CC BY
31
НОРМАЛЬНАЯ И ПАТОЛОГИЧЕСКАЯ
ФИЗИОЛОГИЯ
УДК 612.217
ИЗМЕНЕНИЕ ВЕНТИЛЯТОРНОГО ОТВЕТА НА ГИПЕРКАПНИЮ ПРИ ЭКЗОГЕННОМ ПОВЫШЕНИИ УРОВНЯ ИНТЕРЛЕЙКИНА-1БЕТА В КРОВИ И ЦЕРЕБРОСПИНАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ*
Г.А. Данилова1, Н.П. Александрова1, В.Г. Александров2
гФГБУН «Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН», г. Санкт-Петербург, 2ФГБОУ ВПО «Российский государственный педагогический университет им. А.И. Герцена»,
г. Санкт-Петербург
В экспериментах на наркотизированных трахеостомированных крысах исследовалось влияние основного провоспалительного цитокина интерлейкина-1р (ИЛ-1Р) на вентиляторный ответ при действии гиперкапнического стимула. Установлено, что повышение содержания ИЛ-1Р в цереброспинальной жидкости вызывает снижение вентиляторной чувствительности к гиперкапнической стимуляции: наблюдается снижение прироста минутного объема дыхания, дыхательного объема и средней скорости инспираторного потока, отражающей уровень центральной инспираторной активности. Также установлено, что в отличие от церебровентрикулярного введения ИЛ-1Р его внутривенное введение не вызывает ослабления вентиляторной чувствительности к гиперкапнии. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что повышение церебрального уровня провоспалительных цитокинов может оказывать влияние на механизмы центральной хе-морецепции.
Ключевые слова: центральная, периферическая хеморецепция, цитокины, внешнее дыхание, гиперкапния.
Введение. Как известно, в основе регуляции дыхания лежат реакции дыхательной системы на изменение газового состава артериальной крови. Общий уровень легочной вентиляции определяется интенсивностью афферентной импульсации, поступающей в дыхательный центр от центральных и периферических хеморецепторов. При этом важнейшая роль отводится центральным хеморе-цепторам, так как их активация при повышении содержания углекислого газа в артериальной крови вызывает увеличение вентиляции легких, необходимое для удаления избытка СО2 из организма и поддержания газо-
* Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда, проект № 15-15-00119.
вого гомеостаза. Поэтому при исследовании участия того или иного фактора в регуляции функции дыхания важно знать, как он влияет на центральную хеморецепцию и вентиляторную чувствительность к гиперкапниче-скому стимулу.
В настоящее время известно, что цито-кины играют важную роль в нейроиммунных взаимодействиях, участвуя в межклеточной коммуникации в качестве нейромодуляторов, оказывающих прямое или опосредованное действие на клетки центральной нервной системы [4-6, 9]. Это дает основание предполагать участие цитокинов в центральной регуляции различных физиологических функций, в т.ч. и функции дыхания [3].
Участие цитокинов в контроле дыхания подтверждается и результатами иммуноги-стохимических исследований, которые показали наличие экспрессии цитокинов и их рецепторов в ядре солитарного тракта и вен-тролатеральном отделе продолговатого мозга, т.е. в тех областях ствола, которые принимают непосредственное участие в управлении дыханием [7, 8, 13]. Кроме того, в последние годы были установлены некоторые экспериментальные факты, которые дают основание для предположений об участии про-воспалительных цитокинов в хеморефлек-торных механизмах регуляции дыхательной функции.
Значительный подъем церебрального и системного уровней провоспалительных ци-токинов происходит при различных видах стресса, увеличении нагрузки на дыхательную систему, травмах головного мозга, инсультах и ишемии [5, 6, 11, 16]. С другой стороны, при таких условиях часто наблюдаются изменение паттерна дыхания, снижение вентиляторной чувствительности к гиперкапнии, развитие патологических типов дыхания (ап-нейзисы, гаспинги).
