CC BY
23
DOI: 10.24411/0235-2990-2019-10038
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Изменение токсических свойств метотрексата при воздействии экстремальных температур в период развития Drosophila melanogaster
*О. Н. АНТОСЮК, К. Т. ПАЙДИЕВА
Уральский федеральный университет им. первого Президента России Б. Н. Ельцина, Екатеринбург
Change of Toxic Properties of the Methotrexate when Exposed to Extreme Temperatures During Development of Drosophila melanogaster
*O. N. ANTOSYUK , K. T. PAYDIYEVA
Ural Federal University named after the first President of Russia B. N. Yeltsin, Yekaterinburg
Результаты экспериментов демонстрируют, что метотрексат при добавлении в питательную среду имеет влияние, как на генеративные, так и на соматические клетки дрозофил, в зависимости от концентрации данного вещества в питательной среде. Более того, при увеличении температуры в период развития дрозофил токсические свойства метотрексата усиливаются, что наблюдали исходя из анализа плодовитости дрозофил, развивающихся в среде с добавлением метотрексата, в отношении же летальности потомства отрицательного кумулятивного эффекта цитостатика и повышенной температуры не обнаружили. Отрицательного эффекта также не зарегистрировали и при совместном воздействии цитостатика и пониженной температуры на показатели жизнеспособности.
Ключевые слова: метотрексат, морфометрия, кумулятивный эффект, онтогенез, эмбриональные летали.
The results of the experiments show that a nutrient medium with the methotrexate has influence both on generative and on somatic cells of drosophila, depending on the concentration of this drug in a medium. Moreover, the higher temperature during development of drosophila can increase toxic properties of a methotrexate, which was observed based on an analysis of fertility of the flies developing in the environment with addition of a methotrexate, but no negative cumulative effect of cytostatic and elevated temperature were found in relation to lethality rate of the offspring. A negative effect on viability indicators was also not registered with the combined effects of the cytostatic and low temperature.
Keywords: methotrexate, morphometry, cumulative effect, ontogenesis, embryonic lethals.
Введение
Применяемые в медицинской практике лекарственные препараты могут обладать различного рода побочными эффектами, в том числе и общего токсического действия, если рассматривать препараты, используемые для химиотерапии. При определённых дополнительных воздействиях данный токсический эффект может изменяться [1]. Актуальным является выявление кумулятивных изменений основного эффекта лекарственных препаратов. В настоящей работе были изучены изменения токсического эффекта ме-тотрексата при воздействии экстремальных температур в период развития линии дикого типа Oregon-R ВгозорНИа melanogaster. D.melanogaster представляет собой классический тест-объект для проведения различных генетических и геноток-сикологических исследований.
© Коллектив авторов, 2019
*Адрес для корреспонденции: 620002, г. Екатеринбург, ул. Мира, 19. Уральский федеральный университет им. первого Президента России Б. Н. Ельцина
В последнее время внимание исследователей, занимающихся экологической генетикой и фар-макогенетикой привлекает биологический эффект метотрексата как с точки зрения собственно биологического эффекта, так и на предмет использования его оптимально эффективно и с наименьшим отрицательным воздействием [2]. Метотрексат — известный тератоген, проверенный на многих высших животных, но совсем мало информации об эффекте данного препарата при совместном воздействии других факторов, в частности об изменении токсических свойств данного вещества при изменении температурных условий, являющихся оптимальными для онтогенеза.
Для всесторонней экологической оценки состояния окружающей среды в качестве биотеста, в зависимости от поставленной задачи, используются различные модельные объекты. Среди модельных объектов особая роль принадлежит именно Drosophila melanogaster. Молекулярно-ге-нетические исследования последних лет, в том числе и расшифровка генома дрозофилы, позво-
лили обнаружить не только высокий уровень сходства в строении ряда генов с млекопитающими, но и сходства функций в ходе реализации наследственной информации [3].
Ряд общеизвестных особенностей дрозофилы имеет значение при постановке эксперимента: во-первых, это сравнительно короткий цикл развития от откладки яиц до вылета имаго, который при оптимальной температуре (24°С) составляет около 10 дней, во-вторых, важным является также и высокая плодовитость (50—100 яиц в сутки) в течение сравнительно длительного периода жизни, а в-третьих, это возможность культивирования на различных по своему составу питательных средах в лабораторных условиях.
