cells, cerebellum, cholestasis, rats
Введение
Холестаз (застой желчи в желчевыводящих путях, нарушающий её отток из печени в 12-перстную кишку) в результате жёлчекаменной болезни или другой патологии гепатобилиарной системы, широко распространён в современном обществе [1]. В наших предыдущих исследованиях установлено, что экспериментальный холестаз у крыс вызывает раннее повреждение митохондрий, глубокие структурные и метаболические нарушения в гистаминергических нейронах гипоталамуса, нейронах коры больших полушарий головного мозга, а также клетках Пуркинье мозжечка, приводящие к гибели некоторых из них [1-3]. В частности, на 5-20 сут. после перевязки общего жёлчного протока у крыс в нейронах коры мозга отмечалось повреждение крист митохондрий и снижение активности маркерных ферментов митохондрий - сукцинат- и НАДН-дегидрогеназ [1, 2].
Представляло значительный интерес изучение в этих условиях иммунореактивности молекулярного маркёра митохондрий АТФ-синтазы (комплекса V, образующего АТФ из АДФ), расположенного на кристах внутренней мембраны митохондрий нейронов коры мозга и мозжечка. Такие исследования в литературе не описаны.
Цель настоящей работы - оценка иммунореактивности АТФ-синтазы в нейронах коры головного мозга и мозжечка в разные сроки после перевязки общего жёлчного протока у крыс.
Методика
В работе использован материал от 60 беспородных белых крыс-самцов массой 200±25г. На проведение данных исследований получено разрешение этического комитета Гродненского государственного медицинского университета (протокол № 1, от 11.01.2017). Животных содержали в стандартных условиях вивария. Крысам контрольной группы проводили лапаротомию без перевязки желчного протока (ОЖП). Опытным животным производили перевязку общего жёлчного протока на 3-5 мм ниже слияния долевых протоков двумя лигатурами с последующим пересечением между ними. Через 2, 5, 10, 20, 45 и 90 сут. в утренние часы (для синхронизации по времени) животных выводили из эксперимента декапитацией. Быстро извлекали головной мозг, для получения сопоставимых результатов кусочки фронтальной и теменной коры мозга и коры мозжечка всех животных обрабатывали0параллельно и в одинаковых условиях. Их фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде при +4 0С в течение 20 ч., а затем заключали в парафин. Стандартные парафиновые срезы толщиной 7 мкм готовили с помощью микротома (LeicaRM 2125 RTS, Германия) и монтировали на предметные стекла.
Для иммуногистохимического выявления АТФ-синтазы применяли первичные моноклональные мышиные антитела Anti-ATP5A antibody фирмы Abcam (Великобритания, ab. 14748) в разведении 1:2400 при +4°С, экспозиция 20 ч, во влажной камере. Для выявления связавшихся первичных антител использовали набор EXPOSE Mouse and Rabbit specific HRP/DAB detection IHC kit Abcam (Великобритания, ab. 80436).
Изучение иммуногистохимических препаратов, их микрофотографирование и цитофотометрию проводили при разных увеличениях микроскопа Axioskop 2 plus (Zeiss, Германия), цифровой видеокамеры Leica DFC320 (Leica Microsystems GmbH, Германия) и программы компьютерного анализа изображения Image Warp (Bit Flow, США). Для исследования брали участки фронтальной доли коры больших полушарий головного мозга (frontal cortex, primary motor cortex - M1; bregma -от 4,20 до 1,80 мм), теменной доли коры больших полушарий головного мозга (temporal association cortex - TeA; bregma - от -6,84 до -8,52 мм); коры мозжечка (cerebellum cortex, crus1 ansiform lobule - Crus1; bregma - от -10,08 до -12,72 мм) (Paxinos 2007).
Полученные результаты обрабатывали методами непараметрической статистики с помощью лицензионной компьютерной программы Statistica 6.0 для Windows (StatSoft, Inc., США, серийный номер 31415926535897). В описательной статистике для каждого показателя определяли значения медианы (Ме) и интерквартильного диапазона (IQR). Сравнение групп по одному признаку проводили с помощью критерия Манна-Уитни для независимых выборок (Mann-Whitney U-test).
Различия между группами считали статистически значимыми, если вероятность ошибочной оценки не превышала 5% (р<0,05).