В связи с вышеперечисленными фактами актуальным становится исследование возможных последствий увеличенной продукции провоспалительных цитокинов и механизмов их влияния на функцию дыхания. При этом приоритетным направлением является изучение роли цитокинов в механизмах гиперкапнической хеморецепции, так как они лежат в основе регуляции функции дыхания и формирования адаптивных реакций дыхательной системы [2]. К тому же до сих пор нет ясности в вопросе о том, как реализуются респираторные влияния провоспалительных цитокинов, могут ли они участвовать в рефлекторных механизмах регуляции дыхания, оказывать активирующее или угнетающее действие на вентиляционную функцию легких, модифицировать чувствительность дыхательной системы к изменению газового состава крови.
Цель исследования. Анализ изменений вентиляторного ответа и его составляющих на гиперкапническую стимуляцию центральных хеморецепторов возвратным дыханием
гиперкапнически-гипероксической газовой смесью до и после повышения церебрального и системного уровня ИЛ-фВ с целью определения участия иммунных механизмов в регуляции центральной хеморецепции.
Материалы и методы. Эксперименты проводились на 16 трахеостомированных спонтанно дышащих крысах-самцах линии Wistar, весом 250-300 г, наркотизированных внутрибрюшинным введением уретана из расчета 1400 мг/кг. Все эксперименты на животных были проведены с соблюдением основных норм и правил биомедицинской этики (European Community Council Directives 86/609/EEC).
В экспериментах применялась пневмота-хографическая методика для регистрации объемно-временных параметров внешнего дыхания. При помощи миниатюрной пнев-мометрической трубки MLT-1L (ADInsru-ments), обеспечивающей ламинарность воздушного потока, регистрировалась объемная скорость воздушного потока (пневмотахо-грамма).
По пневмотахограмме измерялась максимальная скорость вдоха, длительность вдоха и выдоха, рассчитывалась частота дыхания (ЧД). Для определения дыхательного объема (ДО) производилось интегрирование пневмо-тахографической кривой. Минутный объем дыхания (МОД) рассчитывался как произведение величины дыхательного объема на количество дыхательных движений за одну минуту. Средняя скорость инспираторного потока (Уинс), являющаяся косвенным показателем центральной инспираторной активности, рассчитывалась как частное от деления величины дыхательного объема на продолжительность вдоха.
Известно, что полипептиды, которыми являются и цитокины, не проходят через ге-матоэнцефалический барьер, так как это крупные молекулы. Поэтому эффекты при системном и центральном введении ИЛ могут быть разными. Для того чтобы выяснить, влияет ли наличие барьерных структур на респираторные эффекты интерлейкина, было проведено две серии экспериментов. В одной серии экспериментов вещество вводилось в кровь через бедренную вену, в другой - в це-
реброспинальную жидкость в обход гемато-энцефалического барьера.
В первой серии экспериментов микроинъекции ИЛ-ip производились в правый боковой желудочек головного мозга при помощи шприца Гамильтона. Координаты для введения канюли определялись по стереотаксиче-скому атласу мозга крысы [14] и составляли 0,8 мм каудальнее уровня bregma, 1,5 мм ла-теральнее средней линии и 3,5-4,0 мм в глубину от поверхности черепа. Введение канюли по данным координатам неоднократно использовалось нами в экспериментах и показало хорошую точность попадания в боковой желудочек мозга [1]. С помощью бормашины рассверливалось трепанационное отверстие, в которое вводилась направляющая канюля, укрепленная на стереотаксической головке. В ходе эксперимента в канюлю погружался микроинъектор, через который в боковой желудочек мозга вводилось 10 мкл раствора, содержащего 500 нг ИЛ-ф, со скоростью 1 мкл/мин.
Во второй серии экспериментов в кровеносную систему через бедренную вену вводилось 500 нг ИЛ-1Р, разведенного в 0,1 мл раствора.
Для оценки вентиляторной чувствительности к гиперкапническому стимулу использовался метод возвратного дыхания [15]. Вентиляторная чувствительность определялась с помощью построения кривых роста вентиляции и ее составляющих при увеличении содержания СО2 в альвеолярном воздухе. Изменение состава альвеолярного воздуха достигалось дыханием гиперкапнически-гипероксической газовой смесью. Парциальное давление углекислого газа в альвеолярном воздухе (РЕТСО2) измерялось при помощи квадрупольного масс-спектрометра МС 7-100 (ИАП РАН, Санкт-Петербург).