Известно, что использование температурного режима 31±1°С для содержания дрозофил приводит к приостановке их развития и вызывает достаточно быструю гибель как имаго, так и личинок в первые трое суток. Особи мутантных линий при таких температурах даже не откладывают яйца [4]. Также неприемлемой является и низкая температура, которая полностью тормозит развитие и размножение ВпшорЫЫ melanogaster [4]. При использовании температуры 24±1°С, наибольшее значение для развития плодовой мушки приобретает используемый пищевой субстрат. Установлено, что на стандартной среде наблюдается некоторая задержка в развитии личиночных и куколочных фаз мутантов в сравнении с диким типом на 1—3 суток, в том числе и из-за изменённой экспрессии генов онтогенеза дрозофилы [5]. В современных условиях природные популяции разных видов организмов адаптируются к возрастающему загрязнению экосистем различными продуктами антропогенного воздействия. Нередко подобные адаптационные процессы сопровождаются резко выраженными популяционными волнами, причинами которых в большинстве случаев являются именно антропогенные факторы. Для изучения механизмов адаптации биосистем, испытывающих негативные воздействия, часто используются лабораторные линии дрозофилы, которые являются классическими для генетических и экотоксикологических экспериментов [6—7].
Материал и методы
Условия ведения эксперимента, состав питательных сред.
Для проведения опытов в работе использовали линию дикого типа Oregon-R D.melanogaster. Для изучения жизнеспособности была использована методика подсчёта общей, средней индивидуальной плодовитости, которую осуществляли в пластиковых пробирках в течение нескольких дней (10—15). Для этого взрослые имаго помещались в пробирки с полыми крышками, в которые заливалась агаровая среда, смазанная дрожжами. Откладываемые мухами яйца ежедневно собирали и помещали на чёрные агаровые пластинки в чашках Петри, для дальнейшего развития особей. На стадии личинки их пересаживали в банки со средой Альдерстона для учёта постэмбриональных леталей (личиночные и куколочные). Неразвив-
Рис. 1. Линейные (вверху) и двумерные (внизу) мор-фометрические показатели крыла D.melanoдaster.
шиеся яйца, классифицировали как РЭЛ или ПЭЛ по цвету (бурые яйца — поздние эмбриональные летали, белые — ранние эмбриональные летали и неоплодотворенные яйца). Состав среды Альдерстона:
а) Агар-агар — 2 г;
б) Сухие дрожжи — 25 г;
в) Глюкоза — 25 г;
д) Вода — 250 мл.
Для изучения токсического эффекта метотрексата в питательную среду его добавляли в концентрациях 400, 800, 8000 мкг/кг питательной среды. Концентрацию 400 мкг/кг питательной среды выбрали для получения большего количества жизнеспособных особей, необходимых в дальнейшем для морфометрического анализа крыла, а так же выявления линейных различий и различий в токсичности препарата, а также на основании данных по ЛД.
Личинки помещались в банки со средой (200 мл) в нескольких вариантах в трёх повторностях: контроли, эксперименты с метотрексатом (концентрация 400 мкг/кг). В дальнейшем банки со средой распределялись по термостатам с разными температурными режимами: 20°С (пониженная температура для развития), 24°С (стандартная температура для развития), 28°С (повышенная температура для развития). После вылета имаго подсчитывали количество выживших мух.
Морфометрнческнй анализ крыла. Для анализа эффекта метотрексата на соматические клетки использовали сравнительный анализ морфологических показателей крыла вылетевших мух. С этой целью имаго одного возраста определяли по полу и заспиртовывали. После чего крылья фотографировали с помощью цифровой камеры Nikon Coolpix 3000, далее полученные изображения крыльев обрабатывали при помощи компьютерной программы Universal Desktop Ruler. В работе использовали морфометрический анализ крыла по 18 линейным параметрам и 6 двумерным (рис. 1).
Все полученные данные обрабатывались статистически с использованием i-критерия, дискриминантного анализа и канонического анализа в программе Statistica 6.0.
