CC BY
29
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© Топол И.А., Камышный А.М., 2014
УДК: 616.34-018-092-02: [57.048+579.61]] - 092.9
ИЗМЕНЕНИЯ БАЛАНСА СУБПОПУЛЯЦИЙ Т-ХЕЛПЕРОВ В КАЛТ КРЫС В УСЛОВИЯХ ХРОНИЧЕСКОГО ЗООСОЦИАЛЬНОГО СТРЕССА И МОДУЛЯЦИИ СОСТАВА КИШЕЧНОЙ МИКРОФЛОРЫ
И.А. Топол, А.М. Камышный Запорожский государственный медицинский университет, г. Запорожье, Украина
Исследовано влияние хронического зоосоциального стресса (ХЗС) и модуляции состава кишечной микрофлоры на соотношения субпопуляций Т-хелперов в КАЛТ. Установлено, что развитие ХЗС сопровождается дисбалансом Tbet+/Gata3+-и Рохр3+/Яогу1+-клеток, свидетельствуя о доминировании Th1- и Th17-дифференцировки и повышении уровня про-воспалительной сигнализации в кишечнике. Показано, что введение канамицина стрессированным животным приводит к доминированию Th1- и Тreg-субпопуляций, а модуляция кишечной микрофлоры лактобактерином снижает соотношении Tbet+/Gata3+-лимфоцитов в собственной пластинке слизистой оболочки ворсинок, увеличивает в субэпителиальной зоне и однонаправленно повышает коэффициент Treg/Th17.
Ключевые слова: стресс, КАЛТ, T-хелперы, Treg.
Современная ситуация в украинском обществе характеризуется высоким уровнем социального напряжения, что провоцирует развитие стресса, тревоги и депрессии. В свою очередь, стресс-индуцированная иммунная дисрегуляция приводит к значительным негативным последствиям для здоровья, увеличивая риск развития вирусных инфекций, хронических аутоиммунных и воспалительных заболеваний [12]. Так, во многих клинических и экспериментальных исследованиях было показано, что хронический социальный стресс (ХСС) может быть триггером развития многих патологических состояний, включая сахарный диабет 1 типа (СД 1 типа) и воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), в механизмах развития которых, в свою очередь, важную роль играют нарушения дифференцировки различных субпопуляций Т - хелперов, в частности, дисбаланс ^1/1^2 и Treg/Th17-клеток в кишечно-ассоциированной лимфоидной ткани
(КАЛТ) [10]. Ключевыми регуляторами образования Th1 и Th2 являются транскрипционные факторы T-bet и GATA-3, нокаут по генам которых (ТВХ21 и GATA3) блокирует развитие соответствующих лимфоцитов [13, 14]. Дифференци-ровка Th17 и Т-регуляторных клеток, в свою очередь, зависит от экспрессии транскрипционных факторов RORyt и Foxp3. Экспериментальная трансдукция Foxp3 внерегуляторные Foxp3"CD25"CD4 "наивные" Т-клетки человека или мышей придает последним функциональные свойства и фенотип Treg [2], а нокаут гена RORyt приводит к потере способности CD4+T - клеток дифференцироваться в ^П-клетки; их способность к выработке IL-17 резко ослабевает [9]. У мышей с такой патологией невозможно индуцировать аутоиммунные процессы [9]. Характерно, что именно тонкий кишечник, особенно подвздошная кишка, является основным местом генерации индуцибель-ных Treg - клеток (iTreg) и резервуаром
пула ТЫ7-клеток, так как именно здесь происходит индукция их дифференци-ровки из наивных Т-лимфоцитов с участием кишечной микрофлоры [6].
Учитывая это, целью нашей работы было выявить особенности соотношения Th1/Th2 и Treg/Th17-лимфоцитов в КАЛТ крыс в условиях ХЗС и модуляции состава кишечной микрофлоры.