Результаты исследования
Результаты иммуногистохимического исследования показали, что иммунореактивность маркёра митохондрий АТФ-синтазы в коре мозга и мозжечка выявляется в цитоплазме всех типов нейронов и нейропиле в соответствие с известным расположением в них митохондрий. При этом размеры выявляемой коричневой зернистости осадка хромогена (диаминобензидина) соответствуют размерам этих органелл, что хорошо видно особенно в крупных нейронах при больших увеличениях микроскопа (рис. 1). В цитоплазме нейронов теменной и фронтальной коры через 1 и 5 сут. после перерезки общего желчного протока холестаз приводит к увеличению экспрессии АТФ-синтазы (табл. 1). Затем, на 10-45 сут. иммунореактивность АТФ-синтазы понижена, а на 90-е сут. не отличается от контроля. Аналогичные волнообразные изменения АТФ-синтазы обнаружены и в цитоплазме клеток Пуркинье коры мозжечка: повышение на 2-е сут. после перевязки ОЖП (рис. 2, табл. 2) и снижение на 5-20 сут. (особенно в гибнущих клетках), с последующей нормализацией в выживших нейронах на 45 и 90 сут. (рис. 3, табл. 2).
Рис. 1. Иммунореактивность АТФ-синтазы в нейронах 5 слоя теменной коры головного мозга крыс: А - 5 сут. после ложной операции; Б - увеличение через 5 сут. холестаза; В - снижение через 10 сут. холестаза. Ув. ><1000. Цифровая микрофотография
Обсуждение результатов исследования
Результаты показали, что после перевязки общего жёлчного протока (ОЖП) иммунореактивность маркерного фермента митохондрий АТФ-синтазы сначала кратковременно повышается (на 2-е сут. в цитоплазме клеток Пуркинье мозжечка и на 2-5-е сут. в нейронах коры мозга). Это можно рассматривать как попытку нейронов приспособиться к холестазу, нарастающему в крови уровню билирубина, жёлчных кислот и холестерина, что требует дополнительных затрат энергии для выживания нейронов. Затем в условиях нарастающего холестаза происходит снижение в них иммунореактивности АТФ-синтазы с минимумом на 10-20 сут. опыта. Эти изменения коррелируют с нарастающими морфофункциональными нарушениями в этих нейронах (структурными, ультраструктурными и гистохимическими), приводящими к гибели более 10% нейронов коры мозга и мозжечка, что свидетельствует о срыве их адаптации в условиях нарастающего холестаза [2]. Это сопровождается гибелью значительной части экспериментальных животных (в результате полиорганной недостаточности) [1].
В наших предыдущих исследованиях показано, что наиболее значительные нарушения среди органелл нейронов коры мозга и мозжечка при экспериментальном холестазе у крыс наблюдаются именно в митохондриях - разрушение их крист, набухание матрикса, снижение активности маркерных ферментов (сукцинат- и НФДН-дегдирогеназ) с максимумом на 10-20 сут. опыта [1, 3].
Как известно, нейроны из-за их высоких энергетических потребностей зависят от митохондрий, а дисфункция этих органелл играет ключевую роль в нарушении функций и гибели нейронов при острых и хронических заболеваниях ЦНС, нейродегенерации [7, 8].
Таблица 1. Иммунореактивность АТФ-синтазы в нейронах слоев фронтальной Ь теменной коры головного мозга контрольных крыс и в различные сроки после перевязки общего жёлчного
Кора фронтальная теменная
2 сут.
Слой коры Контроль (п=17) Опыт (п=17) Контроль (п=30) Опыт (п=30)
второй 292,37±14,86 329,65±17,62 *** Т 313,48±9,12 351,90±17,14 *** Т
третий 292,37±14,86 315,97±32,33 ** Т 314,79±14,11 342,94±33,01* Т
пятый 320,43±10,71 332,67±32,33 * Т 325,88±22,97 351,82±33,20 * Т
5 сут.
второй 307,72±11,66 370,19±15,36 *** Т 331,47±9,99 392,02±12,95 *** Т
третий 305,28±14,40 326,64±19,30 *** Т 326,18±17,21 352,60±28,12 *** Т
пятый 316,19±17,22 339,48±22,57 *** Т 338,98±17,21 365,72±31,11 *** Т
10 сут.