Определение зависимости токсического эффекта метотрексата от его концентрации в питательной среде дрозофил
Исходное количество особей Повторности Контроль МТХ, 400 мкг/кг МТХ, 800 мкг/кг МТХ, 8000 мкг/кг
200 I 184 156 47 14
200 II 190 112 52 27
200 III 195 127 38 12
Среднее 189,67 131,67 45,67 17,67
Результаты и обсуждение
Определение зависимости токсического эффекта метотрексата от его концентрации в питательной среде дрозофил. Согласно таблице, наблюдали до-зозависимость выживаемости особей от концентрации метотрексата в питательной среде. С увеличением концентрации цитостатика ЛД увеличивалась: в контроле выжившие особи составили 94,83%, при концентрации метотрексата 400 мкг/кг питательной среды — 65,83%, при увеличении дозы в два раза (800 мкг/кг) — 22,83%, а при очень высокой концентрации 8000 мкг/кг —
90
80
70
я 5 60
К
о ш 50
ь
ф т 40
*
о Л)
20
10
0
-мах -гпп - среднее
*
■ 17,76 * I * 14,61 ] 16'97
■ , " 6,48 1 I 4 11*4 1 -1- I -1-
Огедоп-Р! контроль
Огедоп-Р} МТХ
Огедоп-Р1 МТХ+28=С
Огедоп-Р! 28:С
Огедоп-Р МТХ+20=С
Рис. 2. Средняя индивидуальная плодовитость (СИП) особей, выращенных в присутствии метотрексата, различных температурных режимах, а также при совместном воздействии метотрексата и экстремальных температур. Примечание. * - Статистически значимые отличия от контрольной группы.
12
ю
« 6
мах -ГГ¥П -среднее
4,55
' 1,91 ■ 0,48 , " °'6В 0,95 I * 4 0.37
Огедоп-Р контроль
Огедоп-Р МТХ
Огедоп-Р М~ПХ+28=С
Огедоп-Р 28:С
Огедоп-Р МТХ+20=С
Рис. 3. Частота поздних эмбриональных леталей потомства F1 у особей, особей, выращенных в присутствии метотрексата, различных температурных режимах, а также при совместном воздействии метотрексата и экстремальных температур.
выжившие мухи составили всего 8,83%. Таким образом, концентрация 400 мкг/кг среды превысила величину 50ЛД и была выбрана нами в отличие от других, используемых в работе концентраций для дальнейшей работы с экстремальными температурами.
Сравнение результатов анализа плодовитости особей О^оп-И, выращенных при различных условиях. При сравнении плодовитости изученных линий особое внимание уделялось таким показателям жизнеспособности, как плодовитость (общая и средняя) и частота летальности потомства на эмбриональном этапе развития. Рис. 2 демонстрирует отсутствие кумулятивного эффекта при понижении температуры онтогенеза и наличие выраженного отрицательного кумулятивного эффекта, усиливающего токсическое действие метотрексата в отношении плодовитости особей при повышении температурного режима в период развития дрозофилы.
В отношении показателя частоты эмбриональных лета-лей потомства ни в одной из экспериментальных групп не обнаружили повышения частоты ранних эмбриональных леталей (РЭЛ) в сравнении с частотой контрольной выборки. Соответственно, можно предположить отсутсвие отрицательного воздействия экстремального температурного режима самого по себе, а также на фоне совместного использования с цитостатиком. На рис. 3 показана несколько повышенная частота поздних эмбриональных леталей (ПЭЛ) по сравнению с остальными экспериментальными группами, но данное значение остается в пределах нормы, в связи с чем можно отметить также, что как и в отношении РЭЛ, частота ПЭЛ не характе-
Огедоп-Р! 20;С
Огедоп-Р 20;С
ризуется значимым изменением, за исключением группы особей, выращенных при пониженной температуре, для которых характерен положительный эффект изменения частоты ПЭЛ по сравнению с контрольной группой.
Исходя из полученных результатов, можно предположить, что влияние метотрексата , а также экстремальной температуры как самой по себе, так и совместно с цитостатиком на жизнеспособность дрозофил носит кратковременный характер, в связи с чем максимально выраженный эффект зарегистрировали именно в отношении фертильности особей, тогда как в отношении жизнеспособности потомства пролонгированного тождественного действия не наблюдали.
