CC BY
61
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 617-001.35-092:612.017.1]-092.9
Саидов М.З., Далгатова А.А., Израилова Г.Р., Адуева С.М.
ИЗМЕНЕНИЯ АДАПТИВНОГО ИММУНИТЕТА КАК ЗВЕНО ПАТОГЕНЕЗА СИНДРОМА ДЛИТЕЛЬНОГО СДАВЛЕНИЯ
Дагестанская государственная медицинская академия, 367000, г. Махачкала, Россия
Изучение изменений адаптивного иммунитета при синдроме длительного сдавления (СДС) является перспективным, поскольку патогенетически обоснованные средства иммунокоррекции при СДС существенно повышают эффективность лечебных мероприятий, принятых в медицине катастроф.
Целью исследования явилось изучение состояния адаптивного иммунитета на экспериментальной модели СДС в зависимости от степени тяжести СДС, сывороточных уровней провоспалительных цитокинов и кортизола. Модель СДС воспроизводилась у крыс путем наложения металлических тисков с площадью сдавливающей поверхности 5—6 см2. Тиски накладывались на 2; 4 и 6 ч на задние лапки под тиопенталовым наркозом, и тем самым воспроизводились I, II и III степени тяжести СДС.
Показано, что I и II степени тяжести СДС сопровождаются достоверным (p < 0,05) снижением количества лейкоцитов в крови, и эти изменения происходят на фоне абсолютной и относительной лимфопении и нейтрофилеза. Морфометрически при I степени СДС в лимфатических узлах, пейеровых бляшках, селезенке и тимусе плотность лимфоцитов достоверно превышает аналогичный показатель в контрольной группе (p < 0,01). При II и III степенях СДС плотность лимфоцитов снижается практически в два раза, но достоверно превышает показатели в контрольной группе крыс. Сывороточные уровни растворимых CD3G и CD19, обусловленные шеддингом этих гликопротеи-нов, а также кортизола, достоверно (p < 0,05) повышаются при СДС I, II и III степени тяжести. На этом фоне определяется достоверное увеличение (p < 0,05, p < 0,01) сывороточного уровня ТНФ-а, причём прямо пропорционально степени тяжести СДС. Концентрация ИЛ-6 и ИФ-y также достоверно превышала аналогичные показатели в контрольной группе, однако с увеличением степени тяжести СДС показатели этих цитокинов, напротив, пропорционально снижались.
Таким образом, на экспериментальной модели СДС показаны патогенетически важные изменения системы адаптивного иммунитета. Эти изменения претерпевают этапность в соответствии со степенью тяжести СДС и происходят на фоне несомненных признаков системного воспаления как ответа на эндотоксикоз продуктами рабдомио-лиза, достигающего своего максимума на этапе реваскуляризации мышечной ткани.
Ключевые слова: синдром длительного сдавления; эндотоксикоз; лейкоциты; лимфоциты; растворимые
CD3G и CD19; провоспалительные цитокины; ТНФ-а; ИЛ-6; ИФН-у. Для цитирования: СаидовМ.З., Далгатова А.А., Израилова Г.Р., Адуева С.М. Изменения адаптивного иммунитета как звено патогенеза синдрома длительного сдавления. Иммунология. 2016; 37(5): 262-267. DOI: 10.18821/0206-49522016-37-5-262-267
Saidov M.Z., Dalgatova A.A., Israilova G.R., Adueva S.M.
THE CHANGES OF ADAPTIVE IMMUNE SYSTEM AS A PATHOGENESIS LINK OF CRUSH SYNDROME
Dagestan State Medical Academy, 367000, Machachtkala
The study of changes of adaptive immunity in the crush syndrome (SDS) is promising because it is pathogenetically reasonable means of immunomodulation of SDS significantly increases the efficiency of therapeutic measures taken in disaster medicine.
The aim of the study was to investigate the status of adaptive immunity in an experimental model of SDS depending on the severity of SDS, the serum levels of proinflammatory cytokines and cortisol.
The SDS model was reproduced in rats by applying the metal vise with a compressing surface area of 5—6 cm2. The grip was applied at 2, 4 and 6 hours for hind legs under anesthesia tiopentalom and thereby played I, II and III degree of severity of SDS.
It is shown that I and II Stephenie the severity of SDS is accompanied by significant (p < 0.05) reduction in the number of leukocytes in the blood and these changes occur against the background of absolute and relative lymphopenia and neutrophilia. Morphometric when I grade SDS in lymph nodes, Peyer's patches, spleen and thymus lymphocyte density significantly higher than in the control group (p < 0.01). At II and III degrees of SDS, the density of lymphocytes is reduced by almost two times, but significantly higher than the values in the control group of rats. Serum levels of soluble CD19 and CD3G due to leddingham of these glycoproteins, and cortisol significantly (p < 0.05) increase in SDS I, II and III severity. Against this background, determined a significant increase (p < 0.05, p < 0.01) the serum level of TNF-a and directly proportional to the severity of SDS. The concentration of IL-6 and if-Y also significantly higher than in the control group, however, increasing severity of SDS indicators these cytokines, in contrast, are proportionally decreased. Thus, in an experimental model SDS shown pathogenetically important changes to the system of adaptive immunity. These changes occur in stages according to the severity of SDS and occur on the background of the unmistakable signs of systemic inflammation, as a response to endotoxicosis products rhabdomyolysis, which reaches its maximum at the stage of revascularization of muscle tissue.
