Научная статья на тему 'Изменение степени метилирования ДНК промоторной области CBF-гена капусты Brassica oleracea L. при холодовой акклимации'

Изменение степени метилирования ДНК промоторной области CBF-гена капусты Brassica oleracea L. при холодовой акклимации Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

CC BY
173
72
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК / ГЕНЫ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ / ХОЛОДОВАЯ АККЛИМАЦИЯ РАСТЕНИЙ / DNA METHYLATION / GENES OF TRANSCRIPTION FACTORS / COLD ACCLIMATIZATION OF PLANTS

Аннотация научной статьи по биологическим наукам, автор научной работы — Гималов Ф. Р., Фарафонтов Д. С., Чемерис Д. А., Матниязов Р. Т., Чемерис А. В.

В промоторном участке CBF-гена капусты Brassica oleracea L. у проростков, прошедших и не прошедших этап закаливания, определены метилированные цитозины. Обнаружено, что у растений, прошедших этап холодового закаливания, происходит уменьшение степени метилирования последовательности ДНК промотора.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по биологическим наукам , автор научной работы — Гималов Ф. Р., Фарафонтов Д. С., Чемерис Д. А., Матниязов Р. Т., Чемерис А. В.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

INDUCED ALTERATION OF METHYLATION DEGREE OF CBF GENE PROMOTER OF CAULIFLOWER (BRASSICA OLERACEA L.)IN COLD ACCLIMATIZATION

Methylated cytosinesare defined in a promoter area of a CBF gene of both cold acclimated and non-acclimated cauliflower (Brassica oleracea L.). It is shown that after cold acclimatization a level of cytosine methylation in CBF gene promoters is reduced.

Текст научной работы на тему «Изменение степени метилирования ДНК промоторной области CBF-гена капусты Brassica oleracea L. при холодовой акклимации»

УДК 577.2+

ИЗМЕНЕНИЕ СТЕПЕНИ МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК ПРОМОТОРНОЙ ОБЛАСТИ CBF-ГЕНА КАПУСТЫ BRASSICA OLERACEA L. ПРИ ХОЛОДОВОЙ АККЛИМАЦИИ

© Ф. Р. Гималов*, Д. С. Фарафонтов, Д. А. Чемерис,

Р. Т. Матниязов, А. В. Чемерис

Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Россия, Республика Башкортостан, 450054 г. Уфа, пр. Октября, 71.

Тел./факс: +7 (347) 235 60 88.

E-mail: gimalov@anrb.ru

В промоторном участке CBF—гена капусты Brassica oleracea L. у проростков, прошедших и не прошедших этап закаливания, определены метилированные цитозины. Обнаружено, что у растений, прошедших этап холодового закаливания, происходит уменьшение степени метилирования последовательности ДНК промотора.

Ключевые слова: метилирование ДНК, лимация растений.

Введение

Известно, что растения весьма значительно отличаются по способности развития устойчивости к низким температурам. Многие растения из зон с теплым климатом не могут переносить морозы, в то время как растения из регионов с умеренным климатом способны к холодовой акклимации, сопровождаемой различными биохимическими изменениями, вызванными, в свою очередь, индукцией определенных генов [1]. Установлено, что ключевую роль в индукции экспрессии регулируемых холодом генов играют транскрипционные факторы CBF [2-3]. Например, у рапса сверхэкспрессия CBF-генов арабидопсиса вызывает индукцию экспрессии генов, имеющих CRT/DRE элементы в своих промоторах, и приводит к увеличению морозостойкости растений [4]. Очевидно, что у этого растения имеется полный функциональный набор компонентов пути холодового ответа с участием CBF-генов, подобный таковому у арабидопсиса. В то же время сверхэкспрессия CBF-генов арабидопсиса в растениях томата не вызывала заметного увеличения морозостойкости [5]. Для томата также установлено наличие начальных компонентов пути холодового ответа с участием CBF-генов: три LeCBF гена, расположенные в геноме тандемно. Однако нижележащие элементы данного пути у арабидопсиса и томата сильно отличаются. Так, исследования с использованием ДНК-чипов показали, что сверхэкспрессия факторов CBF в растениях трансгенного томата вызывала у них увеличение экспрессии значительно меньшего количества генов, чем у арабидопсиса [5].