Материалы и методы
Исследования проводились на 70 самках крыс линии Wistar, которые были разделены на семь экспериментальных групп: контрольные крысы, которым интр-агастрально (и/г) в течение 3-х недель вводили по 0,5 мл физиологического раствора (группа 1); крысы, которым моделировали ХЗС1 путем трехнедельной социальной изоляции и длительного психоэмоционального воздействия (ПЭВ), предполагавший перманентное проживания самок в «агрессивной среде», а именно, через перфорированную перегородку в клетке с агрессивным самцом, который ежедневно вступал в конфронтации с подсаженным к нему другим самцом (группа 2); крысы, которым моделировали ХЗС2 путем содержания животных в перенаселенных клетках (20 крыс на клетку) в течение 3 недель с ежедневной сменой группировки, при котором подопытную самку каждый день помещали в новую сбалансированную и перенаселенную колонию (группа 3); крысы с ХЗС1 и ХЗС2, которым осуществляли модуляцию состава кишечной микрофлоры путем внутрижелудочного (и/г) введения аминогликозидного антибиотика канамицина (Can) в течение 7 суток ежедневно, начиная с 3-й недели моделирования ХЗС в дозе 15 мг/кг (группы 4 и 5, соответственно); крысы с ХЗС1 и ХЗС2, которым осуществляли модуляцию состава кишечной микрофлоры путем и/г ежедневных введений Лактобактерина (Lb, смесь живых лиофильно высушенных лактобактерий L. plantarum штамм 8Р - A3 и L. fermentum штамм 90Т - С4) в течение 3-х недель в дозе 4^108 КОЕ (группы 6 и 7, соответственно). Уровень эмоционально -поведенческой и исследовательской активности изучали в тестах «открытое по-
ле» и «перегородка»; в тесте Порсолта («принудительного плавания», ПП) определяли уровень депрессивности животных. Крыс выводили из эксперимента методом декапитации под эфирным наркозом.
Структуру популяции T-bet-, GATA3+-, RORyt+- и Рохр3+-клеток изучали на основании анализа серийных гистологических срезов и данных их мор-фометрических и денситометрических характеристик. Для проведения данного исследования на ротационном микротоме MICROM HR-360 (Microm, Германия) делали 5-микронные серийные срезы подвздошной кишки. Данные срезы депа-рафинировали в ксилоле, проводили ре-гидратацию в нисходящих концентрациях этанола (100%, 96%, 70%), отмывали в 0,1М фосфатном буфере (рН=7,4) и красили с первичными кроличьими поликло-нальными антителами (ПКАТ) к транскрипционным факторам T-bet, GATA3, RORyt и Foxp3 крысы (Santa Cruz Biotechnology, США) в течение 18 часов во влажной камере при Т=4оС. После отмывания избытка первичных антител в 0,1М фосфатном буфере, срезы инкубировали 60 минут (Т=37оС) с вторичными антителами к полной молекуле IgG кролика (Santa Cruz Biotechnology, США), конъюгированными с FITC. После инкубации срезы промывали 0,1М фосфатным буфером и заключали в смесь глицерина и фосфатного буфера (1:9) для последующей люминесцентной микроскопии. Обработанные гистологические срезы изучали с помощью компьютерной программы ImageJ (NIH, США). Изображение, получаемое на микроскопе PrimoStar (ZEISS, Германия) в ультрафиолетовом спектре возбуждения 390 нм (FITC) с помощью высокочувствительной камеры AxioCam 5c (ZEISS, Германия) и пакета программ для получения, архивирования и подготовки изображений к публикации AxioVision 4.7.2 (ZEISS, Германия) немедленно вводилось в компьютер. При этом в автоматическом режиме определялись области со статистически значимой флюоресценцией, характерной для клеток, экспрес-сирующих T-bet, GATA3, RORyt и Foxp3.
Рассчитывались морфометрические и денситометрические характеристики имму-нопозитивних клеток. При окраске МКАТ исследовали T-bet+, GATA3+, RORyt+ и Foxp3+ - лимфоциты, расположенные в собственной пластинке слизистой оболочки заполненных лимфоцитами ворсинок (Lymphocyte-filled villi, LFV, ЗЛВ), являющиеся отдельным компартментом КАЛТ у крыс и в субэпителиальной зоне сгруппированных лимфоидных узелков (СЭЗ, PPSubep). Все полученные экспериментальные данные обрабатывали на персональном компьютере пакетом прикладных и статистических программ EXCEL из пакета MS Office 2010 (Ш^ойСогр.США), STATISTICA 6.0 (Stat - Soft, 2001).
