CC BY
53
ВЕСТНИК ТГГПУ. 2011. №3(25)
УДК 612.66/68+612.173+612.897+53.083.2
ИЗМЕНЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ОКСИДА АЗОТА В РАЗНЫХ ТКАНЯХ 56-И 81- СУТОЧНЫХ КРЫС, РАСТУЩИХ В УСЛОВИЯХ ГИПОКИНЕЗИИ
© Р.И.Файзуллина, Р.И.Гильмутдинова, Г.Г.Яфарова, В.В.Андрианов, Ф.Г.Ситдиков, Х.Л.Гайнутдинов
Методом электронного парамагнитного резонанса с использованием спиновой ловушки анализировали содержание оксида азота в тканях желудочков и предсердий сердца, печени, мышц задних конечностей и спинного мозга контрольных и гипокинезированных крыс 56- и 81-суточного возраста. Обнаружено, что при гипокинезии происходит значительное увеличение содержания оксида азота в тканях всех исследованных органов, кроме спинного мозга, наибольшее увеличение N0 произошло в тканях предсердий и желудочков сердца.
Ключевые слова: оксид азота, гипокинезия, крыса, сердце, электронный парамагнитный резонанс.
Оксид азота (N0), который впервые был описан как фактор расслабления гладких мышц сосудов, является важным модулятором клеточной активности во многих тканях у позвоночных и беспозвоночных животных. N0 способен взаимодействовать с разнообразными веществами -тиолами, белками, сахарами, ионами металлов, гемами протеинов и т.д., локализованными в самых различных тканях и органеллах, что предполагает наличие N0 и его комплексов в различных тканях [1]. В жизнедеятельности позвоночных особо значима роль N0 при функционировании сердечно-сосудистой системы. N0 контролирует сосудистый тонус, артериальное давление, пролиферацию эндотелиальных и гладкомышечных клеток сосудистой стенки, участвует в возникновении атеросклероза и гипертензий, регулирует сократимость миокарда. N0 участвует в процессе воспалений при ревматических, аутоиммунных и вирусных заболеваниях, модулирует образование тканевой жидкости и отеков, играет ключевую роль в подавлении активности бактериальных и опухолевых клеток, также может инициировать рост последних [2; 3].
Избыточное формирование N0 может заметно снижать тонус гладкомышечных клеток, ухудшать функцию эндотелия и прямо угнетать сократительную функцию миокарда, что наблюдается при септическом и геморрагическом шоке [4], остром инфаркте миокарда [5]. Существует и противоположная точка зрения, согласно которой избыток N0 служит компенсаторным фактором и способствует поддержанию тканевой перфузии и оказывает антиаритмическое действие при реперфузии [6; 7: 24-25; 8]. Следовательно, можно говорить о двух диаметрально противоположных влияниях N0: во-первых, стимулирующее, положительное, а во-вторых, он способен оказывать токсическое, повреждающее дей-
ствие, приводить к гибели клеток. Исходя из этого не ясно, какие количества N0 в различных тканях позвоночных следует считать небольшими, а какие - увеличенными. Подходы к лечению больных с сердечно-сосудистой патологией путем влияния на систему N0 в организме нуждаются в научном обосновании [9; 8].
Встает вопрос об использовании современного метода обнаружения и количественного определения содержания N0 в разных тканях живых организмов в норме и при экспериментальном моделировании патологий. Одним из наиболее эффективных методов обнаружения и количественного определения N0 в биологических тканях стал метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) [10; 11]. Это произошло благодаря методике, разработанной Ваниным и др. [12], в которой они использовали так называемый метод спинового захвата, основанный на реакции радикала со спиновой ловушкой. В результате реакции образуется аддукт с характерным спектром ЭПР. Применяется комплекс Бе2+ с диэтилдитио-карбанатом (ДЭТК) для захвата N0 и формирования устойчивого тройного комплекса (ДЭТК)2-Бе2+-К0 в различных тканях животных. Эти комплексы характеризуются легко распознаваемым спектром ЭПР со значением g-фактора g=2,035-2,040 и триплетной сверхтонкой структурой.
Ранее нами была проанализирована продукция N0 в тканях сердца крыс разных возрастных групп при фармакологической десимпатизации методом ЭПР с использованием спиновой ловушки [13]. Было обнаружено, что количество N0, образующегося в тканях сердца крыс, в ходе онтогенеза существенно уменьшается. Фармакологическая десимпатизация сопровождалась заметным снижением выработки N0 в тканях сердца у 14- и 21-суточных крыс: уменьшалось количество N0 в составе спиновой ловушки и
Ф.Г.СИТДИКОВ, Х.Л.ГАЙНУТДИНОВ
количество R- и Т-конформеров нитрозильных комплексов гемоглобина.