Различия в устойчивости растений к низким температурам могут быть обусловлены и различным строением промоторных областей cor-генов. Например, было показано, что у растений Medicago truncatula промоторы генов CAS-белков (cold acclimation specific), накапливающихся при холодовой акклимации, содержат меньшее количество

гены транскрипционных факторов, холодовая акк-

CRT/DRE мотивов, чем в промоторах этих генов более устойчивого к холоду M. falcate [6].

Таким образом, особенности растений в развитии устойчивости к холодовому воздействию обусловлены как различиями в количестве и разнообразии генов, которые можно отнести к соответствующим CBF-регулонам, так и структурной организацией регуляторных последовательностей cor-генов, определяющей различия в экспрессии данных генов у разных растений.

Однако известны и другие механизмы регуляции экспрессии генов, в частности, путем изменения конформации хроматинового комплекса за счет обратимого превращения транскрипционно активного эухроматина в транскрипционно неактивный гетерохроматин, которые отличаются по степени метилирования цитозина в CG и CNG последовательностях, степени ацетилирования гистонов и плотной упаковке хроматина, меняющего доступность для РНК полимераз.

Известно, у высших растений ДНК сильно метилированы по остаткам цитозина; 5-метилцитозин локализован преимущественно в CG и CNG последовательностях с диадной симметрией. Глобальное метилирование ДНК видо-, ткане-, органоспецифично, оно изменяется при прорастании семян, переходе растений к цветению, различных вирусных и грибных инфекциях и уменьшается с возрастом [7]. Метилирование ДНК может существенно модулироваться различными биотическими (вирусы, грибы, паразитические растения) и абиотическими факторами, влияющими на рост и развитие растений [7]. Специфические изменения в характере метилирования ДНК происходят на протяжении всей жизни растения, начиная от прорастания семян и вплоть до его гибели, запрограммированной или вызванной разными агентами и факторами биотической и абиотической природы.

В данной работе мы исследовали влияние низкой температуры на степень метилирования ДНК гена CBF капусты Brassica oleracea L.

* автор, ответственный за переписку

Методика исследования

Объектами исследования служили растения цветной капусты сорта Альфа (Brassica oleracea var. botrytis L.). Растения выращивали в грунте из вермикулита с добавлением среды Murashige and Skooge [8] при 24 °C 16-часовом фотопериоде и освещенности 15 клк. На стадии появления 4-го листа часть растений помещали в термостатированную камеру с освещением и с температурой в камере 7 °С и выращивали в течение 1 недели. Затем из растений, растущих при комнатной температуре, а также из растений, прошедших стадию закаливания, выделяли ДНК и определяли степень метилирования промоторной последовательности CBF-гена.

Метилированные цитозины в клонированных образцах ДНК определяли методом бисульфитной обработки [9] с использованием набора EZ DNA Methylation™ Kit (Zymo Research, США) по прописи фирмы-производителя. В реакцию брали около 500 нг ДНК каждого образца. После бисульфитной обработки ДНК использовали для проведения ПЦР, амплификаты клонировали в векторе pAL-TA, затем определяли их нуклеотидную последовательность на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 310 (Applied Biosystems, США), используя наборы для секвенирования “Big Dye Terminator v.3.0”. Би-сульфитную обработку ДНК проводили в нескольких повторностях.

ПЦР проводили в ДНК-амплификаторе модели Терцик (ДНК-Технология, Россия) при следующих условиях: денатурация двухцепочечной ДНК 95°С, 1 мин, затем отжиг праймеров и их удлинение при

температурах 59 °С, 30 сек и 72 °С, 1 мин, денатурация 94 °С, 30 сек, в конце проводили дополнительную элонгацию при 72 °C в течение 3 мин. Количество циклов 35-40. Размер продуктов амплификации устанавливали, сравнивая с маркером “Gene Ruler™ 100 bp Plus DNA Ladder” (Fermentas, Литва).