Результаты и обсуждение
Известно, что у животных в условиях длительного ПЭВ или зоосоциальной изоляции формируется патологическое состояние, которое характеризуется выраженной тревожностью, снижением исследовательской и двигательной активности, коммуникативности и болевой чувствительности, нарушениями эстрального цикла, полового/социального распознавания, развитием депрессивности [1]. Кроме того, у таких животных наблюдается весь спектр свойственных стрессу реактивных изменений, а имен-
но, увеличение массы надпочечников, уровня адреналина и норадреналина, высвобождение кортикостерона и др. [1]. Результаты проведенного нами тестирования экспериментальных животных в тесте "Открытое поле" показали, что развитие ХЗС приводило к достоверному снижению основных показателей двигательно-исследовательской и эмоциональной активности: горизонтальной двигательной активности (на 25%, р<0,05 (ХЗС1) и 29%, р<0,05 (ХЗС2)), вертикальной двигательной активности (на 38%, р<0,05 (ХЗС1) и 47%, р<0,05 (ХЗС2)) и исследовательской активности (на 41%, р<0,05 при ХЗС1 и на 54%, р<0,05 в случае ХЗС2). Полученные результаты свидетельствовали о проявлении выраженной тревожности у крыс в условиях хронического зоосоциаль-ного стресса (табл. 1). Кроме того, ХЗС приводил к достоверному усилению груминга (на 75%, р<0,05 при ХЗС1 и на 92%, р<0,05 в случае ХЗС2) и актов дефекации (болюсы) (в 3,6 раз, р<0,05 при ХЗС1 и в 2,8 раз, р<0,05 в случае ХЗС2) по сравнению с контрольной группой крыс (табл. 1). Следует указать, что снижение двигательной активности крыс на фоне заметно возросшего груминга, по мнению ряда исследователей [8] свидетельствует о развитии стресса и тревожно-депрессивных изменений поведения.
Таблица 1
Результаты поведенческих тестов крыс, подвергнутых ХСС_
Серии контроль ХСС 1 ХСС 2
Тест «Открытое поле»
ГДА 62,9±3,6 47,0±5,21 44,5±3,61
ВДА: climbing 12,5±0,8 7,8±1,11 6,6±0,81
rearing 4,8±0,7 2,4±0,3 4,5±0,7
Груминг: короткий 1,2±0,2 2,1±0,31 2,3±0,31
длительный 1,0±0,2 0,9±0,1 0,8±0,1
Обследование отверстий 6,8±0,4 4,0±0,31 3,1±0,31
Уровень дефекации 0,5±0,3 1,8±0,41 1,4±0,21
Тест «Принудительное плавание»
Активное плавание, сек. 121,6±9,3 73,5±11,21 70,2±8,51
Пассивное плавание, сек. 42±16,3 56±16,1 48,3±8,6
Иммобилизация, сек. 136,4±10,2 170,5±8,51 179,5±8,71
Тест «Перегородка»
Число подходов к перегородке, к-во 5,4±0,8 2,1±0,21 2,6±0,31
Длительность нахождения, сек 53,9±6,4 33,9±3,71 37,3±5,21
Обнюхивание, к-во 5,7±0,7 5,3±1,1 4,3±0,8
Вставание на задние лапки, к-во 3,8±0,5 4,2±1,0 4,7±0,8
Груминг 3,1±0,4 2,6±0,3 2±0,4
Фризинг (замирание) 0,1±0,1 0,1±0,1 0,5±0,11
Примечание: — вероятность суждения об отсутствии различий средних величин по отношению к контролю р<0,05 (').
Хронический зоосоциальный стресс вызывал изменение поведения крыс и в тесте Порсолта на определение тревожности. Так, результаты тестирования экспериментальных животных в тесте 1111 показали, что развитие ХЗС приводило к достоверному снижению длительности активного плавания (на 39%, р<0,05 при ХЗС1 и на 42%, р<0,05 в случае ХЗС2) и увеличению стадии иммобилизации (на 25%, р<0,05 в случае ХЗС1 и на 32%, р<0,05 при ХЗС2) по сравнению с контролем (табл. 1). Полученные результаты свидетельствовали о формировании депрессивного состояния у животных.