При регистрации вентиляторного ответа на гиперкапническую стимуляцию использовалась азотно-гиперкапнически-гиперокси-ческая смесь (60 % О2 и 7 % СО2 в азоте). Продолжительность проведения пробы с возвратным дыханием составляла 4 мин.
Статистическая обработка данных про-
водилась с помощью однофакторного дисперсионного анализа программными средствами Microsoft Excel. Вычислялась средняя величина регистрируемых параметров и ошибка средней. Различия считались достоверными при уровне вероятности p<0,05.
Результаты и обсуждение. Интравен-трикулярное введение ИЛ-lß в цереброспинальную жидкость вызывало увеличение дыхательного объема, минутного объема дыхания, средней скорости инспираторного потока. Достоверные изменения в параметрах дыхания наблюдались через 15-20 мин после введения препарата, достигая максимальных значений на 40-й мин после введения ИЛ-lß.
Увеличение частоты дыхания через 40 мин после интравентрикулярного введения интерлейкина не было статистически значимым. Величина дыхательного объема достоверно возрастала на 13 % через 40 мин действия ИЛ-lß и на 17 % через 60 мин. Вследствие роста глубины дыхания и небольшого увеличения частоты происходило достоверное увеличение минутной вентиляции легких в среднем на 40 %. Средняя скорость инспираторного потока, отражающая величину центральной инспираторной активности, возрастала на 20 % (табл. 1).
Введение интерлейкина в бедренную вену приводило к повышению уровня ИЛ-ф в циркуляторном русле, что вызывало такие же изменения в величине респираторных параметров, как и повышение его церебрального уровня (табл. 1). Увеличение дыхательного объема начиналось через 20 мин после введения ИЛ-ф, становясь статистически значимым через 35-40 мин и превышая фоновый уровень на 36 %, а через 60 мин - уже на 40 %. При этом частота дыхания не возрастала. Достоверное увеличение минутного объема дыхания начиналось через 25 мин после начала введения ИЛ-ф и через 40 мин превышало фоновый уровень в среднем на 23 %. Средняя скорость инспираторного потока в этот период увеличивалась на 20 %. Интра-вентрикулярное и внутривенное введение физиологического раствора не оказывало влияния на паттерн дыхания.
Таблица 1
Объемно-временные параметры дыхания до и после церебрального и внутривенного введения ИЛ-10
Параметр Церебральное введение ИЛ-1Р (п=8) Внутривенное введение ИЛ-1Р (п=8)
фон 40 мин 60 мин фон 40 мин 60 мин
МОД, мл/мин 104,0±9,0 126,0±3,7** 131,0±5,4** 117,0±10,6 143,0±12,8** 146,0±12,0**
ДО, мл 1,00±0,05 1,13±0,06* 1,17±0,04* 1,00±0,08 1,36±0,07** 1,40±0,07**
ЧД, цикл/мин 109,0±6,0 117,0±6,8 118,0±6,4 113,0±7,0 106,0±9,0 105,0±8,0
^нс, мл/с 3,70±0,27 4,40±0,12* 4,50±0,19* 3,80±0,55 4,20±0,36 4,30±0,40*
Примечание. Различия по сравнению с исходными данными достоверны при: * - р<0,05; ** - р<0,01.
При возвратном дыхании по мере постепенного усиления гиперкапнической стимуляции наблюдалось увеличение дыхательного объема, минутного объема дыхания и средней скорости инспираторного потока (показателя центральной инспираторной активности) как до введения вещества, так и после его церебрального введения. Однако под действием ИЛ-1Р угол наклона к оси абсцисс линий тренда, характеризующий зависимость между величиной регистрируемых параметров и степенью хеморецепторной стимуляции дыхания, изменялся.
