CC BY
89
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 577.29
Изменение уровня экспрессии генов в процессе перехода клеток М. tuberculosis в состояние «некультивируемости»
Е.Г. Салина1*, Х. Молленкопф2, С. Кауфман2, А.С. Капрельянц1
1 Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071, Москва, Ленинский просп., 33
2 Институт инфекционной биологии им. М. Планка, 10117, Берлин, Шуманштрассе, 21-22 *Е-mail: elenasalina@mail.ru
РЕФЕРАТ Был проведен анализ изменения уровня экспрессии генов при обратимом переходе клеток M. tuberculosis в «некультивируемое» (НК) состояние в длительной стационарной фазе в специально подобранных условиях. Обнаружено, что более чем для 500 генов наблюдалось изменение уровня экспрессии, 238 генов имели повышенный уровень экспрессии во всех рассматриваемых точках при переходе в НК состояние. Почти четвертую часть генов с повышенным уровнем экспрессии составляют гены группы инсерционных элементов и фаговых белков, что, возможно, иллюстрирует высокую интенсивность процессов модификации генома M. tuberculosis при образовании НК клеток. Помимо значительного числа генов с невыявленной функцией, среди генов с повышенной экспрессией оказалось достаточно много генов, продукты которых принимают участие в основных метаболических процессах и дыхании, в регуляции транскрипции и процессах, протекающих в клеточной стенке, а также кодирующих регуляторные белки. Полученные результаты позволяют нам предполагать, что переход клеток в покоящееся состояние является активным процессом, в который вовлечено множество генов, участвующих в различных метаболических процессах. Детальный анализ экспериментальных данных в последующем может быть полезен для понимания молекулярных механизмов явления латентности туберкулезной инфекции и покоя M. tuberculosis. Суммируя результаты транскриптомного анализа НК клеток, получаемых в нашей модели, и данные, полученные исследователями в ряде других моделей персистенции M. tuberculosis, можно выявить ряд «общих» для всех моделей генов, активирующихся в данных условиях. Тринадцать генов с повышенной экспрессией, общие для ряда моделей персистенции, могут быть рассмотрены как потенциальные мишени для создания новых противотуберкулезных лекарственных средств, направленных, прежде всего, против латентного туберкулеза. Ключевые слова: M. tuberculosis, латентный туберкулез, «некультивируемые» клетки, глобальный профиль экспрессии генов.
ВВЕДЕНИЕ
Возбудитель туберкулеза бактерия Mycobacterium tuberculosis может персистировать в организме человека в течение десятилетий после инфицирования. Подобное латентное состояние M. tuberculosis традиционно связывают с переходом клеток возбудителя в покоящееся состояние, сопровождающееся потерей их культивируемости [1]. Именно поэтому латентную инфекцию практически не-
возможно выявить стандартными биохимическими и микробиологическими методами, а также устранить с помощью антибиотикотерапии. Для изучения особенностей латентной инфекции в живых организмах используют различные модификации экспериментальной модели покоящегося состояния M. tuberculosis в условиях гипоксии in vitro [2, 3], однако все они не имитируют такое важное состояние бактерий, как их «некультивируемость»
в состоянии покоя. Нам удалось разработать модель, в которой покоящиеся клетки M. tuberculosis являются «некультивируемыми» (НК) и способны к реактивации в определенных условиях [4].
С целью выявления особенностей биохимических процессов, связанных с переходом бактерий в состояние «не-культивируемости», и понимания механизмов данного явления нами был проведен анализ изменения профиля экспрессии генов M. tuberculosis в процессе образования НК форм.
