CC BY
45
УДК: 571.27
Ключевые слова: гельминтозы, иммунитет, цитокины, иммунопатология, кролики Key words: helminthosis, immunity, cytokines, immunopathology, rabbits
Гришина Е. А.
ИЗМЕНЕНИЕ ЦИТОКИНОВОГО СТАТУСА ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ РАЗВИТИИ ГЕЛЬМИНТОЗНОГО ПРОЦЕССА
CYTOKINE PROFILE OF THE LABORATORY ANIMALS DURING HELMINTHOSIS
ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования Минздрава России» Адрес: 125993, г. Москва, ул. Баррикадная, д. 2/1, стр. 1
Russian Medical Academy of Postgraduate Education, Russian Ministry of Health, State Budgetary Institute of Additional Postgraduate Education Address: 125993, Moscow, Barrikadnaya str., 2/1
Гришина Елена Анатольевна, к.б.н., доцент Grishina Elena Anatolyevna, PhD, Associate professor
Аннотация. Цель работы - исследование динамики содержания провоспалительных и противовоспалительных цитокинов (IL-l, IL-2, IL-4, IL-10, TNF-a) в сыворотке крови экспериментальных животных (кроликов) при развитии у них пассалуроза в первые 3 недели развития инвазии.
Полученные данные показали, что заражение экспериментальных кроликов Passalurus ambiguous (Rudolphi, 1819) отражается на балансе провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, вызывая на фоне существенного ограничения синтеза провоспалительного цитокина TNF-a адекватное усиление продукции IL-1, IL-2 и IL-10 к концу первой недели наблюдения. Провоспалительный индекс (ПВИ) рассчитывается как отношение суммы провоспалительных цитокинов (IL-1+IL-2+TNF-a) к противовоспалительному цитокину IL-10. Расчет провоспалительного индекса показал, что в течение всего наблюдения после заражения кроликов пассалурозом величина его была в пределах нормы, как и у интактных животных.
Впервые было выявлено, что в процессе развития экспериментальной инвазии на самых ранних этапах развития без выраженных признаков воспаления наблюдается тенденция к повышению IL-1 и снижению IL-4, при этом соотношение IL-1/IL-4 является высоким. Таким образом, определение концентрации провоспалительного цитокина IL-1 и противовоспалительного цитокина IL-4 в крови, а также вычисление их соотношения могут быть использованы для динамического контроля инвазионного процесса и контроля эффективности проводимой в дальнейшем терапии.
Summary. The aim of this work was to investigate a temporal profile of pro- and anti-inflammatory cytokines (IL-l, IL-2, IL-4, IL-10, TNF-a) in the serum of rabbits infested with Passalurus ambiguous in the first 3 weeks of infestation.
Our results demonstrate that infestation of experimental animals with Passalurus ambiguous (Rudolphi, 1819) lead to changes in pro- and anti-inflammatory cytokines level. Particularly it was shown that infestation induces an increase in the production of IL-1, IL-2, IL-10 and causes a substantial decrease of production of TNF-a at the end offirst week of observation. Proinflammatory index (calculated as a ratio ofproinflammatory cytokines IL-1 + IL-2 + TNF-a to anti-inflammatory cytokine IL-10) was within normal range during the whole period of observation after infestation with Passalurus ambiguous.
Firstly it was demonstrated that at the early stages of infestation without marked signs of inflammation there is a tendency to the elevation of the IL-1 level and decreasing of IL-4 level. It was accompanied by a high ratio of the IL-1 / IL-4. In summary, determination of the concentration of the proinflammatory cytokine IL-1 and anti-inflammatory cytokine IL-4 and this ratio could be useful for dynamic control of the infestation process and effectiveness of the further therapy.
Введение
Клиническая картина и особенности течения паразитарных заболеваний напрямую зависят от уровней продукции про- и противовоспалительных цитокинов и их влияния на иммунорегуляторные и эффекторные иммунные механизмы [4, 5, 8, 9]. В настоящее
8
время доказана ведущая роль провоспали-тельных цитокинов и их баланса с антагонистами- противовоспалительными цитокинами в выраженности и направленности системной воспалительной реакции [3, 7, 10].