Keywords: crush syndrome; endotoxemia; white blood cells; lymphocytes; CD19 and CD3G soluble; Pro-inflammatory
cytokines; TNF-а; IL-6; IFN-y. For citation: Saidov M.Z., Dalgatova A.A., Israilova G.R., Adueva S.M. The changes of adaptive immune system as a pathogenesis link of crush syndrome. Immunologiya.2016; 37(5): 262-267. DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-5-262-267
Для корреспонденции: Саидов Марат Зиявдинович, д-р мед. наук, проф., зав. каф. патологической физиологии, E-mail: marat2002@ pochta.ru
ORIGINAL ARTICLE
For correspondence: SaidovMaratSiyavdinovich, Dr. med. Sciences, prof., head. dep. of pathological physiology, E-mail: marat2002@pochta.ru
conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Funding. The study had no sponsorship.
Received 13.05.16 Accepted 07.06.16
Синдром длительного сдавления (СДС) (краш-синдром, травматический токсикоз, компрессионная травма, травматический рабдомиолиз, миоренальный синдром и др.) — комплекс специфических патологических процессов, развивающихся после освобождения раненых из-под завалов (после землетрясения, цунами, взрывов в жилых домах и др.), связанных с возобновлением кровообращения в травмированных и длительно ишемизированных тканях, прежде всего мышечной. Реперфузия ишемизированной мышечной ткани через один и более часов индуцирует тяжелый генерализованный эндотоксикоз, плазмопотерю, болевой шок и полиорганную недостаточность с ведущей ролью острой почечной недостаточности. Степень указанных нарушений обусловливает периодизацию СДС с достаточно автономными механизмами и принципами лечения этих больных. Летальность при СДС тяжелой степени особенно при больших землетрясениях может достигать 80% [1].
Основными патогенетическими звеньями СДС являются ишемия и венозный застой в поперечно-полосатых мышцах, реперфузионная токсемия (гипермиоглобулинемия, гипер-калиемия, попадание в кровоток продуктов распада белков, стресс-факторы и др.), воспаление, метаболический ацидоз, плазмопотеря, синдром диссеминированного внутрисосу-дистого свертывания, болевой синдром вплоть до шока, нарастающая острая почечная, дыхательная, сердечная недостаточность, респираторный дистресс-синдром, постише-мический отек тканей, острая гиповолемия с гемоконцентра-цией и угрозой формирования гиповолемического шока [1, 2]. Столь широкий спектр патологических процессов и состояний при СДС обусловливает уникальное качество компрессионной травмы — многокомпонентность патогенеза на фоне действия единственного этиологического фактора — длительного сдавления поперечно-полосатых мышц.
Очевидно, что травматический эндотоксикоз, воспаление, гипермиоглобулинемия, метаболический ацидоз и плазмопо-теря оказывают непосредственное воздействие на органы и клетки врожденного и адаптивного иммунитета, обусловливая формирование иммунопатологии при СДС. Известно, что степень тяжести, прогноз и исход СДС во многом зависят от состояния общей реактивности организма, где ведущая роль принадлежит системе иммунитета [3]. Показано, что при краш-синдроме в эксперименте лимфоидные органы, печень, легкие инфильтрируются нейтрофилами и мононуклеар-ными клетками вплоть до клеточных агрегатов, возрастает уровень миелопероксидазы (МПО), ненасыщенных жирных кислот, обусловливающих формирование оксидативного стресса [4]. Гемодинамические изменения в органах иммунной системы, усиление эндотоксикоза у больных с сочетан-ной и множественной травмой, сопровождающейся рабдоми-олизом, связано с высоким содержанием в сыворотке крови провоспалительных цитокинов — ИЛ-ф, ИЛ-6, у-ИФ, что свидетельствует о выраженности воспалительной реакции при СДС [5]. Иммуногистохимические исследования показали, что степень тяжести компрессионной травмы мышц на экспериментальных моделях связана с увеличением гистологических зон воспалительной клеточной инфильтрации и фиброза, усилением продукции провоспалительных цитоки-нов — ИЛ-ip, ИЛ-6 и ТНФ-а in situ и наличием признаков активации макрофагов и фибробластов [6]. В клетках печени, легких и почек после 12-часовой компрессии нижних ла-
пок крыс определяли разрывы ДНК, что свидетельствует о значительной роли генетических изменений токсемической этиологии в патогенезе СДС [7]. Этот процесс сопряжен со снижением внутриклеточного синтеза белков — в цитозоль-ном компартменте на 32,7%, митохондриях — на 49% [8]. Значительна роль апоптоза в генезе СДС. TUNEL-анализ показал, что на мышиной модели ишемии/реперфузии кам-баловидной мышцы мышей существенно возрастает уровень апоптотических телец в клетках почек и миоцитах [9], а также в лейкоцитах, инфильтрирующих зону повреждения [10]. Весьма интересны данные, касающиеся вовлеченности клеток и рецепторов врожденного иммунитета в патогенез СДС. Показано, что супрессия пролиферативного ответа спленоцитов in vitro на мышиной модели компрессионной травмы сопряжена с TLR4- и TLR9-NF-kB сигнальными путями. Одновременно авторы показывают вовлеченность TLR2+ и TLR4+-спленоцитов в начальные этапы системного воспаления и адаптивного иммунного ответа при СДС, однако этот ответ не зависел от TLR9+-спленоцитов, подчеркивая тем самым селективность функционального предназначения TLR [11]. Показано, что экспериментальный краш-синдром индуцирует повышенный синтез ядерного протеина макрофагов — HMGB1. Этот протеин связывается с TLR4 макрофагов и, активируя эти клетки, вынуждает их продуцировать экстремально высокие уровни сывороточного ТНФ-а [12]. Очевидна патогенетическая общность системного воспаления и транзиторной активации врожденного и адаптивного иммунитета при СДС. Высокие дозы дексаметазона, уменьшающие выраженность воспаления при СДС, а также инги-бирующие транзиторную активацию врожденного и адаптивного иммунитета, достоверно снижают смертность крыс по истечении 48 ч после реперфузии [13].
