CC BY
86
УДК:619:615.099-08-092
ИЗМЕНЕНИЕ УРОВНЯ МОЛЕКУЛ СРЕДНЕЙ МАССЫ И ЭХИНОЦИТОЗ ПРИ ЛУЧЕВОЙ БОЛЕЗНИ
И ИНТОКСИКАЦИЯХ
В.Г.Скопичев
THE CHANGE OF THE LEVEL OF MEDIUM-WEIGHT MOLECULES AND THE ECHINOCYTOSIS UNDER THE RADIATION SICKNESS AND THE INTOXICATIONS
V.G.Skopichev
Институт сельского хозяйства и природных ресурсов НовГУ, fisiology@ya.ru
Изменения формы эритроцитов можно наблюдать при изменении физико-химических свойств крови и метаболизма её клеток. В патогенезе интоксикаций важное место принадлежит нарушениям конфигурации эритроцитов, которые могут иметь большое диагностическое значение и нести дополнительную информацию наряду с данными об их количестве, цветовом показателе и концентрации гемоглобина. Эхиноциты образуются при кренировании (т.е. образовании зубцов на плазмолемме) с различной степенью формирования выростов, которые впоследствии отпадают, при этом показано нарушение структуры и количества цитоскелетных белков. Происходит стабилизация опорных компонентов цитоскелета и активизация сократительных элементов, образование перекрестных сшивок между спектрином и гемоглобином. В верхней части вспучивания поверхности эхиноцита наблюдается уплотнение цитоскелетной структуры, а на боковой поверхности — кольцеобразная ориентация структурных элементов. Мембранный материал теряется путем микровезикуляции. Если нормальные эритроциты способны значительно деформироваться для прохождения по микроциркуляторному руслу, то появление шипов на мембране и содержание в эхиноцитах на 50—70% больше холестерина, чем в норме, обуславливает снижение способности к деформации. При эхиноцитарной трансформации существенно меняется и заряд поверхностной мембраны эритроцитов, который является необходимым условием для поддержания стабильности суспензии эритроциты — плазма. Изучена деформация эритроцитов крови крыс при отравлении фосфаколом и при воздействии ионизирующим облучением. Показано, что увеличение деформации эритроцитов зависит от дозы облучения. Это увеличение совпадает с увеличением содержания молекул средней массы в крови. Обсуждается роль этих изменений в патогенезе экзо- и эндоинтоксикаций. Ключевые слова: молекулы средней массы
The deformations of erythrocytes can be observed under the changes of physical and chemical properties of blood and the metabolism of its cells. In the pathogenesis of intoxications an important place belongs to the deformations of erythrocytes which can have a great diagnostic significance and provide additional information along with the data about their quantity, the colour index and the concentration of hemoglobin. The echinocytes form during the crenation (i.e. the formation of teeth on the plasmolemma) with different degree of the formation of projections, which drop away later, at the same time the deformation of the structure and the change of the quantity of cytoskeletal are shown. The basic components of cytoskeleton stabilize and the contractive elements become active, and the cross linking forms between a spectrin and hemoglobin. The induration of cytoskeletal structure is observed in the upper part of the bulging of the surface of an echinocyte, and the circular orientation of the structural elements is observed on the side surface. The membrane material is lost by means of the microvesiculation. If the normal erythrocytes are capable of the significant deformation for passing in the microcirculatory bloodsteam, so the appearance of teeth on the membrane and the content of cholesterol by 50-70% more than normal in echinocytes cause the impairement in the ability to the deformation. The charge of the outer cytoplasmic membrane of erythrocytes changes greatly under the transformation of echinocytes. This charge is an essential condition for the support of the stability of the suspension of erythrocytes — plasma. The deformation of the erythrocytes in the blood of rats under the poisoning with phosphacol and the influence of the ionizing radiation is studied. It is showed that the increase of the deformation of erythrocites depends on the radiation doses. This increase coincides with the increase of the content of medium-weight molecules in blood. The role of these changes in the pathogenesis of exogenous and endointoxications is discussed. Keywords: medium-weight molecules
В данной работе предпринята попытка установить взаимосвязь между повышением концентрации в сыворотке крови молекул средней массы (МСМ) и эхиноцитозом, установить частоту появления в крови эхиноцитов при интоксикациях эндогенной и экзогенной природы; установить зависимость между дозой фосфорорганической интоксикации (ФОИ) или степенью эндогенной интоксикации и эхиноцитозом. Под интоксикацией понимается болезненное состояние, обусловленное действием на организм экзогенных (например, ядов) или эндогенных токсинов (например, при лучевой болезни). МСМ причисляют к
числу веществ белковой природы, а также производным олигоспиртов и глюкуроновой кислоты, не осаждаемых трихлоруксусной кислотой и по этой причине могущих быть отнесенными к компонентам остаточного азота. Для многих видов интоксикаций характерно нарушение функционирования протеазной и антипротеазной систем. Основная часть МСМ представлена полипептидами с молекулярной массой 300—5000 Д, образующимися в результате активации протеолиза. Эта фракция включает в себя гормоны, нейропептиды, медиаторы иммунного ответа и многие другие продукты белкового обмена, в целом оп-
ределяющие высокую биологическую активность МСМ [1]. Наблюдается определенный параллелизм между накоплением МСМ в крови и индукцией процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), которые могут быть фактором генерации МСМ [2].