Результаты и их обсуждение

Нуклеотидная последовательность фрагмента гена транскрипционного фактора CBF была определена ранее [10]. Из растений капусты, прошедших и не прошедших холодовую акклимацию, выделили тотальную ДНК. После бисульфитной обработки этих образцов ДНК фрагмент гена CBF (участок от -360 п.н. до +177 п.н.) амплифицирова-ли с помощью ПЦР, клонировали и определили нуклеотидную последовательность полученных клонов. Праймеры (прямой - ATAAAAGTATA-ACGAGTGAAGAGT, обратный - TTCCCTCACT-TCACACACCCA) подбирали к участкам, сохраняющим свою нуклеотидную последовательность и при бисульфитной обработке, то есть последовательность прямого праймера подбирали на участок промотора с наименьшим количеством цитозина, который может быть замещен на тимин в ходе обработки, а последовательность обратного праймера - на участок гена, не содержащий гуанин.

В предварительном опыте было показано, что в клонированном фрагменте гена более половины из всех цитозинов при бисульфитной обработке ДНК конвертировались в тимин, следовательно, в исходной ДНК это были неметилированные цитозины (рис. 1).

1 СЛОСЛОССЛТЛССЛСЛЛЛООТСЛЛОЛТОЛСЛСОТООСЛОСЛТЛТЛЛОТОЛ -310

2 ТЛОТЛОТТЛТЛТТЛТЛЛЛООТТЛЛОЛТОЛТЛТОТООТЛОТЛТЛТЛЛОТОЛ -310

1 ЛТОЛЛЛЛСЛЛСОСЛТТСЛСЛСЛЛЛССОТОООЛТОЛТСЛЛТТТЛОСТОТОТ -260

2 ЛТОЛЛЛЛТЛЛТОТЛТТТЛТЛТЛЛЛТТОТОООЛТОЛТТЛЛТТТЛОТТОТОТ -260

1 СОТОТССЛСТТООСЛСТССОЛОЛОССЛЛЛЛЛЛЛСЛССОТОТТСТТТТСТЛ -210

2 СОТОТССЛСТТООСЛСТССОЛОЛОССЛЛЛЛЛЛЛСЛССОТОТТСТТТТСТЛ -210

1 ЛЛЛТССЛОССССЛСССЛТТТССЛЛЛТЛТСТСЛТОССЛЛТЛТЛЛЛСЛССЛЛ -160

2 ЛЛЛТССЛОССССЛСССЛТТТССЛЛЛТЛТСТСЛТОССЛЛТЛТЛЛЛСЛССЛЛ -160

1 СТСТСОСТССЛСТТТТСТСЛЛЛССЛСЛЛЛСТТТТЛЛСТССЛССТОЛЛЛЛО -110

2 СТСТСОСТССЛСТТТТСТСЛЛЛССЛСЛЛЛСТТТТЛЛСТССЛССТОЛЛЛЛО -110

1 ЛЛОЛТЛЛЛЛОЛОЛОЛОЛЛЛТЛЛЛТЛТСТТЛТСЛЛЛССЛОЛСЛОЛЛСЛОЛО -60

2 ЛЛОЛТЛЛЛЛОЛОЛОЛОЛЛЛТЛЛЛТЛТСТТЛТСЛЛЛССЛОЛСЛОЛЛСЛОЛО -60

1 ЛТСТТОТТЛСТТЛСТЛТЛСТЛСЛСТСЛОССТТЛТССЛОТТТТСЛЛЛЛОЛЛ -10

2 ЛТСТТОТТЛСТТЛСТЛТЛТТЛТЛТТТЛОТТТТЛТТТЛОТТТТТЛЛЛЛОЛЛ -10

1 ОТТТСЛЛСТЛГСЛЛСТСЛОТСТСТЛСТТТТТСТОЛЛСТТСТТООСТСТОЛ +41

2 ОТТТТЛЛТТЛГСЛЛТТТЛОТТТТТЛТТТТТТТТОЛЛТТТТТТООТТТТОЛ +41

1 ОЛЛСОЛОТСТССООТЛООТООТОЛТТЛСТОТСССЛТОТТООСООСОЛОСТ +91

2 ОЛЛТОЛОТТТТТООТЛООТООТОЛТТЛТТОТТТТЛТОТТООТООТОЛОТТ +91

1 ОТССОЛЛОЛЛОССООСОООТЛООЛЛОЛЛОТТТСОООЛОЛСЛСОТСЛСССС +141

2 ОТТТОЛЛОЛЛОТТООТОООТЛООЛЛОЛЛОТТТТОООЛОЛТЛТОТТЛТТТТ +141

1 ЛТТТЛССОЛООЛОТТСОССТТЛОЛЛЛЛТСЛООТЛЛО +177

2 ЛТТТЛТТОЛООЛОТТТОТТТТЛОЛЛЛЛТТЛООТЛЛО +177

Рис. 1. Сравнение нуклеотидных последовательностей фрагмента гена ОБЕ в исходной ДНК из растений капусты, растущих в нормальных температурных условиях, без бисульфитной обработки (1) и после бисульфитной обработки (2). Курсивом

выделен старт транскрипции.