Результаты тестирования экспериментальных животных в тесте "Перегородка" также показали, что развитие ХЗС приводило к развитию повышенной тревожности у самок крыс, о чем свидетельствовало достоверное снижение числа подходов к перегородке (на 61% р<0,05 при ХЗС1 и на 52%, р<0,05 в случае ХЗС2), среднего времени пребывания у перегородки (на 37%, р<0,05 при ХЗС1 и на 31%, р<0,05 в случае ХЗС2) по сравнению с контрольной группой (табл. 1). Кроме того, было зафиксировано статистически значимое увеличение фризинга при ХЗС2 (в 5 раз, р<0,05). Следует отметить, по данным литературы, фризинг - это реакция проявления наиболее сильного стресса [5].
Изучения субпопуляционного состава Т-лимфоцитов показало, что развитие ХЗС не влияло на соотношение ТЬе1/Оа1а3+-клеток в ЗЛВ подвздошной кишки крыс и приводило к достоверному повышению данного коэффициента в СЭЗ (на 75% (р<0,05) при ХЗС1 и на 46% (р<0,05) в случае ХЗС2) по сравнению с контрольной группой животных (рис. 1А). Наряду с этим, при развитии ХЗС прослеживается общая тенденция к достоверному снижению соотношения Tгeg/Th17-лимфоцитов в лимфоидных структурах подвздошной кишки крыс, наиболее выраженная в ЗЛВ. Так, коэффициент распределения Рохр3+/Яогу+-клеток уменьшился в ЗЛВ в 4,1 раза (р<0,05) в случае ХЗС1 и в 3,5 раза (р<0,05) при ХЗС2; в СЭЗ - на 39% (р<0,05)
при ХЗС1 и в 3,8 раза (р<0,05) в случае ХЗС2, по сравнению с контролем (рис. 1D).
Данные изменения свидетельствуют о доминировании в условиях ХЗС Th1- и ТЫ7-дифференцировки, что повышает уровень про-воспалительной сигнализации в кишечнике. Полученные нами результаты совпадают с данными Hong M. еt al. (2013), которые свидетельствуют о том, что при развитии стресса и стресс-индуцированной депрессии в лимфоид-ных органах у мышей изменяется количество ТЫ7-лимфоцитов, и нарушается баланс между Th17/Treg-клетками [7]. Также Schmidt D. еt al. (2010) показали, что ХЗС приводит к активации иммунной системы, стимулирует дифференцировку про-воспалительных Th17- и TM-клеток в периферических лимфатических узлах экспериментальных животных, снижает количество Treg-лимфоцитов и вызывает спонтанное развитие стресс-
индуцированного колита [3].
Введения Can стрессированным животным приводили к достоверному увеличению соотношения Th1/Th2-лимфоци-тов только в случае ХЗС1 (в ЗЛВ в 2,1 раза, р<0,05 и в СЭЗ на 37%, р<0,05) и не влияли на этот баланс при ХЗС2 (рис. 1В). При этом коэффициент распределения Рохр3+/Яогу^-клеток вырос в ЗЛВ в 2,9 раза (р<0,05) при ХЗС1 и в 2,7 раза (р<0,05) в случае ХЗС2, в СЭЗ - на 61% (р<0,05) только в случае ХЗС2 (рис. 1Е). Таким образом, несмотря на доминирование 1Ы-субпопуляции после введения Can стрессированным животным наблюдается и одновременное относительное увеличение числа Т-регуляторных клеток, способных нивелировать их эффекторные функции.