Таким образом, на сегодняшний день существуют достаточно убедительные данные, свидетельствующие о патогенетической значимости изменений в системе врожденного и адаптивного иммунитета при СДС. Это положение является точкой отсчета при обосновании применения средств иммуно-коррекции в комплексном лечении такого тяжелого состояния, как СДС.
Цель настоящего исследования — изучение состояния адаптивного иммунитета на экспериментальной модели СДС в зависимости от степени тяжести СДС, сывороточных уровней провоспалительных цитокинов и кортизола.
Материал и методы
Эксперименты проведены на крысах-самцах Вистар 8—12-месячного возраста, массой 150—180 г. Животных содержали в стандартных условиях и диете в виварии кафедры патофизиологии ДГМА. Работу с животными проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных. Приложения № 1, 2, 3, 4» [idbas.comcor.ru/bioetica/bioetic1.doc].
Модель СДС воспроизводили у крыс наложением металлических тисков площадью сдавливающей поверхности 5—6 см2. Тиски накладывали на 2; 4 и 6 ч на задние лапки под тиопента-ловым наркозом (0,2—0,3 мл 10% раствора тиопентала на одну особь). При этом сила сдавливания была максимальной, но не нарушающей целостность костей нижних конечностей. Такая модель является общепринятой и позволяет точно воспроизводить степень компрессионной травмы. Животные выводились
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
из эксперимента декапитациеи под наркозом с последующим забором крови в пробирку с антикоагулянтом и органов системы иммунитета — тимуса, селезенки, пейеровых бляшек и региональных лимфатических узлов.
Экспериментальные животные разделены на 3 группы: 1-я группа — крысы (n = 15) с СДС легкой степени (I степень тяжести), время сдавливания — 2 ч; 2-я группа (n = 15) с СДС средней степени (II степень тяжести), время сдавливания — 4 ч; 3-я группа (n = 15) с СДС тяжелой степени (III степень тяжести), время сдавливания — 6 ч и контрольная группа крыс (n = 10).
После сепарации органов системы иммунитета материал фиксировали в 10% нейтральном формалине в течение 24 ч. Затем кусочки ткани подвергали спиртовой дегидратации, пропитывали в горячем парафине и заливали в блоки. С блоков готовились 4 мкм гистологические срезы и после депарафиниза-ции окрашивались гематоксилином и эозином. Все полученные препараты подвергли морфометрии. Морфометрические показатели определяли подсчетом количества нейтрофилов, лимфоцитов и эозинофилов в нескольких полях зрения при ув. 400 с выведением средней арифметической. Для подсчета выбирали наиболее типичные для данного препарата поля зрения.
Подсчет общего количества лейкоцитов проводили с применением стандартной методики, согласно которой после лизиса эритроцитов 3% раствором уксусной кислоты и разведения полученной клеточной взвеси 1:20 подсчитывали абсолютное число клеток в камере Горяева. Относительный уровень нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов и эозинофилов в периферической крови крыс подсчитывался на мазках крови после их окрашивания по Романовскому—Гимза при ув. 400.
Уровень CD3G в сыворотке крови определяли методом твердофазного ИФА на наборах «Rat T-cell surface glycoprotein CD3 gamma chain ELISA Kit» компании Cusabio, кат. № CSB-EL004933RA.
Сывороточный уровень CD19 определяли на наборах твердофазного ИФА «Rat cluster of differentiation 19 (CD19) ELISA Kit» компании Cusabio, кат. № CSB-E14095r
Уровень кортизола в сыворотке крови определяли на наборах твердофазного ИФА «Rat cortisol ELISA Kit» компании Cusabio, кат. № CSB-E05112e Результаты анализов CD3G, cD19 и кортизола замерялись на многоканальном спектрофотометре Stat Fax 2600, Awreness, Technology Inc., США, в двухволновом режиме, основной фильтр — 450 нм, референс-фильтр — 540 или 570 нм и выражались в нг/мл.
Сывороточный уровень ТНФ-а определяли на наборах твердофазного ИФА «Rat TNF-а ELISA Kit» компании Cusabio, кат. № CSB-E11987r
Сывороточный уровень ИФН-у определяли на наборах твердофазного ИФА «Rat Interferon у (IFN-y) ELISA Kit» компании Cusabio, кат. № CSB-E04579r
Сывороточный уровень ИЛ-6 определяли на наборах твердофазного ИФА «Rat Interleukin 6 (IL-6) ELISA Kit» компании Cusabio, кат. № CSB-E04640e Результаты анализов ТНФ-а, ИФН-у и ИЛ-6 замерялись на многоканальном спектрофотометре Stat Fax 2600, Awreness, Technology Inc., США в двухволновом режиме, основной фильтр — 450 нм, референс-фильтр — 540 или 570 нм, и выражались в пг/мл.