На рис. 1 показаны линии тренда, отражающие зависимость между увеличением парциального давления СО2 в альвеолярном газе и увеличением минутного объема дыхания до и после интравентрикулярного и системного введения ИЛ-1р. После введения ИЛ-1Р в цереброспинальную жидкость угол наклона вентиляторной кривой к оси абсцисс снижается, что свидетельствует об уменьшении вентиляторной чувствительности к ги-перкапнии. Эти изменения наблюдаются через 20 мин, максимально выражены через 40 мин и исчезают к 90-й мин, линии тренда становятся параллельными (рис. 1а). Такие же изменения наблюдались при регистрации ДО и средней скорости инспираторного потока: наклон линий тренда, характеризующих зависимость ДО и скорости инспираторного
потока от напряжения углекислого газа в артериальной крови, снижался после действия ИЛ-1Р.
Внутривенное введение ИЛ-1Р в кровеносное русло не оказывало достоверного влияния на компоненты вентиляторного ги-перкапнического ответа, в отличие от повышения церебрального уровня цитокина. Угол наклона линий тренда, характеризующий зависимость МОД от интенсивности гиперкап-нического стимула, практически не изменялся (рис. 1б).
Проведение количественных расчетов показало достоверное снижение величины прироста респираторных параметров в ответ на гиперкапническую стимуляцию на фоне действия ИЛ-1Р при его центральном введении и отсутствие достоверных изменений этой величины при системном введении ИЛ-1р. Расчет величины прироста регистрируемых параметров при увеличении РЕТСО2 на 1 мм рт. ст. показал, что через 40 мин после интравентрикулярного введения интер-лейкина прирост МОД уменьшался на 47 %, ДО и скорости инспираторного потока - на 40 % по сравнению с фоновыми величинами. При внутривенном введении статистически значимых различий в приростах вентиляторных параметров до и после действия ИЛ-1Р обнаружено не было (рис. 2).
Рис. 1. Изменение МОД при возвратном дыхании гиперкапнической газовой смесью: а) при интравентрикулярном введении; б) при системном введении.
По оси ординат - минутный объем дыхания, мл/мин; по оси абсцисс - парциальное давление СО2 в альвеолярном газе. Сплошная линия - до введения ИЛ-1Р, линии 1-1, 2-2, 3-3, 4-4 - через 20, 40, 60, 90 мин после введения ИЛ-1Р соответственно
Рис. 2. Влияние ИЛ-1Р на прирост респираторных параметров при увеличении РЕТСО2 в альвеолярном газе на 1 мм рт. ст.: а) средней скорости инспираторного потока; б) минутной вентиляции; в) дыхательного объема.
Светлые столбцы - до введения ИЛ-1Р (фон), черно-белые столбцы - после церебрального введения ИЛ-1Р, черные столбцы - после системного введения ИЛ-1р. По оси ординат - изменение регистрируемых параметров в процентах по отношению к фону
Полученные данные свидетельствуют о снижении вентиляторной чувствительности к гиперкапнии при повышении содержания ИЛ-1Р в цереброспинальной жидкости, что определяется влиянием этого цитокина на механизмы центральной хеморецепции, так как периферические хеморецепторы при дыхании использованной нами гиперкап-нически-гипероксической газовой смесью (7 % СО2, 60 % О2) не участвуют в формиро-
вании вентиляторных ответов. Это вызвано тем, что большое содержание кислорода в данной дыхательной смеси резко снижает активность периферических хеморецепторов. Известно, что фоновая активность периферических хеморецепторов исчезает при напряжении кислорода в артериальной крови, равном уже 200 мм рт. ст. [12], тогда как в наших экспериментах напряжение кислорода превышало 400 мм рт. ст.