МЕТОДЫ
Образцы тотальной РНК M. tuberculosis были выделены из клеток в конце логарифмической фазы роста культуры (5 дней культивирования) и при переходе в НК состояние при инкубации в стационарной фазе в различных временных точках (21, 30, 41 и 62 дней культивирования) по методу, опубликованному ранее [5]. Комплементарная ДНК была получена с использованием 1 ^g РНК, случайных праймеров-гексамеров и обратной транскриптазы (Superscript III, Invitrogen) в соответствии с руководством фирмы-производителя; в кДНК, соответствующую клеткам, взятым в различные временные точки стационарной фазы, была введена флюоресцентная метка Cy-3, для кДНК, соответствующей клеткам логарифмической фазы роста и использующейся в качестве контроля - Су-5. Далее 250 ng Су3-меченной кДНК были конкурентно гибридизованы с таким же количеством Су5-меченной кДНК контрольного образца на стеклянных подложках с нанесенными на них матрицами с продуктами ген-специфичной ПЦР-амплификации генома M. tuberculosis (SurePrint technology, Agilent). Гибридизация проводилась в двух повторностях при 42 °С в течение 20 ч в соответствии с рекомендациями изготовителя, после чего была проведена трехкратная отмывка слайдов буфером I (Ambion) при 55 °С с последующим их сканированием с разрешением 10 ^m (Microarray Scanner BA, Agilent). Анализ полученных результатов проводился с помощью программы Agilent’s feature extraction software version.
время культивирования, сут
Рис. 1. Образование НК клеток M. tuberculosis в стационарной фазе. Стрелками отмечены временные точки, в которых производилось выделение РНК из клеток
(Agilent). Для обработки результатов изменения профилей экспрессии генов был использован критерий 1,5, к рассмотрению принимались результаты, дающие согласованный результат в двух повторностях и удовлетворяющие условиям Т-теста.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Ранее нами было обнаружено, что культивирование M. tuberculosis на не содержащей ионов калия среде Sauton с добавлением глюкозы, БСА и хлорида натрия приводило к снижению способности клеток образовывать колонии на твердой среде при росте в стационарной фазе [4]. Через 60 дней культивирования число КОЕ в мл среды снижалось до 105 (рис. 1), что означало переход 99.9 % клеток в культу-
Таблица 1. Функциональные категории генов M. tuberculosis, обладающих измененным уровнем экспрессии при переходе в состояние «не-культивируемости»
Функциональные категории Гены, индуцирующиеся при переходе в НК состояние Гены, репрессирующиеся при переходе в НК состояние % доля в геноме
Число генов % доля Число генов % доля
Вирулентность, детоксификация, адаптация 5 2.1 7 2.9 2.6
Метаболизм липидов 6 2.5 20 8.4 5.9
Регуляция транскрипции и трансляции 13 5.5 23 9.7 5.8
Процессы, связанные с клеточной стенкой 24 10.1 59 24.8 18.8
Инсерционные элементы и фаговые белки 58 24.4 1 0.4 3.7
Пролин-глутамат богатые белки (РЕ/РРЕ) 7 2.9 11 4.6 4.2
Основные метаболичекие процессы, в т.ч. дыхание 42 17.7 50 21.1 22.4
Регуляторные белки 16 6.7 4 1.7 4.8
Белки с невыясненной функцией 67 28.1 63 26.5 31.9
Всего генов 238 - 237 - 3924
Таблица 2. Гены, имеющие значительно повышенный уровень экспрессии при переходе в НК состояние в стационарной фазе
ORF Ген Белковый продукт Изменение уровня эксп рессии гена
5 дней 21 день 30 дней 41 день 62 дня
Rv0186 bglS Бета-глюкозидаза 1 4.20459 8.33686 6.51867 5.24295
Rv0840c pip Пролин-иминопептидаза 1 6.33559 11.0004 4.58881 3.86572
