CC BY
24
Рыкун О.В.1, Ломоватская Л. А.2, Романенко А.С.3 ©
'К.б.н.; 2д.б.н.; 3д.б.н.; профессор, лаб. физиологии устойчивости растений, Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, Иркутск
ИЗМЕНЕНИЕ УРОВНЯ цАМФ В ВАКУОЛЯХ КЛЕТОК КОРНЕПЛОДОВ СТОЛОВОЙ СВЕКЛЫ ПРИ БИОТИЧЕСКОМ СТРЕССЕ
Аннотация
Показано, что в клетках корнеплодов столовой свеклы присутствуют вакуоли двух типов, отличающиеся по плавучей плотности: «сахарные» и «солевые». Вторичный мессенджер аденилатциклазной сигнальной системы - цАМФ был выявлен в обоих типах вакуолей. Его концентрация значительно отличалась в них, и более того, была неодинакова на начальной и глубокой стадиях покоя корнеплода. Воздействие биотического стрессора (заражение корнеплодов свеклы Botritis cinerea) оказывало сильное влияние на изменение уровня цАМФ в обоих типах вакуолей. Совокупность данных фактов свидетельствует о том, что эти органеллы, помимо общеизвестных запасающих и литических функций, активно участвуют в трансдукции внутриклеточных сигналов при биотическом стрессе на разных стадиях покоя корнеплода.
Ключевые слова: столовая свекла, «сахарные» вакуоли, «солевые» вакуоли, цАМФ, начало покоя, глубокий покой, Botritys cinerea.
Keywords: red beet, «sugar» vacuoles, «salt» vacuoles, cAMP, rest beginning, deep rest, Botritys cinerea.
Одним из механизмов, определяющих устойчивость растений, является активация или ингибирования внутриклеточных сигнальных систем, так как именно они дифференцируют поступающие сигналы и обеспечивают соответствующие защитные ответы клетки. В настоящее время считается общепринятым, что органеллы растительных клеток, обладающие собственным геномом, также участвуют в обмене сигнальными молекулами. Одной из особенностей растительных клеток является наличие центральной вакуоли -своеобразного «внеклеточного пространства» внутри клетки, выполняющего более разнообразные функции, чем принято считать в настоящее время. Так, в вакуолях уже найдены компоненты ряда сигнальных систем, в частности, НАДФН-оксидазной и кальциевой [1;2]. Кроме того, она имеет тесные контакты с другими органеллами [3], которые могут облегчать обмен вторичными мессенджерами.
Известно, что циклический аденозинмонофосфат (цАМФ) - вторичный мессенджер аденилатциклазной сигнальной системы, принимает участие в ответной реакции растений на различные виды стрессов [4]. Исходя из этого, представляло интерес исследовать изменение активности аденилатциклазной сигнальной системы (АСС) в вакуолях клеток корнеплодов столовой свеклы при биотическом стрессе, а именно, при инфицировании. Растительным материалом служили корнеплоды столовой свёклы (Beta vulgaris L.) сорта Бордо на стадиях начала и глубокого покоя. Биотический стресс создавали заражением здоровых корнеплодов мицелием фитопатогенного гриба Botritys cinerea, входящим в состав кагатной (серой) гнили. Инфицирование корнеплода проводили следующим образом: на верхнюю его часть, в месте выхода листьев, наносили мицелий гриба и выдерживали корнеплоды в темноте при 10°С. При выделении вакуолей из инфицированных корнеплодов некротизированную паренхиму удаляли, и использовали соседние живые ткани, не содержащие гифов гриба. Выделение вакуолей проводили модифицированным макрообъемным методом, разработанным в лаборатории физиологии растительной клетки СИФИБР СО РАН [5]. В результате получали
© Рыкун О.В., Ломоватская Л.А., Романенко А.С., 2013 г.
две фракции вакуолей, отличающихся по плавучей плотности и внутреннему составу: «солевые» вакуоли, которые содержали ионы калия, натрия и кислые аминокислоты, и «сахарные» вакуоли, в которых присутствовали сахароза, раффиноза, глюкоза и фруктоза [5]. Концентрацию цАМФ в вакуолях и среде инкубации определяли ИФА с применением первичных поликлональных антител против цАМФ и вторичных поликлональных антител, меченных пероксидазой [6]. Исследования показали, что в фазе начала покоя (октябрь-ноябрь) уровень цАМФ в среде инкубации значительно превосходил таковой в вакуолях обоих типов (рис. 1). При этом в «солевых» вакуолях уровень данного вторичного мессенджера был в 4 раза выше, чем в «сахарных» (рис. 1). При инфицировании уровень цАМФ в «солевых» вакуолях практически не изменялся, но более чем в 3 раза возростал в «сахарных» вакуолях (рис.1). При этом выход цАМФ в среду инкубации значительно снижался в обоих типах органелл, но в большей степени в «сахарных» вакуолях. На стадии глубокого покоя (февраль-март) соотношение уровня внутривакуолярного и секретируемого за пределы компартмента цАМФ изменилось в различной степени в вакуолях обоих типов. В «солевых» вакуолях уровень цАМФ возрос более, чем в 12 раз, а в «сахарных» почти в 30 раз по сравнению с периодом начала покоя.