Морфометрический анализ крыла особей, выращенных при различных условиях. Влияние экстремальных температур выращивания дрозофил рассматривалось также и относительно проявления биологического эффекта на уровне соматических клеток. Эффект физических факторов стресса, а в данном случае — пониженной и повышенной температур (20°С и 28°С), даже в отсутствии внешних повреждений (в зависимости от уровня апоптоза в крыловом имагинальном диске), можно определить, используя морфомет-рический анализ крыловой пластинки. Несмотря на наличие визуальных повреждений, провели морфометрический анализ крыла. На уровне развития крыловой пластинки, как более чувствительной к каким-либо воздействиям структуры, даже эффект экстремальных температур самих по себе зарегистрировали как в отношении линейных, так и в отношении двумерных (площади ячеек крыла) параметров. На рис. 4 видно, что выборки, выращенные при различных температурных режимах, характеризуются различными параметрами крыловой пластинки, среди которых дискриминируют параметры длины крыла и параметры апикальной части крыловой пластинки. Предположительно, изменение параметров может происходить, благодаря изменению размеров клеток крылового имагинального диска [8], а также их миграции.
Стоит также отметить, что при изменении температур выращивания дрозофил в условиях химического стресса, а именно при добавлении метотрексата в питательную среду дрозофил, наблюдается и изменение токсического эффекта, проявляющееся в отношении изменения формы крыла. Соответственно, экстремальные температуры влияют на изменение эффекта метотрексата на соматические клетки, выступающего в роли фактора химического стресса (рис. 5, 6). При повышении температуры (28°С) форма крыла меняется очень интенсивно, дискриминируют 10 из 18 линейных параметров в разных локациях крыловой пластинки (А1, АЕ, ДБ, АТ, ЬМ, ЬБ, КВ, КЕ,
Рис. 4. Графическое представление анализа линейных морфометрических показателей крыла линии Oregon-R D.melanogaster
Рис. 5. Графическое представление анализа линейных морфометрических показателей крыла линии Oregon-R D.melanogaster
КЕ, КБ, КБ). Тогда как при понижении температуры (20°С) форма крыла меняется не так основательно, хотя дискриминируют также 10 линейных параметров из 18 (АК, АЕ, АМ, ЬМ, МБ, КБ, КЕ, КБ, 1Е, МЭД.
Таким образом, в экспериментах с добавлением МТХ в питательную среду в большей степени изменяются показатели ширины крыла.
Рис. 6. Графическое представление анализа двумерных морфометрических показателей крыла самок линии Oregon-R D.melanogaster
При проведении канонического анализа, включающего площади ячеек крыла, экспериментальные выборки во всех вариантах сравнения (экстремальных температур самих по себе, при повышении температуры, при понижении температуры) разделяются, хоть и менее выражено, а дискриминируют 21, 24, 25 и 26 ячейки (рис. 6). А в случае с понижением температуры дискриминируют все ячейки, за исключением только 22.
Причиной отсутствия различий по ячейкам 22 и 23 можно считать высокую нестабильность дис-тальной части крыла при воздействии метотрек-сата и повышенной температуры при развитии и сопутствующую высокую стабильность центральной части крыла.
Исходя из результатов всех вышеупомянутых экспериментов, можно сделать вывод о том, что метотрексат, как фактор химического стресса, выступает в качестве отрицательного воздействия на плодовитость дрозофилы. Токсический эффект метотрексата наблюдали при высоких концентрациях данного цитостатика в питательной среде, что сказывается на уровне изменения соматических клеток и дискриминации параметров крыла дрозофил. Более того,
ЛИТЕРАТУРА
1. Жукова О.В., Круглова Л.С., Шарапова E.H. Сочетанная ультрафиолетовая терапия и метотрексат в лечении больных тяжёлыми формами псориаза. Клиническая дерматология и венерология. — 2015. — Т. 14. № 2. — С. 66-73. / Zhukova O.V, Kruglova L.S., Sharapova E.N. Sochetannaya ul'trafioletovaya terapiya i metotreksat v lechenii bol'nykh tyazhelymi formami psoriaza. Klinicheskaya derma-tologiya i venerologiya 2015; 14: 2: 66-73. [in Russian]
2. Шитов Л.Н. Показатели микрофлоры толстой кишки у белых мышей, получавших метотрексат: дозозависимость эффекта и влияние путей
при повышенной температуре развития дрозофилы наблюдали изменение токсических свойств метотрексата.
Однако стоит отметить, что при пониженной температуре (20°С) развития дрозофил различия между морфометрическими показателями крыла контрольной выборки и экспериментом с метот-рексатом менее выражены в отношении линейных параметров и более выражены в отношении двумерных параметров, исходя из чего можно предположить, что меняется интенсивнее площадь крыловой пластинки в общем.
Также было обнаружено, что выращивание дрозофил при низкой температуре существенно замедляет их развитие на 3—4 сут.