(Ме) с 25; 75 процентилями. Для определения достоверности различий между двумя сравниваемыми выборками использовался критерий Манна—Уитни. При множественных сравнениях пользовались критериями Крускала—Уолеса и Данна. Различия считали статистически достоверными при уровне значимости p < 0,05.
Результаты и обсуждение
Примененная нами экспериментальная модель СДС позволяет достаточно точно воспроизводить степень тяжести компрессионной травмы в соответствии с принятой в клинической практике классификацией СДС [1]. Все экспериментальные животные с СДС I и II степени тяжести (2 и 4 ч сдавливания соответственно) на этапе реперфузии пораженных участков тела выжили, а все крысы с СДС III степени (6 ч сдавливания) после снятия тисков умерли. Очевидно, что степень эндотоксикоза и полиорганной недостаточности пропорциональна времени компрессионной травмы, и длительность в 5—6 ч и более является критической относительно выживаемости пораженных животных.
Изменения абсолютного и относительного количества ядросодержащих клеток крови крыс в зависимости от степени тяжести СДС представлены в табл. 1.
Прежде всего обращает на себя внимание очень интересная зависимость. Видно, что общее количество лейкоцитов при СДС I и II степени тяжести достоверно уменьшается по сравнению с контрольной группой: 2,7 (2; 3,5) и 2,3 (1,8; 3) против 6 (3;5,2), p < 0,05, в то время как при СДС III степени на этапе реперфузии тканей общий уровень лейкоцитов практически не отличается от контрольной группы. При этом уровень лейкоцитов периферической крови при СДС I и II степени тяжести также достоверно (p < 0,05) отличается от аналогичного показателя при СДС III степени. Вероятно, указанные различия имеют перераспределительный характер, и мобилизация депонированных лейкоцитов достигает максимального уровня при СДС III степени. На этом фоне уровень лимфоцитов достоверно снижается при всех степенях тяжести СДС по сравнению с контрольной группой (p < 0,05, p < 0,01 соответственно). Очевидно, что абсолютная и относительная лимфоцитопения, сопутствующая компрессионной травме, может быть признаком транзиторного иммунодефицита, индуцированного в том числе и выбросом корой надпочечников в системную циркуляцию избытка кортикостероидов, как стресс-реакция при СДС. Изменения уровня моноцитов аналогичны. Определяется достоверное снижение (p < 0,05, p < 0,01) этих клеток при всех степенях тяжести СДС по сравнению с контрольной группой. В целом полученные результаты соответствуют данным литературы по клеточным реакциям крови в динамике декомпрессионного периода [14].
Диаметрально противоположные изменения определяются в отношении уровня нейтрофилов периферической крови.
Таблица 1
Количество ядросодержащих клеток в крови крыс при СДС I, II и III степени тяжести, Me (25; 75 процентили)
Статистическая обработка полученных результатов
Обработку данных проводили с помощью статистического пакета Statistica 6.0, а также Biostat 4.03. База данных создавалась с использованием редактора электронных таблиц Microsoft Excel 2007. Непрерывные переменные в исследуемых выборках представлены в виде медианы
Показатель Общее количество лейкоцитов, тыс./мкл Лимфоциты, % Нейтрофилы, % Эозино-филы, % Моноциты, %
I степень СДС, n = 15 2,7 (2; 3,5)* 43 (40; 44)** 54 (49; 56)** 0 4 (3; 6)*
II степень СДС, n = 15 2,3 (1,8; 3)* 38 (36; 40)** 59 (56; 61,7)** 0 3 (2; 3,7)**
III степень СДС, n = 15 5,9 (3,8; 6,8) 37,5 (31; 41)* 58(54; 65,7)* 0 3 (2,7; 4,2)*
Контроль, n = 10 6 (3; 5,2) 60 (51; 66,7) 31,5 (25; 37) 2 (1,2; 3) 7,5 (4; 8,7)
* p < 0,05, ** p < 0,01 по сравнению с контрольной группой (T-критерий
Примечание. Манна—Уитни).
ORIGINAL ARTICLE
Таблица 2
результаты морфометрических исследований органов иммунной системы у крыс при сДс I, II и III степени тяжести, Me (25; 75 процентили)
Показатель Лимфатические узлы Пейеровы бляшки Тимус Селезенка
Л Нф Л Нф Л Нф Л Нф
I степень СДС, n = 15 400 (340; 450)** — 200 (160; 275)* 3 (2,5; 6,5) 400 (370; 540)** — 260 (200; 365)** 4 (2; 6)
II степень СДС, n = 15 200(160; 225) — 180 (155; 200)* — 190(110;235) — 180 (155; 200)** 7 (5; 8)
III степень СДС, n = 15 250 (215; 300) 2,5 (2; 3,5) 100 (85; 100)* — 150 (120; 180)* — 190 (150; 145)* 4 (3,5; 4)
Контроль, n = 10 230 (202; 250) — 125 (105; 145) — 197 (183; 200) — 110 (100; 120) —
Примечание. Л — лимфоциты, Нф — нейтрофилы. * — p < 0,05, ** — p < 0,01 по сравнению с контрольной группой (Г-критерий Манна—Уитни).