При введении Lb экспериментальным животным изменения в соотношении Tbet+/Gata3+-лимфоцитов носили разнонаправленный характер - Th1/Th2 баланс снижался в ЗЛВ (на 18% (р<0,05) при ХЗС1 и на 29% (р<0,05) в случае ХЗС2) и повышался в СЭЗ (на 29% (р<0,05) при ХЗС1 и на 24% (р<0,05) в случае ХЗС2) (рис. 1С). В тоже время, соотношение
1.2 1.1 i
0.9 0.8 0.7 0.6 0.5
stress Th1/Th2 ratio
□ LFV DPP Subep
r~h
A
1.9 1.7 1.5 1.3 1.1 0.9
stress + Can Th1/Th2 ratio
□ LFV □ PP Subep *
r* * rh
0.9 i j
0.7 I
p76 1.03 0.93 0.86
B
stress 2 stress 1 + stress 2 + Can Can
1.5
1.3
1.1 rh
0.9
0.7 rh
0.5 0.76 1.03
stress 1
stress + Lact Th1/Th2 ratio
□ LFV DPP Subep
rh
rh
C
stress 2 stress 1 + stress 2 + Lact Lact
2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2
stress Treg/Th17 ratio
□ LFV DPP Subep
EH]
0.95
stress 1
D
1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2
stress + Can Treg/Th17 ratio
□ LFV DPP Subep
E
* r*i
1*1
rh
1.23 0.81 1.36
stress 1 + stress 2 + Can Can
stress + Lact Treg/Th17 ratio
□ LFV □ PP Subep
2.2 * Г*1 ñ
1.7 Г*
1.2 * *
0.7
0.2 E3 0.95 E °."i 2.1 1.68 1.22 2.375
stress 2 stress 1 + stress 2 + Lact Lact
Рис. 1. Соотношение T-bet+/GATA3+-лимфоцитов (Th1/Th2) и Рохр3+/Яогу1+-лимфоцитов (Treg/Th17) в ЗЛВ (LFV) и СЭЗ (PPSubep),* - р<0,05
Рохр3+/Яогу1-клеток после введения про-биотика стрессированным крысам одно-направленно увеличивалось во всех изученных нами морфофункциональных зонах, наиболее интенсивно - в ЗЛВ. Так, коэффициент распределения Treg/Th17-лимфоцитов увеличился в ЗЛВ в 5 раз (р<0,05) при ХЗС1 и в 2,4 раза (р<0,05) в случае ХЗС2; в СЭЗ - на 77% (р<0,05) при ХЗС1 и в 5,8 раз (р<0,05) в случае ХЗС2 (Рис.Щ. Полученные результаты совпадают с рядом исследований, продемонстрировавших способность ЬЬ увели-
чивать количество Treg-клеток и, таким образом, предотвращать развитие воспалительных и АИЗ, а также уменьшать состояние депрессии и тревоги в условиях стресса [4]. Повышая уровень Treg, Lb оказывает антидиабетогенное действие в условиях стрептозотоцин - индуцированного диабета и у BB-DP крыс путем индукции СВ4+СБ25^охр3+-клеток, уменьшает риск развития болезни Крона и язвенного колита [11]. Вместе с тем, Chiba Y. Et al. (2010) продемонстрировали, что Lactobacillus casei увеличивают продук-
stress 1
stress 1
stress 2
stress 2
F
stress 1
stress 2
stress 1
цию IL-12 клетками селезенки и ПБ мышей даже сильнее, чем некоторые патогенные бактерии, что, в свою очередь, стимулирует образование Th1 - клеток и продукцию про-воспалительного IFNy [15]. Способность Lb увеличивать соотношение Tbet+/Gata3+-лимфоцитов в СЭЗ была обнаружена и нами.
Выводы
1. Развитие хронического зоосоци-ального стресса сопровождается дисбалансом субпопуляций Т-хелперов в КАЛТ, приводя к увеличению соотношения Tbet+/Gata3+ и снижению Foxp3+/Roryt+-клеток, свидетельствуя о доминировании в условиях хронического зоосоциального стресса Th1- и ТЫ7-дифференцировкп и повышении уровня про-воспалительной сигнализации в кишечнике.
2. Введение канамицина стрессиро-ванным животным приводит к доминированию Th1- и Тreg-субпопуляций, а модуляция кишечной микрофлоры лактобакте-рином снижает соотношении Tbet+/Gata3+-лимфоцитов в собственной пластинке слизистой оболочки ворсинок, увеличивает в субэпителиальной зоне и однонаправленно повышает коэффициент Treg/Th17.
Литература
1.Avgustinovich D. Gender-related characteristics of responding to prolonged psy-choemotional stress in mice / D. Avgusti-novich, I. Kovalenko // Neurosc. Behav. Physiol. - 2009. - Vol. 40, № 3. - Р. 858867.