При инвазии баланс указанных иммуно-супрессивных факторов нарушается, что
способствует развитию иммунно-опосре-дованного воспаления [1, 3]. Возникает необходимость экспериментальной оценки содержания про- и противовоспалительных цитокинов на разных этапах развития инвазионного процесса. Динамическое исследование количества цитокинов позволяет определить не только концентрацию медиаторов воспаления в крови, но и характер течения инвазионного процесса в целом.
Целью работы было исследовать динамику содержания про- и противовоспалительных цитокинов (IL-l, IL-2, IL-4, IL-10, TNF-a) в сыворотке крови экспериментальных животных- кроликов при развитии у них пассалуроза.
Материалы и методы
В эксперименте использовались 40 кроликов со средним весом 2,5 кг. Кролики содержались в стандартных условиях вивария Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К. И. Скрябина. Животные были подразделены на следующие экспериментальные группы: 1) кролики, зараженные Passalurus ambiguous - 30 шт.; 2) ин-тактные кролики (контрольная группа) - 10 шт.
В течение эксперимента у кроликов брали кровь из ушной вены без декапитации через 3, 7, 10, 14, 17, 21 суток после заражения. Кровь экспериментальных животных забирали в сухие центрифужные пробирки, отстаивали 1 час при комнатной температуре и 1 час при температуре +4°С. После центрифугирования в течение 10 минут на скорости 3000 об./мин. получали сыворотку, которую замораживали и хранили при температуре -20°С до момента определения цитокинов.
В исследуемой сыворотке животных опытной группы (группа 1) и контрольной (группа 2) оценивали содержание цитокинов (IL-l, IL-2, IL-4, IL-10, TNF-a) методом иммунофермент-ного анализа с использованием тест-систем ООО «Цитокин» (г. Санкт-Петербург) на анализаторе «Multiskan» (Финляндия) при длине волны 450 нм. Чувствительность используемых тест-систем составляла 1-2 пкг/мл. Для расчета полученной концентрации для каждого цитокина строилась калибровочная кривая на основании оптической плотности
стандартов с известным содержанием определяемого интерлейкина. Сывороточную концентрацию цитокинов выражали в пикограммах на миллилитр (пкг/мл).
Методика статистического анализа включала расчет средней величины с вычислением средней арифметической (М), средней ошибки (m) и вероятности различий (р) с использованием компьютерной программы SPSS Statistics 17,0 для ОС Microsoft. Данные в тексте и таблицах приведены в виде среднего значения (±) стандартной ошибки среднего значения (М±т). Достоверность выявленных различий определяли с помощью t-критерия Стьюдента в доверительном интервале (>95%) при нормальном распределении вариационного ряда. Для установления взаимосвязи признаков был проведен корреляционный анализ по Пирсону (при нормальном распределении). Различия считали достоверными при р<0,05.
Результаты и обсуждение
Исследование выработки цитокинов и их содержание в венозной крови кроликов опытной группы относительно таковой у интакт-ных животных показало неоднозначные достоверные их изменения (табл. 1).
В самые ранние сроки (через 3-е суток) и в конце мониторинга (через 21 день) после заражения концентрация провоспалитель-ного цитокина IL-l имела незначительную тенденцию к увеличению относительно контроля, когда как в конце первой недели после заражения его содержание было достоверно увеличено в 1,5 раза. Между тем, уровень содержания провоспалительного цитокина TNF-a был ниже контрольного во все сроки наблюдения, однако наиболее выраженное снижение (в 3,9 раза) имело место в конце мониторинга (на 21-е сутки). Характер изменения регуляторного цитокина IL-2, продуцируемого CD4-позитивными Т-лимфоцитами (Th1), был иным, о чем свидетельствовало существенное увеличение его концентрации во все сроки наблюдения, но максимально - на 7-е сутки (более чем в 2,5 раза относительно контроля).
Что касается оценки содержания противовоспалительного цитокина IL-10, продукта
9
Таблица 1.