Таблица 3
Уровень растворимых cD3G, cD19 и кортизола в сыворотке крови крыс при сДс I, II и III степени тяжести, Me (25; 75 процентили)
Показатель
CD3G, нг/мл
CD19, нг/мл
Кортизол, нг/мл
I степень СДС, n = 15
II степень СДС, n = 15
III степень СДС, n = 15
0,4 (0,2; 0,5)* 0,32 (0,2; 0,38)* 25,5 (18,9; 52)*
0,5 (0,45; 0,8)* 0,3 (0,26; 0,4)*
0,5 (0,2; 0,55)* 0,3 (0,28; 0,34)*
Контроль, n = 10 0,25 (0,2; 0,3) 0,16 (0,1; 0,2)
23 (21,46)*
44 (33,106)** 3 (2,5; 3,0)
Примечание.
- p < 0,05,
- p < 0,01 по сравнению с контроль-
ной группой (Г-критерий Манна—Уитни).
Как видно из табл. 1, этот уровень достоверно превышает показатель в контрольной группе при всех трех степенях тяжести СДС: 54 (49; 56), 59 (56; 61,7) и 58 (54;65,7) против 31,5 (25; 37), p < 0,05,p < 0,01). Последнее обстоятельство имеет важное патогенетическое значение. Компрессионная травма всегда сопровождается развитием системного воспаления, обусловленного в том числе повышенной выработкой провоспалительных цито-кинов. Нейтрофилез при СДС помимо связи с провоспалитель-ными цитокинами является также свидетельством активации этих клеток и прежде всего их фагоцитарной функции, которая, как известно, является доминирующий в отношении элиминации клеточного детрита при рабдомиолизе [15, 16].
На фоне описанных изменений количества циркулирующих клеток крови при СДС различной степени тяжести очень интересными выглядят вариации клеточной плотности в лимфоидных органах в зависимости от степени тяжести СДС. Результаты морфометрии представлены в табл. 2.
Определяется закономерность, состоящая в том, что при I степени СДС в лимфатических узлах, пейеровых бляшках, селезенке и тимусе плотность лимфоцитов достоверно превышает аналогичный показатель в контрольной группе (p < 0,01). При II и III степенях СДС плотность лимфоцитов снижается практически в два раза, но тем не менее достоверно превышает показатели в контрольной группе крыс. Очевидно, что компрессионная травма длительностью до 6 ч сопровождается реактивным перераспределением лимфоцитов: из периферической крови они депонируются в лимфоидных органах. Этот процесс многофакторный. Во-первых, на фоне выраженного увеличения уровня кортизола в крови при СДС (см. ниже) вполне объяснимо выглядит лимфоцитопения в периферической крови. Стероид-индуцированный апоптоз лимфоцитов — хорошо известное явление. Одновременно эн-дотоксикоз при СДС, при сохраненной васкуляри-зации лимфоидных органов, также способствует
перераспределению лимфоцитов из периферической циркуляции в лимфоидную ткань. Будучи активированными, лимфоциты и моноциты, находящиеся в микроокружении лимфоидных органов, ответственны на гиперпродукцию провоспалительных цитокинов (см. ниже) и индукцию аутоиммунного ответа на продукты рабдомиолиза. На этом фоне интересно поведение нейтрофилов. Выраженный нейтрофилез в периферической крови при всех степенях тяжести СДС не сопровождается скоплением этих клеток в лимфоидных органах. Как видно из табл. 2, определяются единичные нейтрофилы во всех органах системы иммунитета за исключением тимуса. Однако эти клетки скапливаются в ткани поврежденных мышц на этапе реваскуляриза-ции, где усиливается их фагоцитарная функция [16].
В табл. 3 представлены результаты изучения уровня растворимых CD3G и СЭ19, а также кортизола в крови крыс при СДС.
Прежде всего обращает на себя внимание резкое, достоверное увеличение уровня кортизола в сыворотке крови при I, II и III степенях тяжести СДС по сравнению с контролем: 25,5 (18,9; 52), 23 (21;46) и 44 (33;106) соответственно, против 3 (2,5; 3), р < 0,01), что является отражением стресс-реакции на рабдомиолиз. Причем III степень СДС сопровождается еще более выраженным двукратным увеличением уровня кортизола по сравнению с СДС I и II степени тяжести. Очевидно, что экстремальное повышение уровня корти-зола в крови имеет далекоидущие последствия, в частности индукции стероид-опосредованного апоптоза лимфоцитов и уменьшение степени инфильтрации лимфоцитами лимфоидных органов (при II и III степени тяжести СДС плотность лимфоцитов практически в два раза меньше по сравнению с I степенью тяжести СДС).