Rv0841c Трансмембранный белок 1 31.11093 52.56174 13.79488 11.85425
Rv0989c grcC2 Полипренил-дифосфатсинтаза 1 7.60797 6.29748 7.58723 3.94285
Rv0990c Гипотетический белок 1 7.12899 6.60915 6.652 3.57343
Rv0991c Консервативный гипотетический белок 1 3.31598 3.87521 5.44297 3.70462
Rv1369c Транспозаза 1 3.17178 3.9213 4.22925 3.86883
Rv1394c cyp132 Цитохром Р 450 132 1 8.89047 7.50161 3.72981 3.12534
Rv1395 Белок-регулятор транскрипции 1 3.22394 11.65875 7.03908 4.27327
Rv1397c Консервативный гипотетический белок 1 6.95276 11.79184 5.97336 5.77752
Rv1460 Белок-регулятор транскрипции 1 3.87617 5.50637 6.90405 3.78332
Rv1575 Фаговый белок pЫRV1 1 17.29509 37.08693 51.7473 20.53329
Rv1576c » 1 28.17817 33.97652 10.11378 12.88182
Rv1577c » 1 26.27261 39.87495 19.41512 11.49041
Rv1584c » 1 3.27674 5.68552 3.3055 3.02886
Rv1831 Гипотетический белок 1 3.1468 5.74692 5.14019 4.04747
Rv1991c Консервативный гипотетический белок 1 4.04696 4.12618 4.06786 4.65579
Rv1992c ctpG АТФаза, транспортирующая катионы металлов 1 5.2883 7.31348 4.7442 4.22806
Rv2106 Транспозаза 1 3.01418 5.61324 4.77882 5.09925
Rv2254c Интегральный мембранный белок 1 7.09534 6.53956 3.33899 4.63885
Rv2278 Транспозаза 1 3.28663 6.78129 6.28036 4.13102
Rv2354 » 1 3.1594 6.15299 5.21098 3.13151
Rv2497c pdhA Альфа-субъединица пируватдегидрогеназы 1 3.73133 4.52197 5.04976 4.00306
Rv2642 Регулятор транскрипции семейства А^Г 1 3.76985 5.16757 4.39006 3.93426
Rv2644c Гипотетический белок 1 3.36059 7.58921 5.36796 3.51825
Rv2645 » 1 3.45006 8.21393 6.70101 3.25709
Rv2646 Интеграза 1 5.04391 12.16535 7.82435 9.96087
Rv2647 Гипотетический белок 1 5.32983 13.40623 9.43796 7.2163
Rv2649 Транспозаза ^6110 1 3.2505 5.3557 5.59089 3.74714
Rv2650c Профаговый белок рЫГу2 1 21.46669 29.74372 16.65359 20.66349
Rv2651c Профаговая протеаза рЫГу2 1 20.04086 34.29153 20.61728 13.41666
Rv2660c Гипотетический белок 1 13.43717 41.25793 67.29882 19.6699
Rv2661c » 1 9.23174 28.30861 52.34967 11.04351
Rv2662 » 1 20.62942 18.83647 14.72059 12.88898
Rv2663 » 1 7.61461 9.43216 8.19525 7.3034
Rv2664 » 1 6.24636 8.49102 7.10191 5.60291
Rv2666 Трункированная транспозаза ^1081 1 6.91867 13.89339 7.89331 5.86579
Rv2667 clpC2 АТФ-зависимая протеаза 1 9.44815 17.89662 9.64508 6.46149
Rv2707 Консервативный трансмембранный белок 1 3.35002 5.09024 14.83903 4.53239
Rv2711 ideR Белок-регулятор транскрипции 1 3.48877 4.30099 6.06795 3.83858
Rv2713 sthA Растворимая пиридин-нуклеотид трансгидрогеназа 1 4.43327 6.35516 6.80833 3.83838
Rv2780 ald Секретируемая L-аланин дегидрогеназа ALD 1 5.2891 4.65988 4.52694 4.92656
Rv2814c Транспозаза 1 3.3279 5.52338 4.86873 4.60102
Rv2815c » 1 3.13667 6.24306 5.87423 4.84337
Rv3185 » 1 3.58899 6.43621 5.67335 5.82686
Rv3186 » 1 3.2903 6.21375 6.14822 5.77427
Rv3290c lat L-лизин аминотрансфераза 1 4.32023 5.06387 3.54801 3.9704
Rv3474 Транспозаза ^6110 1 3.04947 6.19754 6.19869 3.22266
Rv3475 » 1 3.73966 5.79892 5.63617 6.23465
Rv3580c cysS Цистеинил — тРНК синтетаза 1 3.87797 6.67899 3.14124 3.40852
Rv3582c ispD 2-C-метил-D-эритритол-4-фосфат цитидилил-трансфераза 1 3.50012 4.07861 3.78626 3.51221
ре в НК состояние. При продолжении культивирования НК клеток в стационарной фазе наблюдался самопроизвольный возврат их способности образовывать колонии. Важно отметить обратимость состояния «некультивируемости» -полученные НК клетки, взятые из точки с минимальным числом КОЕ, могли быть реактивированы при пересеве их на свежую среду роста.