Обнаруженное снижение прироста средней скорости инспираторного потока при ги-перкапнической стимуляции на фоне повышенного церебрального уровня ИЛ-1Р указывает на ослабление реакции центральной ин-спираторной активности, что в свою очередь и вызывает снижение прироста ДО и МОД. Это еще раз подтверждает, что ослабление вентиляторной чувствительности к гиперкап-нии было связано с влиянием ИЛ-1Р на центральные механизмы, участвующие в хемо-рецепторной регуляции дыхания. Известно, что для формирования центральной инспира-торной активности и ее динамики большое значение имеет интенсивность афферентного потока, поступающего от центральных хемо-рецепторов, локализованных в хемочувстви-тельных зонах вентральной поверхности ствола мозга, к нейронам дорсальной респираторной группы, расположенной в вентро-латеральной области ядра одиночного тракта. Импульсы от хеморецепторов активируют расположенный здесь пул а-инспираторных нейронов.
Логично предположить, что обнаруженный нами респираторный эффект интерлей-кина мог проявляться либо через его влияние непосредственно на центральные хеморецеп-торы, снижая их чувствительность к гипер-капническому стимулу, либо через модуляцию синаптического взаимодействия между инспираторными нейронами дыхательного центра. В результате и в том, и в другом случае гиперкапническая стимуляция вызывала меньшую, чем в обычных условиях, активацию а-инспираторных нейронов. Ослабление а-инспираторной активности в свою очередь снижало сократительную активность дыхательных мышц, что и уменьшало прирост дыхательного объема и вентиляции легких в ответ на увеличение гиперкапнической стимуляции.
Полученные нами данные об ингиби-рующем влиянии провоспалительного цито-кина на вентиляторный гиперкапнический ответ косвенно подтверждаются исследованием, проведенным на мышах с мышечной дистрофией, которые имеют ослабленную вентиляторную реакцию на гиперкапнию по сравнению с нормальными мышами. У таких
животных конкурентное устранение провос-палительного цитокина ТОТ-а (посредством удаления гена для ТОТ-а) значительно улучшает вентиляторный ответ на гиперкапнию, что указывает на угнетение этого ответа эндогенно продуцируемым ТОТ-а [18]. Авторы этой статьи связывают угнетение вентиляторного ответа с ухудшением сократимости мышечных волокон диафрагмы, вызванным повреждающим действием провоспалитель-ного цитокина. Наши данные позволяют предположить, что такой эффект мог быть вызван и центральным действием данного цитокина. Оно выражается в том, что эндогенно продуцируемый ТОТ-а, который является провоспалительным цитокином, очень близким к ^-1р, может угнетать ту часть центрального дыхательного механизма, которая ответственна за хеморецепторную регуляцию дыхания.
Заключение. Результаты данного исследования позволяют сделать выводы об участии основного провоспалительного цитоки-на ИЛ-1Р в хеморецепторных механизмах регуляции дыхания. Ослабление вентиляторной чувствительности к гиперкапнии при повышении церебрального уровня ИЛ-1Р свидетельствует о его ингибирующем влиянии либо на центральные хеморецепторы, либо на синаптические взаимодействия между нейронами дыхательного центра. Повышение уровня ИЛ-1Р в кровеносном русле не оказывает влияния на гиперкапнический вентиляторный ответ, указывая на то, что гематоэн-цефалический барьер препятствует проявлению центрального действия циркулирующих провоспалительных цитокинов.
1. Александрова Н. П. Влияние гамма-ами-номасляной кислоты на инспираторно-тормозя-щий рефлекс Геринга-Брейера / Н. П. Александрова, В. Г. Александров, Т. Г. Иванова // Российский физиологический журн. им. И. М. Сеченова. -
2008. - Т. 94, № 12. - С. 1356-1364.
2. Александрова Н. П. Дыхательные мышцы человека: три уровня управления / Н. П. Александрова, И. С. Бреслав // Физиология человека. -
2009. - Т. 35, № 2. - С. 103-111.
3. Александрова Н. П. Цитокины и рези-стивное дыхание / Н. П. Александрова // Физиология человека. - 2012. - Т. 38, № 2. - С. 119.
4. Мюльберг А. А. Цитокины как медиаторы нейроиммунных взаимодействий / А. А. Мюльберг, Е. В. Гришина // Успехи физиологических наук. - 2006. - Т. 37, № 1. - C. 18.
5. Филиппова Л. В. Интерорецепция и ней-роиммунные взаимодействия / Л. В. Филиппова, А. Д. Ноздрачев. - СПб. : Наука, 2007. - 295 с.