Изменения формы эритроцитов можно наблюдать при изменении физико-химических свойств крови и метаболизма её клеток. В патогенезе интоксикаций важное место принадлежит нарушениям конфигурации эритроцитов, которые могут иметь большое диагностическое значение и нести дополнительную информацию наряду с данными об их количестве, цветовом показателе и концентрации гемоглобина. В настоящее время установлены факты уменьшения числа нормоцитов (дискоцитов) и соответственного увеличения количества циркулирующих в крови эхи-ноцитов при экзотоксикозах, неспецифических заболеваниях, туберкулезе легких.
Эхиноциты образуются при кренировании (т.е. образовании зубцов на плазмолемме) с различной степенью формирования выростов, которые впоследствии отпадают, при этом показано нарушение структуры и количества цитоскелетных белков. Происходит стабилизация опорных компонентов цитоскелета и активизация сократительных элементов, образование перекрестных сшивок между спек-трином и гемоглобином. В верхней части вспучивания поверхности эхиноцита наблюдается уплотнение цитоскелетной структуры, а на боковой поверхности — кольцеобразная ориентация структурных элементов [3].
Нормальные эритроциты способны значительно деформироваться для прохождения по микроцир-куляторному руслу [4, 5]. При эхиноцитарной трансформации существенно меняется и заряд поверхностной мембраны эритроцитов, который является необходимым условием для поддержания стабильности суспензии эритроциты — плазма. Эхиноцитоз влечёт за собой агрегацию эритроцитов и является одной из причин нарушения кровообращения [6, 7]. Например, отравление фосфорорганическими соединениями (ФОС) протекает как экзотоксический шок, наблюдаются изменения артериол, капилляров и венул, конгломераты эхиноцитов закупоривают дистальные участки кровеносного русла, что способствует централизации кровообращения [8].
Материалы и методы
Были проведены 2 серии исследований для изучения изменения морфологических и биохимических показателей крови при эндогенной и экзогенной интоксикации. В первой серии исследований опыты выполняли на беспородных белых крысах, самцах с массой тела 189—250 г, 2 группы животных.
В первой группе контроль составили 5 особей. Остальным крысам внутримышечно вводили фосфа-кол: группа № 1а — в дозе 0,5, ЛД50 (ЛД50=0,92 +/-0,12 мг/кг), 5 особей; группа № 1б — в дозе 5,0 ЛД50, 5 особей; группа № 1в — в дозе 50 ЛД50, 5 особей.
У всех животных первый забор крови производили из хвостовой вены через 15 мин после появления клинических признаков отравления (на высоте
отравления ЛД50), второй — через 2 часа (время длительности судорог ЛД50).
Вторая группа: контроль составили 5 особей. Облучение проводилось на установке «ИГУР-1» всеми четырьмя источниками (Cs-137). В коллиматорах установлены свинцовые фильтры — по одной пластине в каждом. Облучение равномерное, в стандартной кассете для крыс — по 6 животных в каждой кассете. Кассета располагается в геометрическом центре, для чего ножки кассеты устанавливаются в специальные прорези в платформе камеры «ИГУРа-1». Мощность поглощенной дозы при использовании одного фильтра равна: 0,438±0,016 Гр/мин, время облучения — 16,438 минут, общая доза составила 7,2 Гр. Облучение контрольных и подопытных групп животных проводилось одновременно (в одной посадке). В качестве клинических тестов служили внешние проявления заболевания, массометрия в сочетании с исследованиями периферического состава крови, изучением незавершенного фагоцитоза нейтрофилов крови.
Для выполнения электронно-микроскопических исследований эритроцитов каплю крови помещали в бюкс, заполненный 1.5%-ным раствором глутаральде-гида, приготовленном на растворе Хенкса. Через 30 минут, после осаждения эритроцитов на покровном стекле, их отмывали раствором Хенкса и обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации (до 100%). Окончательную сушку образцов осуществляли переходом критической точки CO2 в аппарате HCR — 2 Hitachi — Н-300. С помощью светового микроскопа «МКУ-1» подсчитывали % деформированных эритроцитов в каждой пробе. Для определения уровня МСМ в сыворотке крови использовали скрининговый метод. Полученные данные обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента.