В исследуемой последовательности ДНК не-метилированными оказались остатки цитозинов в диапозоне примерно до -262 и после -41 положений. При этом часть цитозиновых остатков как в сайтах СО, СКО, так и в сайтах СКК при бисуль-фитной обработке ДНК незакаленных растений остались неизменными, что указывает на то, что в исходной ДНК они были метилированы. Наибольшее количество таких метилировнных цитозинов обнаруживались во фрагменте промотора, ограниченном положениями -261 и -40.

На рис. 2 приведены фрагменты нуклеотидных последовательностей 10 клонов ДНК, ограничен-

ные положениями -261 и -41, содержащие участки промотора СББ-гена из растений капусты, прошедших и не прошедших холодовое закаливание, в сравнении с нуклеотидной последовательностью ДНК без бисульфитной обработки.

Видно, что содержание метилированных и не-метилированных цитозинов в ДНК закаленных и незакаленных растений отличалось, хотя и незначительно. В различных клонах часть цитозиновых остатков, от 7 до 12, метилированных в исходной ДНК, при закаливании деметилировались. При этом 5 цитозинов в положениях -200... -197 и -195, -194 были деметилированы во всех исследованных клонах.

1 -261 ОТСОТОТССЛСТТООСЛСТССОЛОЛОССЛЛЛЛЛЛЛСЛССОТОТТСТТТТСТЛЛЛЛ -207

2 -261 ОТСОТОТССЛСТТООСЛСТССОЛОЛОССЛЛЛЛЛЛЛСЛССОТОТТСТТТТСТЛЛЛЛ -207

3 -261 ОТСОТОТССЛСТТООСЛСТССОЛОЛОССЛЛЛЛЛЛЛСЛССОТОТТСТТТТСТЛЛЛЛ -207

4 -261 ОТСОТОТССЛСТТООСЛСТССОЛОЛОССЛЛЛЛЛЛЛСЛССОТОТТСТТТТСТЛЛЛЛ -207

5 -261 ОТСОТОТССЛСТТООСЛСТССОЛОЛОССЛЛЛЛЛЛЛСЛССОТОТТСТТТТСТЛЛЛЛ -207

6 -261 ОТСОТОТССЛСТТООСЛСТССОЛОЛОТСЛЛЛЛЛЛЛСЛССОТОТТСТТТССТЛЛЛЛ -207

7 -261 ОТСОТОТССЛСТТООСЛСТССОЛОЛОТСЛЛЛЛЛЛЛСЛССОТОТТСТТТССТЛЛЛЛ -207

8 -261 ОТСОТОТССЛСТТООСЛСТССОЛОЛОТСЛЛЛЛЛЛЛСЛССОТОТТСТТТССТЛЛЛЛ -207

9 -261 ОТСОТОТССЛСТТООСЛСТССОЛОЛОССЛЛЛЛЛЛЛСЛССОТОТТТТТТТСТЛЛЛЛ -207 10-261 ОТСОТОТССЛСТТООСЛСТССОЛОЛОССЛЛЛЛЛЛЛСЛССОТОТТСТТТТСТЛЛЛЛ -207