Сравнение профиля экспрессии генов бактериальной популяции в различных точках стационарной фазы относительно логарифмической фазы роста культуры (5 дней культивирования) выявило изменение уровня экспрессии генов в 1.5 и более раз для достаточно значительного числа генов - 566, что составляет более 14 % от всего генома M. tuberculosis. Среди данного количества генов с изменен-
ной экспрессией 238 генов имели повышенный уровень экспрессии и 237 генов имели сниженный уровень экспрессии при культивировании в стационарной фазе во всех рассматриваемых точках. В табл. 1 представлено распределение генов с измененным при переходе в НК состояние уровнем экспрессии в соответствии с функциональной принадлежностью кодируемых ими продуктов.
Помимо большой группы генов с невыявленной функцией, кодирующих т.н. гипотетические белки, снижен уровень экспрессии для многих генов - участников основных метаболических процессов. Также значительно снижен уровень экспрессии генов, вовлеченных в вирулентность и адаптацию, метаболизм липидов, регуляцию транскрипции и трансляции и процессы, протекающие в клеточной стенке.
При рассмотрении генов, уровень экспрессии которых повышается при переходе в НК состояние, также обнаружилось присутствие значительного числа генов с невы-явленной функцией; однако обращает на себя внимание тот факт, что почти четвертую часть генов с повышенным уровнем экспрессии составляют гены из группы инсерци-онных элементов и фаговых белков, тогда как действительная доля их в геноме невелика - всего 3.7 %. Данный факт, возможно, иллюстрирует высокую интенсивность процессов, приводящих к модификации генома M. tuberculosis при переходе клеток в НК состояние.
Среди генов с повышенной экспрессией оказалось достаточно много генов, продукты которых принимают участие в основных метаболических процессах, в частности gcvB и ald, кодирующие соответственно глицин-дегидрогеназу и L-аланин-дегидрогеназу, протеиназы pepR и clpC2. Повышен уровень экспрессии одного из генов, кодирующих изоцитратлиазу icll - анаплеротический фермент, присутствующий в клетках M. tuberculosis в виде двух изоформ -icl 1 и icl 2. Изоцитратлиаза является одним из ключевых ферментов глиоксилатного шунта - метаболического пути, альтернативного циклу трикарбоновых кислот, позволяющего производить синтез углеводов из простых предшественников. В частности, он активно функционирует в прорастающих семенах, когда жирные кислоты являются основным источником углерода и энергии. Индукция ряда генов, участвующих в процессах деградации липидов fadD9, fadE24, fadE26 и жирных кислот scoA, указывает на активное функционирование глиоксилатного шунта в НК клетках. Функционирование глиоксилатного шунта ранее было отмечено для модели персистенции М. tuberculosis Вейна [2].