Рис. 1. Содержание цАМФ (нмоль/мг белка) в вакуолях клеток корнеплода столовой свеклы в
период начала покоя (октябрь-ноябрь)
В то же время сильное снижение его концентрации произошло только в среде инкубации «солевых» вакуолей (рис.2). Инфицирование в период глубокого покоя почти не отразилось на содержании цАМФ в обоих типах вакуолей, однако в среде инкубации его уровень снизился, особенно у «сахарных» вакуолей (рис.2).
253
щ
® г оо
153
100
53
1
МЕИ НфиЦИр[]ВаННЫЕ ИНф-И ЦИрЗВаННЫЕ КЕрНаПЛОДЫ КарНЕПЛЗДЫ
| :аяарныЕ бе к;'с л и среда инкубации I "голевые" вакуоли 'града инкубации
Рис. 2. Содержание цАМФ (нмоль/мг белка) в вакуолях клеток корнеплода столовой свеклы в
период глубокого покоя (февраль-март)
Полученные данные свидетельствует о том, что в фазе начала покоя, несмотря на отсутствие ростовых процессов, сохраняется довольно высокая функциональная активность аденилатциклазной сигнальной системы вакуоле, причем значительная его часть транспортировалась за пределы этой органеллы. Напротив, в период максимального (глубокого) покоя корнеплода основной пул цАМФ был сосредоточен в вакуолях (рис. 1,2). Именно в этот период происходит замедление метаболизма в корнеплоде, и одним из механизмов реализации этого является депонирование большого пула вторичных мессенджеров в этих органеллах.
Иначе выглядит реакция АСС вакуолей на долговременный биотический стресс. На стадии начала покоя активность этой сигнальной системы в вакуолях обоих типов снизилась, что сопровождалось снижением концентрации цАМФ в среде их инкубации. В то же время в глубоком покое картина кардинально изменилась: только в «сахарных» вакуолях выход в среду инкубации за пределы вакуолей вторичного мессенджера был сведен к минимуму.
По литературным данным одним из регуляторов активности АСС являются фитогормоны [7;8], а их соотношение и концентрация в корнеплодах столовой свеклы значительно меняются в различные периоды покоя [9]. Кроме того, концентрация фитогормонов также варьирует под воздействием инфицирования [7]. Можно предположить, что наблюдаемый отклик сигнальной системы связан с разным уровнем фитогормонов в различные периоды покоя. Кроме того, фосфодиэстераза, инактивируюшая данную сигнальную молекулу путем превращения ее в нециклическую форму, чувствительна к некоторым фитогормонам[10].
Подводя итог изложенным результатам, можно сделать следующий вывод: в неинфицированных корнеплодах свеклы в период относительно высокой функциональной активности, в фазе начала покоя (октябрь-ноябрь) большая часть цАМФ выходит за пределы выделенных «солевых» и «сахарных» вакуолей. Напротив, в период глубокого покоя корнеплода (февраль-март) максимальный уровень цАМФ сосредоточен в вакуолях, особенно это справедливо в случае «солевых» вакуолей. Несмотря на достигнуты в экспериментальной и теоретической биофизике прогресс [11-24] данная актуальная проблема требует дальнейшего изучения.
Литература
1. И.М. Андреев - Роль вакуоли в редокс - гомеостазе растительных клеток // Физиол. растений. -2012. - Т.59. - №5. - С. 660-667.
2. Е.В. Прадедова, О.Д. Ишеева, Р.К. Саляев - Ферменты антиоксидантной защиты вакуолей корнеплодов столовой свеклы // Физиол. растений. - 2011. - Т.58. - №1. - С. 40-48.
3. Г.А. Великанов, Л.П. Белова, В.Ю. Леванов - Вакуолярный симпласт формируется посредством высокопроницаемого щелевого контакта мембраны эндоплазматического ретикулума с тонопластом // Физиол. растений. - 2008. - Т.55. - №6. - С.921-931.
4. Л.А. Ломоватская, А.С. Романенко, Н.В. Криволапова, и др. - Активность трансмембранной аденилатциклазы в клеточных органеллах растений картофеля при бактериальном патогенезе // ДАН. - 2006. - № 409 - С. 570-573.