Заключение
На основании проделанной работы можно сделать следующее заключение о кумулятивном эффекте экстремальных температур и метотрек-сата. Наиболее выраженный эффект от совместного применения наблюдали из всех показателей жизнеспособностей, используемых в работе, в отношении плодовитости особей. В отношении летальности потомства эффект от совместного применения экстремального температурного режима и цитостатика не только не усиливался, а даже имел положительную в отношении жизнеспособности особей тенденцию.
Изменение формы либо площади крыла у экспериментальных выборок дрозофилы позволяет сделать предположение о том, что изменению подвергаются латеральные части крыловой пластинки как при воздействии экстремальных температур без цитостатика, так и в присутствии цитостатика. Таким образом, можно сделать вывод о том, что различные в своей направленности температурные режимы хоть и в сходной тенденции изменяют крыловые параметры как в отдельности, так и на фоне воздействия метотрексатом, но данные изменения имеют свои особенности, выявление которых, поможет более глубоко и детально понять причины изменения токсических свойств не только метотрексата, но и других лекарственных препаратов в том числе.
Работа выполнена при финансовой поддержке постановление № 211 Правительства Российской федерации, контракт № 02.A03.21.0006.
введения. Современные наукоемкие технологии. — 2008. — № 5. — С. 54-55. / Shitov L.N. Pokazateli mikroflory tolstoj kishki u belykh myshej, poluchavshikh metotreksat: dozozavisimost' effekta i vliyanie putej vve-deniya. Sovremennye naukoemkie tekhnologii 2008; 5: 54-55. [in Russian]
Zwarts L, VuIsteke V., Buhi E. et al. Sig A, encoded by the homolog of the human schizophrenia-associated gene PRODH, acts in clock neurons to regulate Drosophila aggression. Dis Model Mech 2017; 1: 10: 705-716.
Струнов A.A., Илинский Ю.Ю., Захаров И.К. и др. Влияние повышенной температуры на выживаемость Drosophila melanogaster, инфицированных патогенным штаммом бактерий Wolbachia. Вави-
ловский журнал генетики и селекциию — 2013. — Т. 17. — № 2. — С. 265—276. / StrunovA.A., Ilinskij Jyu.Jyu, Zakharov I.K. i dr. Vliyanie povyshennoj temperatury na vyzhivaemost' Drosophila melanogaster, infitsirovannykh patogennym shtammom bakterij Wolbachia. Vavilovskij zhurnal genetiki i selektsii 2013; 17: 2: 265—276. [in Russian]
5. Chadov B.F., Chadova E.V., Copyl S.A. etal. Genes controlling ontogenesis: morphosis, phenocopies, dimorphs, and other visible expressions of mutant genes. Genetika 2004; 40: 3: 353-365.
6. Гончарова P. И, Левина А. Б, Кужир Т. ДИзучение чувствительности отдельных особей дрозофилы к мутагенному действию этилме-та-сульфоната. Генетика. — 1988. — Т. 24. — № 12. — С. 2141-2148. / Goncharova R. I., Levina A. B, Kuzhir T. D. Izuchenie chuvstvitel'nos-
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
ti otdel'nykh osobej drozofily k mutagennomu dejstvijyu etilmeta-sul'-fonata. Genetika 1988; 24: 12: 2141-2148. [in Russian]
7. Савинов А. Б, Курицына И. И. Об оценке загрязненности почв по данным биоиндикации (с использованием Drosophila melanogaster) и спектрального анализа. Физико-химические методы анализа. — 1993. — С. 60-65. / Savinov A. B, Kuritsyna 1.1. Ob otsenke zagryaz-nennosti pochv po dannym bioindikatsii (s ispol'zovaniem Drosophila melanogaster) i spektral'nogo analiza. Fiziko-khimicheskie metody analiza 1993; 60-65. [in Russian]
8. Fausto-Sterling A., Hsieh L. The behavior during the initial phase of in vitro aggregation of dissociated imaginal disc cells from Drosophila melanogaster. Dev Biol 1983; 100: 2: 339-349.
Антосюк Ольга Николаевна — к. б. н., доцент, Институт естественных наук и математики ФГАОУ ВО Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б. Н. Ельцина, Екатеринбург
Пайдиева Кристина Тимуровна — магистр, Институт естественных наук и математики ФГАОУ ВО Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б. Н. Ельцина, Екатеринбург