Результаты исследований и их обсуждение
Морфологические исследования рельефа поверхности эритроцитов показали, что в контрольных образцах первой серии опытов они имеют типичную форму дискоцитов. Деформация эритроцитов при введении ФОИ осуществляется в значительной мере посредством сокращения и разрушения цитоскелета. Применение фосфакола в дозе 0,5 ЛД50 приводит к существенному изменению формы эритроцитов, которое сопровождается нарушением рельефа клеточной поверхности, образованием выростов на поверхности и значительным уменьшением объёма клеток. При введении фосфакола в дозе 5 ЛД50 возникает набухание эритроцитов, которое компенсирует сжатие клетки. При этом нарушается рельеф клеточной поверхности, формируются гребни, наблюдается выброс клеточного материала. Наибольшая деформация эритроцитов выражена при максимальных дозах фосфакола (50 ЛД50). При этом можно наблюдать образование значительных по размерам (до 2—3 мкм) выростов клеточной поверхности, а кренирование эритроцитов в сочетании с нарушением их стромы приводит к их последующему разрушению. Количество эхиноцитов в группе № 1 через 15 минут после появления клинических признаков отравления составило: контроль — 3,4%, группа № 1а — 37%, группа
№ 1б — 51%, группа № 1в — 53%; через 2 часа — 3,2; 43; 49 и 64% соответственно.
При исследовании эритроцитов после воздей- 1.
ствия ионизирующего излучения наблюдали большое количество деформированных клеток, преимущественно в виде эхиноцитов, характеризующихся склон- 2 ностью к агрегации.
Количество деформированных эритроцитов в 3.
группе № 2 через 2 минуты после появления клинических признаков лучевой болезни составило: контрольная группа — 2,5%, группа № 2а — 25%, группа № 2б
— 52%. Через 5 минут — 3,0%, 43%, 55% соответственно. Через 10 минут — 2,7; 50 и 60% соответствен- 4. но.
По данным световой микроскопии при эндоин- 5.
токсикациях эритроцит значительно уменьшает свой объём и приобретает острые выросты клеточной поверхности, характерные для эхиноцитов.
Установлена корреляция между дозой токсина (ФОС) или степенью уремии и процессами эхиноцито-за. С помощью электронной микроскопии выявлена трансформация дискоцитов в эхиноциты, обусловлен- 7.
ная изменениями в цитоскелете и плазмалемме эритроцитов. При этом клетка значительно уменьшает свой объём и приобретает острые выросты клеточной по- 8.
верхности, заметно образование продуктов деструкции мембран.
Степень тяжести отравления оценивалась по изменению формы эритроцитов и другими исследова- 9.
телями. Ранее была отмечена деформация эритроцитов и эндотелиоцитов микрососудов при отравлении крыс и мышей ФОС. Сочетание деформации и агрегации эритроцитов с изменением клеток эндотелия приводит к тяжёлому расстройству микроциркуляции крови. Показано, что при отравлении крыс фосфаколом в дозе 1. ЛД50 наблюдается эхиноцитоз и резкое замедление тока крови в микрососудах вплоть до стаза [8, 9]. При введении опытным крысам фосфакола в микродозе 2.
(ЛД 0,01) были обнаружены изменения в форменных элементах крови: анизоцитоз эритроцитов с преобладанием клеток малого размера, звёздчатой формы, очаги агглютинации эритроцитов с последующим их ге- 3. молизом. Увеличение инъецируемой дозы фосфакола приводило к появлению в крови в значительном количестве звёздчатой формы эритроцитов и их агглютинации. Обращают на себя внимание изменения поверхностей и размеров эритроцитов.
При определении МСМ отмечается увеличение 4.
их концентрации в сыворотке крови животных в соответствии со степенью интоксикации. Замечена корреляция между дозой ФОС, степенью поражения иони- 5. зирующим излучением и повышением уровня МС
М. Ранее отмечено, что увеличение концентрации МСМ в биологических жидкостях наблюдается 6. при всех патологических состояниях, сопровождающихся эндогенной интоксикацией, и тесно коррелирует со степенью ее выраженности. Показано, что на 7. ранних стадиях эндогенной интоксикации уровень СМП возрастает по сравнению с нормой в среднем на 20—30%, на средней стадии — на 100—200%, поздних 8
— на 300—400%. '
Камышников В. С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике: В 2 т. Т. 1. Мн.: Интерпрессервис, 2003. 494 с.