Динамика содержания цитокинов в сыворотке крови кроликов после заражения
Passalurus ambiguous
Сроки исследования Кролики, зараженные Passalurus ambiguous (группа 1, n=30) (M±m, p)
IL-1, пкг/мл IL-2, пкг/мл TNF-a, пкг/мл IL-10, пкг/мл (IL-1+IL-2 +TNF-a)/ IL-10, у. е.
3 сут. 2,58 ±0,26* 10,50± 2,36** 2,84 ±0,88** 8,76± 1,08** 1,82± 0,19*
7 сут. 3,60 ±0,41* *** 18,69± 3,29** **** 3,85± 1,14** **** 13,67± 2,07** **** 1,90± 0,27* ***
10 сут. 3,82 ±0,51* *** 20,49± 3,09** **** 4,80± 1,21** **** 12,43± 2,11** **** 2,34± 0,23* ***
14 сут. 3,50 ±0,42* *** 18,36± 2,86** **** 4,25± 1,24** **** 10,47± 1,97** **** 2,49± 0,17* ***
17 сут. 3,15 ±0,32* *** 14,37± 3,19** **** 2,65± 1,19** **** 8,77± 2,12** **** 2,29± 0,16* ***
21 сут. 2,87± 0,43* *** 12,59 ±2,10* *** 1,51 ±0,70* *** 7,83 ±0,96** **** 2,19 ±0,18* ***
Интактные кролики, контрольная группа (группа 2, n=10) (M±m, p)
фон 2,39 ±0,20 6,83 ±0,85 5,92 ±0,62 7,81 ±2,19 1,94 ±0,18
Примечание:
* - достоверное отличие в сравнении с контролем при Р < 0,05; ** - достоверное отличие в сравнении с контролем при Р < 0,01; *** - достоверное отличие с началом эксперимента при Р < 0,05; **** - достоверное отличие с началом эксперимента при Р < 0,01.
активированных ТИ2- клеток, то его динамика соответствовала таковой у провоспалитель-ного ГЬ-1, т. е. концентрация данного цито-кина находилась в пределах нормы в ранние и отдаленные сроки наблюдения, а к концу первой недели отмечалось ее увеличение в 1,8 раза.
Между тем, наблюдаемая нами разнона-правленность изменений концентрации про-и противовоспалительных цитокинов не отразилась на их соотношении. Расчет про-воспалительного индекса (ПВИ) по отношению суммы провоспалительных цитокинов (^-1+^-2+ТОТ-а) к противовоспалительному 1Ь-10, показал, что во все сроки наблюдения после заражения кроликов пассалурозом величина его была в пределах нормы интакт-ных животных (табл. 1). При этом поддержка баланса про- и противовоспалительных ци-токинов как в ранние, так и в поздние сроки наблюдения, была обусловлена разнонаправленным характером изменений таких про-воспалительных цитокинов, как !Ь-1, ^-2 и TNF-а. Так, при общей активации продук-
10
ции 1Ь-1 и 1Ь-2, наиболее выраженной на 7-е сутки мониторинга, содержание TNF-a было значительно ниже контрольного, а максимально - к 21-му дню наблюдения.
Оценивая общее клиническое состояние кроликов, используемых в эксперименте, следует отметить, что у большинства животных период после заражения клинически протекал ареактивно. Между тем, наблюдались редкие случаи заболевания животных вирусной инфекцией после 7-ми суток (у 8,7%), сохраняющиеся до 10-х суток у 3,8% животных. К концу мониторинга заболевшие животные выздоравливали. Поскольку цитокины весьма чувствительны к любой инфекции [3], а также участвуют в активации системы гемостаза, образцы крови больных животных были исключены из общего дизайна исследования.
Широкий спектр биологической активности ГЬ-1 определяется его функцией главного медиатора развития местной воспалительной реакции и регулятора иммунного ответа. Именно ГЬ-1 запускает комплекс местных защитных реакций, вовлекающий практиче-
ски все типы клеток-эффекторов воспаления в элиминацию возбудителя и восстановление целостности поврежденной ткани [2].