2.Caton A. Regulatory cells in health and disease / A. Caton, K. Weissler // Immunol Rev. - 2014. - Vol. 259, №1. - P. 5-10.
3. Chronic psychosocial stress promotes systemic immune activation and the development of inflammatory Th17 cell responses / D. Schmidt [et al.] // Brain Behav Immun. - 2010. - Vol. 24, №7. - P. 1097-1104.
4. Cryan J. Mind-altering microorganisms: the impact of the gut microbiota on brain and behavior / J. Cryan, T. Dinan // Na-tureReviews Neuroscience. - 2012. -Vol. 9. - P. 1-12.
5. Evaluation of an improved automated analysis of freezing behavior in rats and
its use in trace fear conditioning / A.R. Marchand [et al.] // J. Neurosci. Methods.
- 2003. - Vol. 126. -P. 145-153.
6. Host interactions with Segmented Filamentous Bacteria: An unusual trade-off that drives the post-natal maturation of the gut immune system / P. Schnupf [et al.] // Semin. Immunol. - 2013. -Vol. 25. - P. 342-351.
7. Imbalance between Th17 and T-reg cells may play an important role in the development of chronic unpredictable mild stress-induced depression in mice / M. Hong [et al.] // Neuroimmunomodula-tion. - 2013. - Vol. 20, №1. - P. 39-50.
8.Kaluyev A.V. Stress and grooming / A.V. Kaluyev. - M.: Aviks, 2002. - 146 p.
9. Littman D. Th17 and regulatory T cells in mediating and restraining inflammation / D. Littman, A. Rudensky // Cell. -2010. - Vol. 140. - P. 845-858.
10. Mucosal immunosuppression and epithelial barrier defects are key events in mu-rine psychosocial stress-induced colitis / S. Reber [et al.] // Brain Behav. Immun.
- 2011. - Vol. 25. - P. 1153-1161.
11. Probioticsincrease T regulatory cells and reduceseverity of experimental colitis in mice / H. Zhao [et al.] // World J Gastroenterol. - 2013. - Vol. 19, № 5. - P. 742749.
12. Psychosocial stress and inflammation in cancer / N. Powell [et al.] // Brain, Behavior and Immunity. - 2013. - Vol. 30. -P. 41-47.
13. T-bet and Gata3 in controlling type 1 and type 2 immunity mediated by innate lymphoid cells / T. Hoyler [et al.] // Curr Opin Immunol. - 2013. - Vol. 25, № 2. -P. 139-147.
14. T-bet: a bridge between innate and adaptive immunity / V. Lazarevic [et al.] // Nat Rev Immunol. - 2013. - Vol. 11. -P. 777-789.
15. Well-controlled pro-inflammatory cytokine responses of Peyer's patch cells to probiotic Lactobacillus casei / Y. Chiba [et al.] // Immunology. - 2010. - Vol. 130, №3. - P. 352-362.
CHANGES IN BALANCE OF T-HELPER SUBSETS IN THE GALT OF RATS UNDER CHRONIC ZOOSOCIAL STRESS AND MODULATION OF THE INTESTINAL MICROFLORA
I.A. Topol, A.M. Kamyshny
It was investigated the influence of chronic zoosocial stress (ZSS) and modulation of the intestinal microflora composition on the ratio of T-helper subsets in GALT.
It has been established that ZSS development was accompanied by an imbalance Tbet+/Gata3+- and Foxp3+/Roryt+-cells, indicating the dominance of Th1- and Th17-differentiation and increasing levels of pro-inflammatory signaling in the gut.
It was shown that the introduction of kanamycin to the stressed rats leads to the dominance of Th1- and Treg subsets, but modulation of the intestinal microflora lactobacterine reduces the ratio of Tbet+/Gata3+ - lymphocytes in the own lamina of mucous membrane of the fibres, increases in subepithelial zone and increases unidirectionally the ratio of Treg/Th17.
Keywords: stress, GALT, T-helper cells, Treg.
Топол И.А. - ассист. кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ЗГМУ.
E-mail: innatopol@yandex.ua.
Камышный А.М. - д-р мед. наук, доц., зав. кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии ЗГМУ.