На этом фоне уровни растворимых CD3G и CD19 при всех степенях тяжести СДС достоверно превышают аналогичные показатели в контрольной группе (р < 0,05, р < 0,01). Факт
Таблица 4
Уровень провоспалительных цитокинов и кортизола в сыворотке крови крыс при сДс I, II и III степени тяжести, Me (25; 75 процентили)
Показатель
ТНФ-а, пг/мл
ИФН-у, пг/мл
ИЛ-6, пг/мл
Кортизол, нг/мл
I степень СДС, n = 15
II степень СДС, n = 15
III степень СДС, n = 15
0,73 (0,3; 1,5)* 0,97 (0,8; 1,2)* 3,4 (2,4; 4,2)* 25,5 (18,9; 52)*
0,9 (0,5; 1,7)** 0,8 (0,6; 1,1) 3,2 (1,7; 3,5) 23 (21; 46)*
1,23 (0,5; 1,6)* 0,75 (0,5; 1,1) 2,6 (2,4; 3,4) 44 (33,106)*
Контроль, n = 10
0,2 (0,14; 0,3) 0,7 (0,5; 0,9) 2,3 (1,8; 2,
3 (2,5; 3,0)
Прим ечание . * (T-критерий Манна—
p < 0,05, Уитни).
- p < 0,01 по сравнению с контрольной группой
**
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
крайне интересный. Шеддинг гликопротеинов CD3G и CD19 с поверхности Т- и В-лимфоцитов свидетельствует о транзитор-ной активации этих клеток, вероятно, вследствие интенсивного эндотоксикоза с потенциалом аутоиммунного ответа на продукты рабдомиолиза. Аргументом в пользу последнего предположения служат данные, согласно которым при травматическом повреждении нервной ткани гиперпродукция провоспалитель-ных цитокинов НФ-ß, ИЛ-6 и ИЛ-22 индуцирует синтез ИЛ-17 Т-клетками, принимающими участие в том числе и в индукции аутоиммунитета и воспаления [15]. Обращает на себя внимание отсутствие вариаций уровня растворимых CD3G и CD19 в зависимости от степени тяжести СДС: 0,4 (0,2; 0,5), 0,5 (0,45; 0,8) и 0,5 (0,2; 0,55) против 0,25 (0,2; 0,3) в контроле в отношении CD3G и 0,32 (0,2; 0,38), 0,3 (0,26; 0,4) и 0,3 (0,28; 0,34) против 0,16 (0,1; 0,2) в контроле в отношении CD19. Вероятно, Т- и В-клетки «сбрасывают» растворимые CD3G и CD19 независимо от уровня сывороточных продуктов рабдомиолиза.
Что же касается продукции провоспалительных цито-кинов при СДС, то полученные результаты представлены в табл. 4.
Видно, что поведение ТНФ-а, ИЛ-6 и ИФН-у, несмотря на то что все они относятся к группе провоспалительных цитоки-нов, неоднозначно. Прежде всего обращает на себя внимание достоверное увеличение (p < 0,05, p < 0,01) ТНФ-а при всех трех степенях тяжести СДС по сравнению с контрольной группой. Причем увеличение степени тяжести СДС сопровождается пропорциональным увеличением сывороточного уровня ТНФ-а. III степень тяжести СДС также ассоциирована с максимальным уровнем сывороточного кортизола — 44 (33,106) нг/мл. Факт примечательный. Пропорциональное степени тяжести СДС увеличение сывороточного уровня ТНФ-а является следствием нарастания признаков системного воспаления при СДС. Одновременно синергичное максимальное увеличение уровня кортизола в сыворотке увеличивает эффективность апоптоза лимфоцитов, поскольку ТНФ-а-опосредованный апоптоз (так же как и кортизол-опосредованный) — хорошо известное явление. Именно эти факты лежат в основе лим-фоцитопении, достигающей своего максимума при СДС III степени (см. табл. 1). Диаметрально противоположная ситуация определяется в отношении сывороточных уровней ИЛ-6 и ИФ-у. Видно, что концентрация этих цитокинов превышает аналогичные показатели в контрольной группе, достигая уровня статистической значимости при I степени тяжести СДС (p < 0,05). Примечательно, что увеличение степени тяжести СДС связано с пропорциональным уменьшением уровня ИФН-у и ИЛ-6. В отношении ИФН-у эта градация выглядит следующим образом: 0,97 (0,8; 1,2), 0,8 (0,6; 1,1) и 0,75 (0,5; 1,1) соответственно при I, II и III степени тяжести СДС и в отношении ИЛ-6 — 3,4 (2,4; 4,2), 3,2 (1,7; 3,5) и 2,6 (2,4; 3,4) соответственно при I, II и III степени тяжести СДС. Вероятно, усиление эндотоксикоза при увеличении степени тяжести СДС ингибирует продукцию этих цитокинов, свой вклад в этот процесс вносит и нарастающая соответственно степени тяжести СДС абсолютная и относительная лимфоцитопения (см. табл. 1).
Таким образом, на экспериментальной модели СДС показаны патогенетически важные изменения системы адаптивного иммунитета, выражающиеся в относительной и абсолютной лимфоцитопении, реактивном перераспределении монону-клеаров периферической крови в органах иммунной системы, гиперпродукции провоспалительных цитокинов — ТНФ-а, ИФН-у и ИЛ-6, гиперпродукции кортизола, увеличении сывороточных уровней растворимых CD3G и CD19. Эти изменения претерпевают этапность в соответствии со степенью тяжести СДС и происходят на фоне несомненных признаков системного воспаления как ответа на эндотоксикоз продуктами рабдомио-лиза, достигающего своего максимума на этапе реваскуляриза-ции мышечной ткани. Полученные результаты подтверждают перспективность дальнейших исследований проблемы СДС и
прежде всего возможности применения средств иммунокоррек-ции. Очевидно, что подобный подход существенно увеличит клиническую эффективность комплекса лечебных мероприятий, принятых в медицине катастроф.