При переходе в НК состояние происходит также индукция ряда генов, являющихся своеобразными маркерами стрессовых условий: белка теплового шока hsp, шаперо-нов Rv0440 и Rv3417^ а также сигма-факторов: sigG - регулирующего гены, необходимые для выживания внутри макрофагов, и sigB, который может контролировать регу-лоны стационарной фазы и общую устойчивость к стрессам. Индукция генов ccsA, продукт которого принимает участие в биосинтезе цитохромов на стадии включения гема и cyp132, кодирующего один из цитохромов Р-450, окисляющих различные ксенобиотики, скорее всего, указывает на возможность накопления в культуре токсичных компонентов. Также в НК клетках индуцируются гены, ко-
дирующие ферменты немевалонатного пути синтеза изо-преноидов ispF, ispD. Есть данные о том, что некоторые метаболиты этого пути могут влиять на иммунный ответ организма-хозяина [6]. Среди индуцированных при переходе в состояние «некультивируемости» генов достаточно велика доля генов, продукты которых принимают участие в процессах регуляции транскрипции, и кодирующих регуляторные белки, в частности белок-регулятор транскрипции /игА, осуществляющий негативный контроль транскрипции путем связывания оператора репрессируемых генов с помощью катиона железа. Предполагается, что данный белок осуществляет контроль транскрипции гена katG, уровень транскрипции которого в НК состоянии также повышен. Данный ген кодирует многофункциональный фермент, проявляющий каталазную, пероксидазную и пероксинитразную активности, и, как предполагается, может играть роль в процессе внутриклеточного выживания микобактерий в макрофагах, защищая их от агрессивных компонентов, продуцируемых клетками-фагоцитами. Активируются гены, принимающие участие в процессах, протекающих в клеточной стенке, в частности, различных транспортеров - ctpG и сЬрС, кодирующих АТФазы, транспортирующие катионы металлов, а также Гу2688с - транспортера, осуществляющего экспорт антибиотиков из клетки и отвечающий за резистентность к ним.
С целью выявить гены, уровень экспрессии которых значительно повышен при переходе в НК состояние, мы ввели более жесткий критерий - уровень экспрессии гена во всех рассматриваемых точках стационарной фазы превышает его экспрессию по сравнению с 5 сут роста в 3 и более раз. Таким условиям отвечает 51 ген (табл. 2).
Среди генов со значительно повышенным уровнем экспрессии лидирующие позиции - 20 генов из 51 - занимают гены, кодирующие инсерционные элементы и фаговые белки, 13 генов кодируют белки с невыявленной функцией. Об-
Таблица 3. Сопоставление генов, имеющих повышенный (более 1.5) уровень экспрессии при переходе в НК состояние в стационарной фазе, с генами, активирующимися в ряде других моделей персистенции
Модели персистенции M. tuberculosis Совпадение с 238 генами, активирующимися в стационарной фазе при переходе в НК состояние
Число генов % доля
Нерепликативное состояние Вейна (Voskuil et al., 2004) 23 9.7
Персистенция при лимитировании источника углерода в условиях 50 %-ного насыщения кислородом (Hampshire et al., 2004) 82 34.5
Персистенция при инфицировании макрофагов (Schnappinger et al., 2003) 77 32.4
Модель искусственной гранулемы мышей (Karakousis et al., 2004) 32 13.4
Длительный ответ на гипоксию (Rustad et al., 2008) 40 16.8
Таблица 4. «Универсальные» гены персистирующего состояния M. tuberculosis. Жирным шрифтом выделены гены, входящие в состав EHR регулона