Противовоспалительные цитокины представляют собой альтернативу провоспали-тельным цитокинам, а их эффекты носят антагонистический характер, угнетая выработку последних [6].
Несмотря на различия между животными обеих групп, цитокиновый профиль характеризовался некоторыми общими закономерностями. Так, концентрация ГЬ-1 характеризовалась волнообразным изменением в обеих группах животных. Уровень 1Ь-1 в сыворотке крови животных 1-й группы был выше или на уровне контроля; животные 2-й группы демонстрировали, наоборот, низкие значения ГЬ-1 (табл.1).
С целью оценки равновесия между про-и противовоспалительными цитокинами нами был рассмотрен коэффициент, который рассчитывали делением уровня 1Ь-1 на уровень 1Ь-4. Концентрация ^-4 в сыворотке крови животных 1-й группы была выше контрольных значений через 3-е суток от начала исследования, в остальное время она была ниже уровня контроля, и только к 14-м сут-
кам наблюдения концентрация ^-4 вернулась к контрольным значениям. Животные 2-й группы характеризовались низкими значениями Ш-4 (табл. 2).
Динамика соотношения !Ь-1/!Ь-4 имела двухфазный характер: подъем в ранние сроки инвазионного процесса (к 3-м суткам от начала исследования коэффициент превышал контрольное значение в 2,1-2,3 раза), снижение на 7-е сутки и повторный подъем на 10-е сутки исследования (коэффициент превышал контрольное значение в 2,6 раза), возвращаясь к 21-м суткам к контрольным значениям (табл. 2). Как следует из полученных нами результатов, у экспериментальных животных имелось значительное повышение коэффициента 1Ь-1/1Ь-4, что свидетельствует о преобладающем влиянии провоспалительных цитокинов над противовоспалительными. Проведенные исследования показали, что за счет поддержания баланса и контролируемых взаимоотношений между про- и противовоспалительными медиаторами создаются предпосылки для уничтожения патогенного агента, его последующей элиминации и поддержания гомеостаза.
Таблица 2.
Динамика содержания IL-1 и IL-4 в сыворотке крови кроликов после заражения
Passalurus ambiguous
Сроки исследования Кролики, зараженные Passalurus ambiguous (группа 1, n=30) (M±m, p)
IL-1, пкг/мл IL-4, пкг/мл (IL-1/IL-4) у.е.
3 сут. 2,58 ±0,26* 0,86 ±0,62** 3,02± 0,17*
7 сут. 3,60 ±0,41* *** 1,63 ±0,52** *** 2,20± 0,21* ****
10 сут. 3,82 ±0,51* *** 1,17 ±0,34** *** 3,25± 0,13* ***
14 сут. 3,50 ±0,42* *** 1,60 ±0,72* *** 2,19± 0,16* ***
17 сут. 3,15 ±0,32* *** 1,51 ±0,61* **** 2,09± 0,11* ****
21 сут. 2,87± 0,43* *** 2,06 ±0,63* *** 1,39 ±0,14* ***
Интактные кролики, контрольная группа (группа 2, n=10) (M±m, p)
фон 2,39 ±0,20 1,83 ±0,82 1,30 ±0,16
Примечание:
* - достоверное отличие в сравнении с контролем при Р < 0,05; ** - достоверное отличие в сравнении с контролем при Р < 0,01; *** - достоверное отличие с началом эксперимента при Р < 0,05; **** - достоверное отличие с началом эксперимента при Р < 0,01.
Таким образом, независимо от интенсивности реагирования экспериментальных животных на заражение гельминтами и продолжительности развития инвазионного процесса, наблюдались общие закономерности. Содержание IL-1 и IL-4 у исследованных животных при развитии инвазии в организме снижается. На всем протяжении эксперимента наблюдалось преобладание выработки провоспалительного цитокина над противовоспалительным, что подтверждалось высоким соотношением IL-1/IL-4.