второй 298,58±11,81 252,45±31,72 *** 4 321,27±12,05 279,67±14,30 *** 4
третий 303,37±14,75 226,51±28,55 *** 4 324,72±14,47 254,19±25,58 *** 4
пятый 314,16±13,67 243,21±29,49 *** 4 334,51±9,67 264,47±27,0 *** 4
20 сут.
второй 294,94±29,42 271,16±26,23 *** 4 321,14±23,35 289,68±25,32 *** 4
третий 302,67±16,79 245,48±27,0 *** 4 325,05±13,88 268,69±23,26 *** 4
пятый 313,34±11,36 270,56±33,89 *** 4 335,84±15,94 279,81±25,14 *** 4
45 сут.
второй 293,94±38,11 292,43±43,25 323,18±39,54 311,03±49,42
третий 305,53±36,44 297,64±39,39 327,46±27,98 298,30±54,88 ** 4
пятый 316,09±32,52 313,19±63,21 340,12±18,18 315,82±54,88 *** 4
90 сут.
второй 283,88±32,37 289,89±36,70 316,01±32,90 319,44±43,18
третий 288,91±45,60 304,55±44,0 320,44±48,06 330,68±48,41
пятый 306,73±44,71 319,71±47,36 330,84±51,52 340,50±52,61
Примечание: * - р<0,05 по сравнению 4 - статистически значимое снижение
с контролем; ** - р<0,01 по сравнению с контролем; *** - р<0,001 по сравнению с контролем; изучаемого параметра; Т - статистически значимое увеличение изучаемого параметра
Рис. 2. Иммунореактивность АТФ-синтазы в коре мозжечка крыс в контроле - А (2 сут. после ложной операции) и увеличение её в опыте - Б (2 сут. холестаза). Иммуногистохимическая реакция на АТФ-синтазу. Ув. ><400. Цифровая микрофотография
Рис. 3. Иммунореактивность АТФ-синтазы в коре мозжечка крыс в контроле - А (5 сут. после ложной операции) и снижение её, особенно в повреждённых клетках Пуркинье в опыте - Б (5 сут. холестаза). Иммуногистохимическая реакция на АТФ-синтазу. Ув. ><400. Цифровая микрофотография
Таблица 2. Иммунореактивность АТФ-синтазы в перикарионах клеток Пуркинье коры мозжечка контрольных крыс и в различные сроки подпеченочного холестаза (ед.х103) (Ме±ЩЯ)_
Сут. Контроль(п=30) Опыт (п=30)
2 341,17±35,56 356,56±48,69 **|
5 345,79±23,97 285,25±34,07*** |
10 341,62±26,69 250,13±88,10 ***|
20 347,08±32,10 313,80±14,63*** |
45 347,03±38,84 343,74±17,34
90 341,45±31,67 334,06±16,80
Примечание: * - р<0,05 по сравнению с контролем; ** - р<0,01 по сравнению с контролем; *** - р < 0,001 по сравнению с контролем; | - статистически значимое снижение изучаемого параметра; | - статистически значимое увеличение изучаемого параметра
Билирубин в нервной ткани обладает выраженной нейротоксичностью: в нейронах происходит разрушение плазматических мембран, нейровоспаление, окислительный стресс и остановка клеточного цикла [10]. Это напрямую отражается на мембранах митохондрий, на их активности ферментов дыхательной цепи, что может свидетельствовать об окислительном стрессе в головном мозге. Причем перевязка ОЖП приводила в нейронах головного мозга к отёку, просветлению матрикса, деформации крист, разрушения мембран [6], что подтверждает наши более ранние исследования [2].
Показано, что нарушение метаболизма холестерина приводит к митохондриальным дисфункциям, подобное явление широко распространено при неврологических и нейродегенеративных состояниях [5]. Так, например, в 23% случаев у больных с прогрессирующей атаксией, обнаружены митохондриальные дисфункции [4].
В наших предыдущих исследованиях установлено, что уже с 5 сут. после перерезки ОЖП от его культи к 12-перстной кишки начинают прорастать обходные желчевыводящие пути. Это приводит к устранению холестаза и выживанию тех животных, у которых реканализация успела завершиться до развития полиорганной недостаточности. Поэтому у выживших животных на 4590 сут. после перевязки ОЖП происходит нормализация структурных и гистохимических параметров в сохранившихся нейронах коры мозга и мозжечка, в частности состояния в них митохондрий и активности их маркерных ферментов [2]. Это совпадает по времени с нормализацией иммунореактивности АТФ-синтазы в цитоплазме этих нейронов, что можно рассматривать как признак восстановление в них энергетического аппарата, ведущего к нормализации морфо-функционального состояния нейронов.