ORF Ген Нереплекатив-ное состояние Вейна (Voskuil et al, 2004) Лимитирование источника углерода (Hampshire et al, 2004) Персистенция в макрофагах (Schnappinger et al., 2003) Искусственная гранулема мышей (Karakousis et al., 2004) НК состояние в стационарной фазе
Rv0188 0.8 67.2 2.8 2.7 2.5
Rv0211 pckA - 1.7 3.6 2.6 1.64
Rv0251c hsp 4.5 18.6 25.6 3.9 4.5
Rv1894c 2.0 5.1 1.8 - 2.8
Rv1909c furA - 5.4 2.2 2.8 2.7
Rv2011c 2.1 9.5 2.5 - 2.8
Rv2497c pdhA 3.4 8.4 2.1 2.0 4.0
Rv2660c 1.5 4.3 2.1 3.3 19.7
Rv2662 1.5 1.5 2.0 - 12. 9
Rv2710 sigB - 34.6 3.8 4.7 4.6
Rv2780 ald 6.1 2.6 2.4 2.4 4.9
Rv3139 fadE24 - 2.2 2.0 5.8 2.4
Rv3290c lat 3.6 25.9 7.5 5.6 4.0
ращает на себя внимание факт, что значительно повышенным уровнем экспрессии отличаются те гены - участники основных метаболических процессов, белковые продукты которых кодируют белки, принимающие участие в процессах деградации, в частности bglS - бета-глюкозидаза (гидролизует концевой остаток бета-глюкозы), pip - проли-ниминопептидаза (специфически катализирует удаление N-концевого пролина у коротких пептидов, clpC2 - АТФ-зависимая протеаза, ald - L-аланин-дегидрогеназа (катализирует гидролиз аланина - важного компонента пепти-догликанового слоя с образованием пирувата). При этом повышенной экспрессией отличается ген pdhA, кодирующий альфа-субъединицу пируват-дегидрогеназы, участвующей в энергетическом метаболизме клеток и катализирующей конверсию пирувата в ацетил-КоА. На преобладание катаболических процессов в метаболизме клеток в НК состоянии указывает и значительно повышенный уровень экспрессии sthA - растворимой пиридин-нуклеотид транс-гидрогеназы, осуществляющей конверсию НАДРН, образующейся в катаболических путях, в НАДН, необходимый в дыхательной цепи для генерирования энергии.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ВЫВОДЫ
Анализ глобального профиля экспрессии генов был проведен для ряда моделей персистенции M. tuberculosis, в частности модели нерепликативного состояния Вейна в условиях гипоксии [5, 7, 8], модели персистенции в условиях лимитирования по источнику углерода в условиях сниженной концентрации кислорода [9], при инфицировании макрофагов [10], и in vivo при образовании искусственной гранулемы у мышей [11]. При рассмотрении результатов, полученных этими исследователями, оказалось, что профиль экспрессии генов в изучаемой нами модели «некуль-тивируемости» в стационарной фазе имеет ряд совпадений с моделями персистенции, указанными выше (табл. 3).
Менее всего общего было найдено при сопоставлении генов, активирующихся в модели «некультивируемости»,
разработанной нами, и модели покоя в условиях гипоксии Вейна (табл. 3). Известно, что модель Вейна отличается индукцией генов так называемого Dos-регулона (от Dormancy survival regulator) - группы из 49 генов, находящихся под контролем devR, кодирующего регуляторную часть двухкомпонентной системы. Повышенный уровень транскрипции генов M. tuberculosis в составе Dos-регулона наблюдался не только у покоящихся в условиях гипоксии in vitro клеток, но также при инфицировании макрофагов [10] и в модели искусственной гранулемы мышей [11]. В разработанной нами модели перехода M. tuberculosis в НК состояние в стационарной фазе среди генов с повышенной экспрессией были обнаружены только 2 гена Dos-регулона - Rv0571c и Rv2631. Индукции генов Dos-регулона не было обнаружено у клеток, персистирующих в условиях голодания [12], а в модели персистенции при истощении источника углерода активировались только два гена этого регулона [9].