Заключение
Анализируя полученные данные в целом, следует заключить, что заражение экспериментальных кроликов Passalurus ambiguous не отражается на балансе про-воспалительных и противовоспалительных цитокинов, вызывая адекватное усиление продукции IL-1, IL-2 и IL-10 к концу первой недели наблюдения на фоне существенного ограничения синтеза провоспалитель-ного TNF-a. Однако, к концу мониторинга (через 21 день) локальная концентрация IL-1 и IL-10 соответствуют таковым у контрольных интактных животных. При этом наблюдаемое наиболее выраженное снижение провоспалительного TNF-a следует расценивать как прогностически благоприятный признак, поскольку данному цитокину сегодня отводится ведущая роль в развитии воспаления [2], а сохраняющийся высокий уровень IL-2 свидетельствует о возможном усилении цитотоксическо-го потенциала клеточного иммунитета на местном уровне у опытных животных.
Впервые выявлено, что в динамике развития экспериментальной инвазии на самых ранних этапах развития без выраженных признаков воспаления наблюдалась тенденция к повышению IL-1 и снижению IL-4,
которая сопровождалась высоким соотношением IL-1/IL-4. Таким образом, определение концентрации провоспалительных и противовоспалительных цитокинов (IL-1 и IL-4) и их соотношение могут быть использованы для динамического контроля инвазионного процесса и оценки эффективности проводимой в дальнейшем терапии.
Список литературы
1. Галактионов, В. Г. Иммунология [Текст] / В. Г. Галактионов. - М. Академия, 2004. - 520 с.
2. Данилов, Л. Н. Влияние рецепторного антагониста IL-1 на развитие оксидативного стресса в легких [Текст] / Л. Н. Данилов, Е. С. Лебедева, И. В. Двора-ковская, А. С. Симбирцев, М. М. Илькович // Цитоки-ны и воспаление, 2003. - Т. 2. - №4. - С. 14-20.
3. Кетлинский, С. А. Цитокины и их антагонисты: теория и практика [Текст] / С. А. Кетлинский,
A. M. Ищенко // Медицинская иммунология, 1999. -Т. 1. - №3-4. - С. 16.
4. Ковальчук, Л. В. Новые возможности лечения цитокинами: иммуноцитокины в локальной иммуно-коррекции [Текст] / Л. В. Ковальчук, Л. В. Ганковская // Intern. J. Immunorehabilitation, 1997. - №6. - С. 57-60.
5. Колычев, Н. М. Ветеринарная микробиология и иммунология [Текст] / Н. М. Колычев. - М.: КолосС, 2003. - 432 с.
6. Митрейкин, В. Ф. Цитокины и их роль в развитии типовых патологических процессов [Текст] /
B. Ф. Митрейкин, Н. М. Калинина, С. В. Фабрични-ков, Н. И. Фабричникова. - Изд. СПбГМУ, 2000. - 64 с.
7. Симбирцев, А. С. Цитокины: классификация и биологические свойства [Текст] / А. С. Симбирцев // Цитокины и воспаление, 2004. - Т. 3. - №2. - С. 16-22.
8. Соколова, Н. Г. Влияние интерлейкина-1 Р на показатели иммунной системы здоровых людей [Текст] / Н. Г. Соколова, В. Г. Конусова, Н. В. Пигарева, И. Л. Бабкина, Е. А. Варюшина, А. Ю. Котов, А. С. Симбирцев // Медицинская иммунология, 1999. -Т. 1. - №3-4. - С. 136.
9. Фрейдлин, И. С. Регуляторные функции про-воспалительных цитокинов и острофазных белков [Текст] / И. С. Фрейдлин, П. Г. Назаров // Вест. РАМН, 1999. - №5. - С. 28-32.
10.Черешнев, В. А. Иммунология воспаления: роль цитокинов [Текст] / В. А. Черешнев, Е. Ю. Гусев // Медицинская иммунология, 2001. - Т. З. - №3. -
C. 361-368.
=Н
Подписной индекс журнала «Актуальные вопросы ветеринарной биологии»:
Агентство «Росспечать» - 33184
12