1 -206 ТССЛОССССЛСССЛТТТССЛЛЛТЛТСТСЛТОССЛЛТЛТЛЛЛСЛССЛЛСТСТСОСТ -152

2 -206 ТССЛОССССЛСССЛТТТССЛЛЛТЛТСТСЛТОССЛЛТЛТЛЛЛСЛССЛЛСТСТСОСТ -152

3 -206 ТССЛОССССЛСССЛТТТССЛЛЛТЛТСТСЛТОССЛЛТЛТЛЛЛСЛССЛЛТТСТСОСТ -152

4 -206 ТССЛОССССЛСССЛТТТССЛЛЛТЛТСТСЛТОССЛЛТЛТЛЛЛСЛССЛЛТТСТСОСТ -152

5 -206 ТССЛОССССЛСССЛТТТССЛЛЛТЛТСТСЛТОССЛЛТЛТЛЛЛСЛССЛЛТТСТСОСТ -152

6 -206 ТССЛОТТТТЛТТТЛТТТССЛЛЛТЛТСТСЛТОССЛЛТЛТЛЛЛСЛССЛЛСТСТСОСТ -152

7 -206 ТССЛОТТТТЛТТТЛТТТССЛЛЛТЛТСТСЛТОССЛЛТЛТЛЛЛСЛССЛЛСТСТСОСТ -152

8 -206 ТССЛОТТТТЛТТТЛТТТССЛЛЛТЛТСТСЛТОССЛЛТЛТЛЛЛСЛССЛЛСТСТСОСТ -152

9 -206 ТТТЛОТТТТЛТТТЛТТТССЛЛЛТЛТСТТЛТОССЛЛТЛТЛЛЛСЛССЛЛСТСТСОТТ -152

10-206 ТТТЛОТТТТЛТТСЛТТТССЛЛЛТЛТСТСЛТОССЛЛТЛТЛЛЛСЛССЛЛТТТТСОСТ -152

1 -151 ССЛСТТТТСТСЛЛЛССЛСЛЛЛСТТТТЛЛСТССЛССТОЛЛЛЛОЛЛОЛТЛЛЛЛОЛОЛ -97

2 -151 ССЛСТТТТСТСЛЛЛССЛСЛЛЛСТТТТЛЛСТССЛССТОЛЛЛЛОЛЛОЛТЛЛЛЛОЛОЛ -97

3 -151 ССЛСТТТТСТСЛЛЛССЛСЛЛЛСТТТТЛЛСТССЛССТОЛЛЛЛОЛЛОЛТЛЛЛЛОЛОЛ -97

4 -151 ССЛСТТТТСТСЛЛЛССЛСЛЛЛСТТТТЛЛСТССЛССТОЛЛЛЛОЛЛОЛТЛЛЛЛОЛОЛ -97

5 -151 ССЛСТТТТСТСЛЛЛССЛСЛЛЛСТТТТЛЛСТССЛССТОЛЛЛЛОЛЛОЛТЛЛЛЛОЛОЛ -97

6 -151 ССЛСТТТТСТСЛЛЛССЛСЛЛЛСТТТТЛЛСТССЛССТОЛЛЛЛОЛЛОЛТЛЛЛЛОЛОЛ -97

7 -151 ССЛСТТТТСТСЛЛЛССЛСЛЛЛСТТТТЛЛСТССЛССТОЛЛЛЛОЛЛОЛТЛЛЛЛОЛОЛ -97

8 -151 ССЛСТТТТСТСЛЛЛССЛСЛЛЛСТТТТЛЛСТССЛССТОЛЛЛЛОЛЛОЛТЛЛЛЛОЛОЛ -97

9 -151 ТСЛСТТТТСТСЛЛЛССЛСЛЛЛСТТТТЛЛСТССЛССТОЛЛЛЛОЛЛОЛТЛЛЛЛОЛОЛ -97

10-151 ССЛСТТТТСТСЛЛЛТСЛСЛЛЛСТТТТЛЛСТССЛССТОЛЛЛЛОЛЛОЛТЛЛЛЛОЛОЛ -97

1 -96 ОЛОЛЛЛТЛЛЛТЛТСТТЛТСЛЛЛССЛОЛСЛОЛЛСЛОЛОЛТСТТОТТЛСТТЛСТЛТЛ -42

2 -96 ОЛОЛЛЛТЛЛЛТЛТСТТЛТСЛЛЛССЛОЛСЛОЛЛСЛОЛОЛТСТТОТТЛСТТЛСТЛТЛ -42

3 -96 ОЛОЛЛЛТЛЛЛТЛТСТТЛТСЛЛЛССЛОЛСЛОЛЛСЛОЛОЛТСТТОТТЛСТТЛСТЛТЛ -42

4 -96 ОЛОЛЛЛТЛЛЛТЛТСТТЛТСЛЛЛССЛОЛСЛОЛЛСЛОЛОЛТСТТОТТЛСТТЛСТЛТЛ -42

5 -96 ОЛОЛЛЛТЛЛЛТЛТСТТЛТСЛЛЛССЛОЛСЛОЛЛСЛОЛОЛТСТТОТТЛСТТЛСТЛТЛ -42

6 -96 ОЛОЛЛЛТЛЛЛТЛТСТТЛТСЛЛЛССЛОЛСЛОЛЛСЛОЛОЛТСТТОТТЛСТТЛСТЛТЛ -42

7 -96 ОЛОЛЛЛТЛЛЛТЛТСТТЛТСЛЛЛССЛОЛСЛОЛЛСЛОЛОЛТСТТОТТЛСТТЛСТЛТЛ -42

8 -96 ОЛОЛЛЛТЛЛЛТЛТСТТЛТСЛЛЛССЛОЛСЛОЛЛСЛОЛОЛТСТТОТТЛСТТЛСТЛТЛ -42

9 -96 ОЛОЛЛЛТЛЛЛТЛТСТТЛТСЛЛЛТСЛОЛСЛОЛЛТЛОЛОЛТСТТОТТЛТТТЛСТЛТЛ -42

10-96 ОЛОЛЛЛТЛЛЛТЛТСТТЛТСЛЛЛТСЛОЛСЛОЛЛСЛОЛОЛТСТТОТТЛСТТЛСТЛТЛ -42

Рис. 2. Сравнение нуклеотидных последовательностей фрагмента промотора гена СВР капусты: 1 - последовательность нуклеотидов исходной ДНК без бисульфитной обработки; 2-6 - последовательности нуклеотидов ДНК из растений без холодового закаливания после бисульфитной обработки; 7-11 - последовательности нуклеотидов ДНК из растений, прошедших стадию холодового закаливания, после бисульфитной обработки.