В недавно опубликованной работе [13] было продемонстрировано, что роль Dos-регулона не только как универсального регулятора покоящегося состояния микобактерий, но даже как универсального ответа на состояние гипоксии, по-видимому, переоценена. Показано, что гены Dos-регулона максимально активируются только в первые 2 ч после наступления гипоксии, затем экспрессия по крайней мере половины из них возвращается на исходный уровень [13]. Те же авторы показали, что далее при культивировании в условиях гипоксии через 4 дня наблюдается повышение уровня экспрессии ряда генов количеством около 230, и их уровень остается стабильным в дальнейшем. Эту группу генов авторы назвали EHR (Enduring hypoxia response - длительный ответ на гипоксию). При рассмотрении изменения профиля экспрессии генов при переходе в НК состояние в модели, разработанной нами, было выявлено достаточно много совпадений с этой группой генов (табл. 3), что явилось несколько неожиданным фактом, поскольку разработанные нами условия образования НК
клеток не подразумевали никакой лимитации по кислороду. При рассмотрении генов, активирующихся в модели персистенции в условиях истощения источника углерода [9] и модели ответа на множественные стрессовые факторы [14], также обнаружилось перекрывание с генами EHR [13]. Таким образом, можно сделать вывод, что гены EHR могут не только претендовать на роль маркеров гипоксии, но и представлять собой регулон покоящегося состояния микобактерий туберкулеза в целом, независимо от путей индукции такого состояния.
Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о том, что переход клеток в покоящееся состояние является активным процессом, в который вовлечены десятки генов. Задачей дальнейших исследований является подробное изучение этого процесса для понимания молеку-
лярных механизмов, протекающих в клетке при переходе в состояние покоя.
Суммируя результаты транскриптомного анализа НК клеток, получаемых в нашей модели, и данные, полученные исследователями в ряде моделей персистенции, можно выявить ряд общих для всех моделей генов, активирующихся в данных условиях (табл. 4). Мы полагаем, что гены, перечисленные в табл. 4, и их продукты могут быть рассмотрены и подробно изучены в дальнейшем с целью создания новых противотуберкулезных лекарственных средств, направленных прежде всего против латентного туберкулеза.
Работа поддержана программой Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Gangadharam P.R.J. // Tuber. Lung Dis. 1995. 76. 477-479.
2. Wayne L.G., Lin K.-Y. // Infect. Immun. 1982. 37. 1042-1049.
3. Wayne L.G., Hayes L.G. // Infect. Immun. 1996. 64. 2062-2069.
4. Mukamolova G.V., Salina E.G., Kaprelyants A.C. // National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH (Georgiev, V., ed), Humana Press, USA. 2008. 1. 83-90.
5. Voskuil M.I., Visconti K.C., Schoolnik G.K. // Tuberculosis (Edinb.), 2004. 84. 218-227.
6. Shao L., Zhang W., Zhang S., Chen C.Y., Jiang W., Xu Y., Meng C., Weng X., Chen Z.W. // AIDS. 2008. 22(17). 2241-2508.
7. Muttucumaru D.G., Roberts G., Hinds J., Stabler R.A., Parish T. // Tuberculosis (Edinb.). 2004. 84. 239-246.
8. Bacon J., James B.W., Wernisch L., Williams A., Morley K.A., Hatch G.J., Mangan J.A., Hinds J., Stoker N.G., Butcher P.D., Marsh P.D. // Tuberculosis (Edinb.). 2004. 84. 205-217.
9. Hampshire T., Soneji S., Bacon J., James B. W., Hinds J., Laing K., Stabler R. A.,
Marsh P.D., Butcher P.D. // Tuberculosis (Edinb.). 2004. 84. 228-238.
10. Schnappinger D., Ehrt S., Voskuil M.I., Liu Y., Mangan J.A., Monahan I.M.,
Dolganov G., Efron B., Butcher P.D., Nathan C., Schoolnik G.K. // J. Exp. Med. 2003. 198(5). 693-704.
11. Karakousis P.C., Yoshimatsu T., Lamichhane G., Woolwine S.C., Nuermberger E.L., Grosset J., Bishai W.R. // J. Exp. Med. 2004. 200. 647-657.
12. Betts J.C., Lukey P.T., Robb L.C., McAdam R.A., Duncan K. // Mol. Microbiol. 2002. 43. 717-731.
13. Rustad T.R., Harrell M.I., Liao R., Sherman D.R. // PLoS ONE. 2008. 3(1). 1502.
14. Boshoff H.I., Myers T.G., Copp B.R., McNeil M.R., Wilson M.A., Barry C.E. 3rd // J. Biol. Chem. 2004. 279. 40174-40184.