Чаленко В.В. Возможные причины повышения концентрации молекул средней массы при патологии // Патологическая физиология. 1991. № 4. С. 13-14. Стародубцева М.Н., Кузнецова Т.Г., Егоренков Н.И. АСМ-исследование эритроцитов, кренированных активными формами азота // Методологические аспекты сканирующей зондовой микроскопии. VII Международный семинар. Сборник докладов. Мн.: ИТМО НАН Беларуси, 2006. С. 148-152.
The diagnostic relevance of red cell rigidity / R.Banerjee, K.Nageshwari, R.R.Puniyani // Clin. Hemorheol Microcirc. 1998. Vol. 19. № 1. Р. 21-24.
Erythrocyte aggregation and erythrocyte deformability modify the permeability of erythrocyte enriched fibrin network / J.M. van-Gelder, C.H.Nair, D.P.Dhall // Thromb. Res. 1996. Vol. 1. № 82. P. 33-42.
Linderkamp O. et al. Impaired deformability of erythrocytes and neutrophils in children with newly diagnosed insulin-dependent diabetes mellitus // Diabetologia. 1999. Vol. 42. № 7. P. 865-869.
Parthasarathi K., Lipowsky H.H. Capillary recruitment in response to tissue hypoxia and its dependence on red blood cell deformability // Am. J. Physiol. 1999. Vol. 277. № 6. Pt 2. P. H2145-2157.
Скопичев В.Г., Прозоровский В.Б., Жичкина Л.В., Пан-ченкова О.А. Основные принципы деттоксикации при воздействии фосфорорганических соединений (ФОС) // Международный вестник ветеринарии. 2006. № 3-4. С. 28-38.
Скопичев В.Г., Прозоровский В.Б.. Выявление наличия холинэстеразы в эндотелиоцитах и её торможение фос-форорганическими соединениями как причина деформации эндотелиоцитов // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2005. Т. 68. № 3. С. 64-67.
References
Kamyshnikov V.S. Spravochnik po kliniko-biokhimicheskoy laboratornoy diagnostike [Guide to clinical and biochemical laboratory diagnostics] in 2 vols, vol. 1. Minsk, Inter-presservis Publ., 2003. 494 p.
Chalenko V.V. Vozmozhnye prichiny povysheniya kontsen-tratsii molekul sredney massy pri patologii [Possible reasons for the increase of the concentration of medium-weight molecules in the pathology]. Patologicheskaya fiziologiya, 1991, no. 4, pp. 13-14.
Starodubtseva M.N., Kuznetsova T.G., Egorenkov N.I. ASM-issledovanie eritrotsitov, krenirovannykh aktivnymi formami azota [AFM study of red blood cells, craned by active forms of nitrogen]. Metodologicheskie aspekty skaniruyushchey zondovoy mikroskopii: VII Mezhdunarodnyy seminar. Sbornik dokladov [Methodological aspects of scanning probe microscopy. VII International Seminar. The collection of reports]. Minsk, 2006, pp. 148-152.
Banerjee R. et al. The diagnostic relevance of red cell rigidity. Clin. Hemorheol Microcirc., 1998, vol. 19, no. 1, pp. 2124.
Van Gelder J.M. et al. Erythrocyte aggregation and erythro-cyte deformability modify the permeability of erythrocyte enriched fibrin network. Thromb. Res., 1996, vol. 1, no. 82, pp. 33-42.
Linderkamp O. et al. Impaired deformability of erythrocytes and neutrophils in children with newly diagnosed insulin-dependent diabetes mellitus. Diabetologia, 1999, vol. 42, no. 7, pp. 865-869.
Parthasarathi K., Lipowsky H.H. Capillary recruitment in response to tissue hypoxia and its dependence on red blood cell deformability. Am. J. Physiol., 1999, vol. 277, no. 6, pt 2, pp. H2145-2157.
Skopichev V.G. et al. Osnovnye printsipy dettoksikatsii pri vozdeystvii fosfororganicheskikh soedineniy (FOS) [Basic Principles of detoxification under the influence of organo-
phosphorus compounds]. Mezhdunarodnyy vestnik veteri-narii, 2006, no. 3-4, pp. 28-38.
9. Skopichev V.G., Prozorovskiy V.B.. Vyyavlenie nalichiya kholinesterazy v endoteliotsitakh i ee tormozhenie fosforor-ganicheskimi soedineniyami kak prichina deformatsii en-
doteliotsitov [Identification of cholinesterase in endothelial cells and its inhibition by organophosphorus compounds as the cause of deformation of endothelial cells]. Eksperimen-tal'naya i klinicheskaya farmakologiya, 2005, vol. 68, no. 3, pp. 64-67.