ЛИТЕРАТУРА
1. Шапошников Ю.Г., Маслов В.И. Военно-полевая хирургия. Москва: Национальное руководство; 1995.
2. Zimmerman J.L., Shen M.C. Rhabdomyolysis. Chest. 2013; 144(3): 1058—65.
3. Flohe S.B., Flohe S., Schade F.U. Invited review: deterioration of the immune system after trauma: signals and cellular mechanisms. Innate Immun. 2008; 14(6): 333—44.
4. Sqarby M.W., Silva B.A., Peres C.M. et al. Leukocyte infiltration in lung, muscle and liver after limb compression in rats. Pathophysiology. 2013; 20(2): 111—6.
5. Кудлай Д.А., Ефремов А.В., Начаров Ю.В. и др. Провоспалительные цитокины сыворотки крови больных с сочетанной и множественной травмой, сопровождающейся рабдомиолизом. Вестник Российской военно-медицинской академии. 2007; 17(1): 49—52.
6. Bunn J.R., Canning J., Burke G. et al. Production of consistent crush lesions in murine quadriceps muscle — a biomechanical, histomorphological and immunohistochemical study. J. Orthop. Res. 2004; 22(6): 1336—44.
7. Neto J.C., Sgarbi M.W., Gomes de Moura C.F. et al. Limb compression induces multi-system genetic damage in rats. Pathophysiology. 2013; 20(4): 237—41.
8. Guevorkian A.G., Kanayan A.S., Chailian G.G. et al. The influence of hypothalamic cytokine PRP on protein synthesi in brain subellular compartment in crush syndrome. Cent. Nerv. Syst.Agents Med. Chem. 2011; 11(3): 184—8.
9. Nishikata R., Kato N., Hiraiwa K. Oxidative stress may be involved in distant organ failure in tourniquet shok model mice. Leg. Med. 2014; 16(2): 70—5.
10. Stratos I., Graff J., Rotter R. et al. Open blunt crush injury of different severity determines nature and extent of local tissue regeneration and repair. J. Orthop. Res. 2010; 28(7): 950—7.
11. Darwiche S., Ruan X., Hoffman M.K. Selective Roles for TollLike Receptors 2, 4 and 9 in the Systemic Inflammation and Immune Dysfunction Following Peripheral Tissue Injury. J. Trauma Acute Care Surg. 2013; 74(6): 1454—61.
12. Yang H., Hreggvidsdottir H.S., Palmblad K. et al. A critical cysteine is required for HMGB1 binding to Toll-like receptor 4 and activation of macrophage cytokine release. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2010; 107(26): 11942—7.
13. Murata I., Ooi K., Shoji S. et al. Acute lethal crush-injured rats can be successfully rescued by a single injection of high-dose dexamethasone through a pathway involving P13K-Akt-eNOS signaling. J. Trauma Acute Care Surg. 2013; 75(2): 241—9.
14. Ефремов Ф.В., Радустов В.Ю., Самсонова Е.Н., Цырендоржиев Д.Д. Клеточные реакции периферической крови бронхоальвеолярной и лаважной жидкости в динамике декомпрессионного периода экспериментального синдрома длительного сдавления. Вестник новых медицинских технологий. 2044; 11(4): 20—2.
15. Walsh J.T., Kipnis J. Regulatory T cells in CNS injury: the simple, the complex, and the confused. Trends Mol. Med. 2011; 17(10): 541—7.
16. Tidball J.G., Villalta S.A. Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2010; 298(5): 1173—87.
REFERENCES
1. Shaposhnikov U.G., Maslov V.I. Military surgery, Moscow. National guidance. 1995. (in Russian)
2. Zimmerman J.L., Shen M.C. Rhabdomyolysis. Chest. 2013; 144(3): 1058—65.
3. Flohe S.B., Flohe S., Schade F.U. Invited review: deterioration of the immune system after trauma: signals and cellular mechanisms. Innate Immun. 2008; 14(6): 333—44.
4. Sqarby M.W., Silva B.A., Peres C.M. et al. Leukocyte infiltration in lung, muscle and liver after limb compression in rats. Pathophysiology. 2013; 20(2): 111—6.
5. Kudlai D.A., Efremov A.V., Nacharov Y.V. et al. Proinflammatory cytokines in blood serum of patients with combined and multiple injuries accompanying by rhabdomyolysis. Vestnic Rossiyskoy voenno-meditsinskoy academii. 2007; 17(1): 49—52. (in Russian)
6. Bunn J.R., Canning J., Burke G. et al. Production of consistent crush lesions in murine quadriceps muscle — a biomechanical, histomorphological and immunohistochemical study. J. Orthop. Res. 2004; 22(6): 1336—44.
7. Neto J.C., Sgarbi M.W., Gomes de Moura C.F. et al. Limb compression induces multi-system genetic damage in rats. Pathophysiology. 2013; 20(4): 237—41.
8. Guevorkian A.G., Kanayan A.S., Chailian G.G. et al. The influence of hypothalamic cytokine PRP on protein synthesi in brain subellular compartment in crush syndrome. Cent. Nerv. Syst. Agents Med. Chem. 2011; 11(3): 184—8.
9. Nishikata R., Kato N., Hiraiwa K. Oxidative stress may be involved in distant organ failure in tourniquet shok model mice. Leg. Med. (Tokyo). 2014; 16(2): 70—5.