6. Brain cytokines and chemokines: roles in ischemic injury and pain / M. Minami [et al.] // J. Pharmacol. SBraM006striM0loi0(bf- Ey46ine m RNA induced by systemic administration of interleukin-lbeta or tumor necrosis factor alpha / L. Churchill [et al.]
// Bran Res. - 2006. - Vol. 1120, № 1. - P. 64.
8. Cafeteria feeding induces interleukin-1beta mRNA expression in rat liver and brain / M. K. Hansen [et al.] // Am. J. Physiol. - 1998. - Vol. 274, № 6 (pt. 2). - P. 1734-1739.
9. Characterization of chemokines and their receptors in the central nervous system: physiopathological impli-cations / A. Bajetto [et al.] // J. Neur-chem1 & 2Byt2k4nVD]ai&2 . <tePad$fe1iergy restriction in stable chronic obstructive pulmonary disease patients / I. Godoy [et al.] // Eur. Respir. J. - 2003. - Vol. 22. -P. 920.
11. Does systemic inflammation trigger local exercise-induced oxidative stress in COPD? / C. Koech-lin [et al.] // Eur. Respir. J. - 2004. - Vol. 23. - P. 538.
12. Hayashi F. The ventilatory response to hypoxia in the anesthetized rat / F. Hayashi // Pflugers Arch. - 1983. - Vol. 396, № 2. - P. 121-127.
13. Nadeau S. Effect of circulation tumor necrosis factor on the neu-ronal activity and expression of the genes encoding the tumor necrosis factor (p55 and p75) in the rat brain: a view from the blood-brain barrier / S. Nadeau, S. Rivest // Neuroscience. -1999. - Vol. 93, № 4. - P. 1449.
14. Paxinos G. The rat brain in stereotaxic coordinates / G. Paxinos, C. Watson. - London : Academic Press, 1982.
15. Rebuck A. S. Measurement of ventilatory response to CO2 by rebreathing / A. S. Rebuck // Chest. - 1976. - Vol. 70 (suppl.). - P. 118-121.
16. Sleep apnoea and daytime sleepiness and fatigue: relation to visceral obesity, insulin resistance, and hyper-cytokinemia / A. N. Vgontzas [et al.] / J. Clin. Endocrinol. Metab. - 2000. - Vol. 85. -P. 1151.
17. Vassilakopoulos T. Ventilatory muscle activation and in-flammation: cytokines, reactive oxygen species, and nitric oxide / T. Vassilakopoulos, S. N. Hu-sain // J. Appl. Physiol. - 2007. - Vol. 102. -P. 168S-1^ntilatory dysfunction in mdx mice: impact of tumor necrosis factor-alpha deletion / L. E. Gosselin [et al.] // Muscle Nerve. - 2003. - Vol. 28. -P. 336-343.
THE CHANGE IN VENTILATORY RESPONSE ON THE HYPERCAPNIA DURING EXOGENOUS INCREASE IN THE CEREBRAL LEVEL OF PRO-INFLAMMATORY CYTOKIN IL-ip
G.A. Danilova1, N.P. Aleksandrova1, V.G. Aleksandrov2
1Pavlov Institute of Physiology RAS, St. Petersburg, 2Herzen State Pedagogical University of Russia, St. Petersburg
In experiments on anesthetized tracheostomized rats the influence of the main proinflammatory cytokine interleukin-ip (IL-ip) on the ventilatory hypercapnic response was investigated. During the hypercapnic rebreathing experiments it was obtained that the exogenous elevation of IL-ip level in the cerebrospinal fluid causes a decrease in sensitivity to hypercapnia: IL-ip weakens the ventilatory, tidal volume and mean inspiratory flow responses to carbon dioxide. Intravenous administration of IL-ip did not cause any changes in hypercapnic ventilatory response. The data obtained suggest participation of pro-inflammatory cytokines in mechanisms of central breathing control and central chemoreception.
Keywords: central and peripheral chemoreception, cytokines, external respiration, hypercapnia.