Вовлеченность процессов метилирования ДНК в регуляцию активности генов было продемонстрировано на примере генов рРНК при изучении различных промоторных последовательностей видов пшеницы и их диких сородичей в связи с явлением ядрышкового доминирования (Чемерис и др., 2003) [11]. В ответ на экзогенное воздействие на проростки пшеницы фитогормона цитокинина (6-бензиламинопурин) происходило деметилирование целого ряда цитозинов в промоторных областях. Изменение статуса метилирования ДНК при абиотических стрессах показано у растений табака (Choi, Sano, 2007) [12]. Были исследованы гены, кодирующие глицерофосфодиэстеразо-подобный белок (NtGPDL), индуцируемый при воздействии ионов алюминия и оксидативном стрессе. При обработке листьев табака алюминием транскрипты NtGPDL индуцировались в течение шести часов, а соответствующие локусы деметилировались в течение одного часа. Деметилированными были CG сайты в некоторых участках кодирующих регионов и по всей про-моторной области. Температура окружающей среды также оказывает влияние на степень метилирования ДНК. Так, ДНК озимых сортов пшеницы метилированы в большей степени, чем яровых (Sherman, Talbert, 2002) [13]. У растений Antirrhinum majus транс-позон Tam3 активируется при пониженной температуре, а при высокой температуре роста (~25 °С) подавляется, при этом степень метилирования транс-позона при низкой температуре ниже, чем при более высокой (Hashida et al., 2006) [14].

Метилированные цитозины в ДНК цветной капусты обнаружены как в сайтах CG, CNG, так и в асимметричных сайтах. При холодовом закаливании часть этих метилированных цитозинов теряла свои метильные группы. Можно предположить, что изменение степени метилирования этого участка промотора, ограниченного положениями -261 и -40, способствует изменению конформации хроматина и лучшему связыванию транскрипционных факторов и/или РНК-полимеразы. Стоит отметить, что у арабидопсиса, как показано в экспериментах с де-леционными мутантами промотора гена CBF, участок промотора от -189-го до -35-го нуклеотида является важным элементом поддержания экспрессии этого гена [15].

Следовательно, наши результаты, демонстрирующие уменьшение степени метилирования ДНК при холодовой обработке растений, согласуются с концепцией взаимосвязи уровня экспрессии генов и степени метилирования генома (Bird, 2002) [16].