10. Stratos I., Graff J., Rotter R. et al. Open blunt crush injury of different severity determines nature and extent of local tissue regeneration and repair. J. Orthop. Res. 2010; 28(7): 950—7.
11. Darwiche S., Ruan X., Hoffman M.K. Selective Roles for TollLike Receptors 2, 4 and 9 in the Systemic Inflammation and Immune Dysfunction Following Peripheral Tissue Injury. J. Trauma Acute Care Surg. 2013; 74(6): 1454—61.
12. Yang H., Hreggvidsdottir H.S., Palmblad K. et al. A critical cysteine is
ORIGINAL ARTICLE
required for HMGB1 binding to Toll-like receptor 4 and activation of macrophage cytokine release. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2010; 107(26): 11942—7.
13. Murata I., Ooi K., Shoji S. et al. Acute lethal crush-injured rats can be successfully rescued by a single injection of high-dose dexamethasone through a pathway involving P13K-Akt-eNOS signaling. J. Trauma Acute Care Surg. 2013; 75(2): 241—9.
14. Efremov A.V., Radustov V., Samsonova E., Tsyrendorzhiev D. Cellular reactions of blood serum and bronchoalveolar lavage in dynamics of a decompression period of an experimental crush-syndrome. Vestnic novykh meditsinskikh technologiy. 2044; 11(4): 20—2. (in Russian)
15. Walsh J.T., Kipnis J. Regulatory T cells in CNS injury: the simple, the complex, and the confused. Trends Mol. Med. 2011; 17(10): 541—7.
16. Tidball J.G., villalta S.A. Regulatory interactions between muscle and the immune system during muscle regeneration. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2010; 298(5): 1173—87.
Поступила 13.05.16 Принята в печать 07.06.16
КЛИНИЧЕСКАЯ ИММУНОЛОГИЯ
© ЗАЙЦЕВА н.с., СИЗЯКИНА Л.П., 2016 УДК 616.1/.3-092:612.017.1]-057.36
Зайцева Н.С., Сизякина Л.П.
ДИСФУНКЦИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ В СТРУКТУРЕ КОМОРБИДНОЙ ПАТОЛОГИИ У ВОЕННОСЛУЖАЩИХ — ВЕТЕРАНОВ БОЕВЫХ ДЕЙСТВИЙ В ОТДАЛЕННОМ ПЕРИОДЕ НАБЛЮДЕНИЯ
ГБОУ ВПО Ростовский государственный медицинский университет Минздрава России, 344022, г Ростов-на-Дону, Россия
Проведено длительное динамическое наблюдение за военнослужащими — участниками боевых действий, у которых в условиях экстремальных воздействий боевого стресса впервые дебютировала артериальная гипер-тензия. В отдаленном периоде выявлено развитие тяжелой коморбидной патологии деструктивного характера (нарушения мозгового кровообращения, инфаркт миокарда, сердечная недостаточность, язвенная болезнь, сахарный диабет). Выполнена оценка основных звеньев иммунной системы у ветеранов боевых действий. Выявлена сохранность процессов созревания и дифференцировки Т-клеточного звена, сопровождающаяся достоверным увеличением количества клеток, находящихся на поздней стадии активации и усилением готовности к апоптозу. Для Т-лимфоцитов-хелперов и лимфоцитов, обладающих цитотоксической активностью, выявлено превалирование процессов поздней активации. Отмечена супрессия процессов созревания В-лимфоцитов при сохранности их функции и нормальном уровне основных 3 классов иммуноглобулинов. Выявлено снижение фагоцитарной активности и адаптационных резервов нейтрофилов в НСТ-тесте.
Ключевые слова: иммунная дисфункция; коморбидность; боевой стресс.
Для цитирования: Зайцева Н.С., Сизякина Л.П. Дисфункция иммунной системы в структуре коморбидной патологии у военнослужащих — ветеранов боевых действий в отдаленном периоде наблюдения. Иммунология. 2016; 37(5): 267-270. DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-5-267-270
Zaitseva N.S., Sizyakina L.P.
THE IMMUNE DYSFUNCTION IN THE STRUCTURE OF COMORBID DISEASES IN THE COMBATANTS IN THE LATE PERIOD OF OBSERVATION
Rostov state medical university Health Ministry of Russian Federation, 344022, Rostov-on-Don
Long-term dynamic monitoring of the combatants with stress-inducted arterial hypertension was conducted. Development of severe destructive comorbid diseases (cerebrovascular accident, myocardial infarction, heart failure, peptic ulcer, diabetes mellitus) was identified. Evaluation of the main parts of the immune system in combat veterans was done. Processes of maturation and differentiation of T-cell were saved. The number of cells at the late stage of activation and amplification of willingness to apoptosis was increased. For T-lymphocytes — helpers and cytotoxic lymphocytes late activation processes prevailed. Suppression of maturation of B-lymphocyte function with safety of their normal level of three major classes of immunoglobulins was marked. Decrease in the phagocytic activity of neutrophils and adaptation reserves in the NST test revealed.
Keywords: immune dysfunction; comorbidity; combat stress.
Для корреспонденции: Зайцева Наталия Сергеевна, канд. мед. наук, доцент каф. клинической иммунологии и аллергологии, E-mail: n.zaitseva@list.ru