Заключение
Выявленные метаболические изменения отражают негативное влияние повышенной концентрации в крови компонентов желчи, а также адаптационные изменения в изученных нейронах мозга при резком нарушении циркуляции желчи; с другой стороны, эти изменения могут свидетельствовать об активном участии нейронов мозга в регуляции компенсаторных процессов при холестазе в организме. Повышенная экспрессия АТФ-синтазы может свидетельствовать об активации внутриклеточных энергозатратных процессов в нейронах, направленных на устранение внутриклеточных повреждений, возможно происходящих в результате ускоренного износа органелл при увеличенной активности клеток.
Таким образом, после перевязки общего жёлчного протока экспрессия АТФ-синтазы в нейронах новой коры мозга и клетках Пуркинье мозжечка меняется волнообразно: сначала (через 2-5 сут.) она кратковременно повышается, затем (на 10-20 сут.) резко снижается, а в отдалённые сроки (4590 сут.) в выживших нейронах нормализуется.
Литература (references)
1. Емельянчик С.В., Зиматкин С.М. Мозг при холестазе. - Гродно: ГрГУ, 2011. - 265 c. [Emel'yanchik S.V., Zimatkin S.M. Mozgpri kholestaze. Brain after cholestasis. - Grodno: GrGU, 2011. - 265 p. (in Russian)]
2. Емельянчик С.В., Зиматкин С.М. Структурные и гистохимические изменения в клетках Пуркинье мозжечка крыс при холестазе // Морфология. - 2013. - Т.143, №2. - С. 19-23. [Emel'yanchik S.V., Zimatkin S.M. Morfologiia. Morphology. - 2013. - V.143, N2. - P. 19-23. (in Russian)]
3. Зиматкин С.М., Барабан О.В., Емельянчик С.В. Метаболические изменения в гистаминергических нейронах мозга крыс в динамике подпеченочного холестаза // Морфология.- 2007. - Т. 132, № 4. - С. 2730. [Zimatkin S.M., Baraban O.V., Emel'janchik S.V. Morfologiia. Morphology. - V.132, N4. - P. 27-30.]
4. Bargiela D., Shanmugarajah P., Lo C., et al. Mitochondrial pathology in progressive cerebellar ataxia // Cerebellum & Ataxias. - 2015. - V.2. - P. 16.
5. Desai R., Frazier A.E., Durigon R. et al. ATAD3 gene cluster deletions cause cerebellar dysfunction associated with altered mitochondrial DNA and cholesterol metabolism // Brain. - 2017. - V.140, N6. - P. 1595-1610.
6. Dhanda S., Sunkaria A., Halder A., Sandhir R. Mitochondrial dysfunctions contribute to energy deficits in rodent model of hepatic encephalopathy // Metabolic Brain Disease. - 2018. - V.33, N1. -Р. 209-223.
7. Galluzzi L., Blomgren K., Kroemer G. Mitochondrial membrane permeabilization in neuronal injury // Nature Reviews Neuroscience. - 2009. - V.10, N7. - Р. 481-494.
8. Lin M.T., Beal M.F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases // Nature. -2006. - V.443, N7113. - Р. 787-795.
9. Paxinos G., Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates, 6th ed. - London: Academic Press, 2007. - 448 p.
10. Watchko J.F. Bilirubin-induced eurotoxicity in the preterm neonate // Clinics in Perinatology. - 2016. - V.43, N2. - Р. 297-311.
Информация об авторах
Емельянчик Сергей Владимирович - кандидат медицинских наук, доцент, заведующий кафедрой зоологии и физиологии человека и животных УО «Гродненский государственный университет им. Я. Купалы». Республика Беларусь. E-mail: [email protected]
Карнюшко Ольга Анатольевна - ассистент кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии УО «Гродненский государственный медицинский университет». Республика Беларусь. E-mail: [email protected]
Зиматкин Сергей Михайлович - доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии УО «Гродненский государственный медицинский университет». Республика Беларусь. E-mail: [email protected]