Выводы

Полученные результаты показывают, что значительное количество цитозинов в промоторной последовательности гена CBF капусты неметили-рованы. Метилированные цитозины выявлены, главным образом, во фрагменте промотора, ограниченном положениями -261 и -40. Холодовое закаливание растений приводило к частичному деме-

тилированию цитозина в исследуемом фрагменте промотора гена CBF.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Работа поддержана грантами ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (госконтракт № 02.740.11.0290) и ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (госконтракт № 16.518.11.7047).

ЛИТЕРАТУРА

1. Thomashow F. M. Plant cold acclimation: freezing tolerance genes and regulatory mechanisms // Annu. Rev. Plant Physiol. 1999. V. 50. P. 571-599.

2. Van Buskirk H. A., Thomashow F. M. Arabidopsis transcription factors regulating cold acclimation // Phys. Plantarum. 2006. V. 126. P. 72-80.

3. Sharma P., Sharma N., Deswal R. The molecular biology of the low-temperature response in plants // BioEssay. 2005. V.27. P. 1048-1059.

4. Jaglo K. R., Kleff S., Amundsen K. L., Zhang X., Haake V., Zhang J. Z., Deits T., Thomashow M. F. Components of the Arabidopsis C-repeat/dehydration-responsive element binding factor cold-response pathway are conserved in Brassica napus and other plant species // Plant Physiol. 2001. V. 127. P. 910-917.

5. Zhang X., Fowler S. G., Cheng H., Lou Y., Rhee S. Y., Stock-inger E. F., Thomashow F. M. Freezing-sensitive tomato has a functional CBF cold response pathway, but a CBF regulon that differs from that of freezing-tolerant arabidopsis // Plant L. 2004. V.39. P. 905-919.

6. Pennycooke J. C., Cheng H., Stockinger E. J. Comparative genomic sequence and expression analysis of Medicago trun-catula and Alfalfa subspecies falcate cold-acclimation-specific genes // Plant Phys. 2008. V.146. P. 1242-1254.

7. Ванюшин Б. Ф. Метилирование ДНК у растений. Механизмы и биологическая роль. М.: Наука, 2009. 77 с.

8. Murashige T., Scoog F. A. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco cultures // Physiol. Plant. 1962. V. 15. P. 473-497.

9. Frommer M., McDonald L. E., Millar D. S., Collis C. M., Watt F., Grigg G. W., Molloy P. L., Paul C. L. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V.89. P. 1827-1831.

10. Гималов Ф. Р., Фарафонтов Д. С., Чемерис Д. А., Матния-зов Р. Т., Чемерис А. В. Экспрессия CBF-подобного гена цветной капусты (Brassica oleracea L.) при холодовом стрессе // Агрохимия. 2011. №11. С. 71-77.

11. Чемерис Чемерис А. В., Сабиржанов Б. Е., Ахунов Э. Д., Куликов А. М., Никоноров Ю. М., Гималов Ф. Р., Бикбулатова С. М., Баймиев А. Х. Филогенетические взаимоотношения пшенично-эгилопсного альянса и нуклеотидные последовательности промоторных областей рДНК пшениц и их диких сородичей // Г енетика. 2003. Т.39. С. 5-17.

12. Choi C.-S., Sano H. Abiotic-stress induces demethylation and transcriptional activation of a gene encoding a glycerophos-phodiesterase-like protein in tobacco plants // Mol. Genet. Genomics. 2007. V.277. P. 589-600.

13. Sherman J. D., Talbert L. E. Vernalization-induced changes of the DNA methylaion pattern in winter wheat // Genome. 2002. V.45. P. 253-260.

14. Hashida S.-N., Uchiyama T., Martin C., Kishima Y., Sano Y., Mikami T. The temperature-depended change in methylation of the Antirrhinum transposon Tam3 is controlled by the activity of its transposase // Plant Cell. 2006. V.18. P. 104-118.

15. Zarka D. G., Vogel J. T., Cook D., Thomashow M. F. Cold induction of Arabidopsis CBF genes involves multiple ICE (Inducer of CBF expression) promoter elements and a cold-regulatory circuit that is desensitized by low temperature // Plant Physiol. 2003. V.133. P. 910-918.

16. Bird A. P. DNA methylation patterns and epigenetic memory // Genes Dev. 2002. V.16. P. 6-21.

Поступила в редакцию 16.12.2011 г.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.