5. Р.К. Саляев, В.Я. Кузеванов - Выделение и очистка вакуолей и вакуолярных мембран из клеток растений // Физиол. растений. - 1981. - №28. С.1295-1305.
6. L.A. Lomovatskaya, A.S. Romanenko, N.V. Filinova et al. - A modified ensame immunoassay method for determination of cAMP in Plant cells. In: Trends inimmunolabelled and related tecniques. Abuelzein: In Tech. - 2012. - Р.161-168.
7. W-S. Sim, H-R. Kim - Effect of GA3 on the cyclic AMP biosynthesis in maize seedling // Plant Cell Physiol. - 1987. - № 28. - Р. 415-420.
8. Ф.Г. Каримова, О.И. Тарчевская, С.А. Леонова и др. - Влияние фитогормонов на содержание цАМФ в растениях // Физиол. и биохим. культ. растений. - 1990. - №22. - С. 532-537.
9. Н.В. Озолина, Е.В. Прадедова, Р.К. Саляев - Динамика изменения гормонального статуса корнеплода столовой свеклы (Beta vulgaris L.) в онтогенезе и ее связь с динамикой накопления сахаров // Известия РАН. Сер. Биологич. - 2005. - № 1. - С.30-35.
10. И.В. Драговоз, С.Я. Коць, Т.И. Чехун и др. - Увеличение семенной продуктивности люцерны при обработке комплексным регулятором роста // Физиол. растений. - 2002. - № 49. - С. 925930.
11. Белослудцев К.Н., Миронова Г. Д. - Митохондриальная липидная пальмитат /Са2+-индуцированная пора и её возможная роль в деградации нервных клеток // Патолог. физиол. эксперимент. терапия. - 2012. - № 3. - С. 20-32.
12. Корякина Е.В., Севанькаев А.В. и др. - Цитогенетическое действие излучения импульсного реактора БАРС-6 в режиме непрерывного однократного импульсного воздействия со сверхвысокой мощностью дозы на лимфоциты человека // Радиац. биол. Радиоэкология. - 2005.
- Т.45. - № 4. - С.405-411
13. Подлубная З.А., Бобылёв А.Г. - О функциональных амилоидах мышечных белков семейства тайтина // Биофизика. - 2012. - Т.57. - С.751-755.
14. Sharapov M.G., Novoselov V.I. et al.- Cloning, expression and comparative analysis of peroxiredoxine 6 from different species.// Mol. Biol. (Mosk). - 2009. - P.505-511.
15. Гудков С.В., Каpп О.Э. и др. - Образование активных форм кислорода в воде под действием видимого и инфракрасного излучений в полосах поглощения молекулярного кислорода // Биофизика. - 2012. - Т.57. - №1. - С. 5-13.
16. Gudkov S.V., Garmash S.A., Shtarkman I.N. et al.- Long-lived protein radicals induced by x-ray irradiation are the source of reactive oxygen species in aqueous medium // Doklady Biochemistry and Biophysics. - 2010. - Т.430. - №1. - С. 1-4.
17. Asadullina N.R. et al. - Antioxidative and radiation modulating properties of guanosine-5'-monophosphate // Nucl. Nucl. Nucl. Acids.- 2010. - Т.29. - С.786-799.
18. Брусков В.И., Гудков С.В., Чалкин С.Ф. и др. - Автоколебательный процесс люминесценции воды, индуцированный лазерным облучением // Доклады Академии наук. - 2009. - Т.425. - №6.
- С. 827-829.
19. Gudkov S.V. et al. - Guanosine and inosine as natural antioxidants and radioprotectors for mice exposed to lethal doses of y-radiation // Doklady Biochemistry and Biophysics. - 2006. - Т.407. - №1.
- С. 47-50.
20. Асадуллина Н.Р. и др. - Кофеин модифицирует эффекты рентгеновского излучения при воздействии на мышей после облучения, проявляя радиозащитные свойства // Доклады АН. -2012. - Т.442. - №3. - С. 22-25.
21. Гудков С.В. и др. - Образование перекиси водорода в воде при воздействии видимого света // Вода: химия и экология. - 2010. - №8. - С. 40-45.
22. Гудков С.В., Гудкова О.Ю. и др. - Гуанозин и инозин как природные генопротекторы для клеток крови мышей при воздействии рентгеновского излучения // Радиац. Биол. Радиоэкол. - 2006. -Т.46. - С.713-718.
23. Гудков С.В., Черников А.В., Брусков В.И. - Влияние физиологически значимых анионов на образование активных форм кислорода в воде под действием тепла // Вода. Химия и Экология. -2013. - №10. - C. 88-92.
24. Chernikov A.V., Bruskov V.I., Gudkov S.V.- Heat-induced formation of nitrogen oxides in water // J. Biol. Phys. - 2013. - V.39. - P.687-699