Значительная роль NO во многих процессах, в том числе и в деятельности сердца, а также недостаточность сведений об объеме синтеза и функциях NO при различных двигательных режимах активности растущего организма предопределяют значимость исследований в данном направлении. Интерес вызывают исследования роли и содержания NO в организме при одном из режимов двигательной активности - гипокинезии. Стало бесспорным представление о том, что гипокинезия или дефицит движений, двигательной активности сопровождается развитием в организме явлений, неблагоприятных для здоровья (детренированность сердечно-сосудистой системы, атрофия скелетной мускулатуры, атеросклероз, остеопения и т.п.) [14]. Количественное определение содержания NO позволит оценить воздействие стрессовых условий на генерацию оксида азота в растущем организме.
Целью наших исследований было определение изменения содержания NO в тканях органов крыс разных возрастных групп при гипокинезии.
Материал и методика
Для эксперимента использовали белых лабораторных беспородных крыс предпубертатного (56-суточные) и пубертатного (81-суточные) возрастов. Животные были разделены на две группы: I группа - контрольные животные (К), которые содержались в стандартных условиях вивария; II группа - животные, которые находились в условиях гипокинезии (ГК) в течение 56 и 81 суток соответственно.
Ограничение двигательной активности растущих крысят добивались помещением их в клетки-пеналы [15]. Гипокинезию начинали с 21дневного возраста: первые два дня время гипокинезии составляло 1 час, а в дальнейшем увеличилось на 2 часа через каждые 2 дня. К 25 дню гипокинезии время пребывания животных в клетках-пеналах достигло 23 часов и оставалась постоянным до 56 и 81-суточного возраста. При 22-23 часовой гипокинезии животных выпускали из пеналов-клеток на 1-2 часа.
Изучали содержание NO в тканях желудочков и предсердий сердца, печени, мышц задних конечностей и спинного мозга. Интенсивность образования NO в органах крыс определялось методом спинового захвата с применением комплекса Fe2+ с ДЭТК. Для образования в организме данного комплекса животным вводился вводный раствор ДЭТК-Na в дозе 500 мг/кг в 2,5 мл воды внутрибрюшинно и раствор цитрата железа [сульфат железа (II) (FeSO4 • 7 H2O, Sigma, USA) в дозе 37,5 мг/кг + цитрат натрия, 187,5 мг/кг]
внутримышечно. Комплекс ДЭТК-Бе (II) взаимодействует с N0, в результате чего образуется стабильный радикал (ДЭТК)2-Ре2+-К0. Через 40 минут после введения препаратов крыс декапи-тировали, извлеченные органы быстро просушивали и замораживали в жидком азоте в специальных капиллярах для измерений. Регистрация спектров ЭПР приготовленных образцов проводилась на спектрометре ЭПР Х-диапазона ЕЯ-200Е^ЯС фирмы "Вгикег" ЕМХ/р1ш с температурной приставкой ЕЯ 4112НУ при 77 К°. Количество N0 оценивалось по интенсивности характерного сигнала ЭПР, принадлежащего комплексу ((ДЭТК)2-Ре2+-К0). Известно, что интегральная интенсивность сигнала ЭПР прямо пропорциональна концентрации парамагнитных комплексов [17]; этот факт лежит в основе оценки присутствия N0-содержащих комплексов в тканях. Сигналы сравнивали по величине интегральной интенсивности, которую вычисляли путем двойного интегрирования.
Результаты и обсуждение
Методом ЭПР были получены спектры N0-содержащих парамагнитных комплексов (ДЭТК)2-Ре2+-К0 в тканях желудочков и предсердий сердца, печени, мышц задних конечностей и спинного мозга контрольных и гипокине-зированных крыс 56- и 81-суточного возраста.
Анализ спектров ЭПР тканей желудочков сердца показал, что гипокинезия приводит к увеличению содержания N0 у 56-суточных крыс в 5,3 раза, у 81-суточных - в 3,8 раза по сравнению с показателями контрольных крыс (р<0,05) (рис.1А). В тканях предсердий сердца наблюдали аналогичную картину: у 56-суточных крыс гипокинезия приводила к увеличению содержания N0 в 4,8 раза, у 81-суточных - в 4,3 раза по сравнению с контрольными крысами (р<0,05) (рис.1Б). Таким образом, в процессе гипокинезии происходит значительное увеличение содержания N0 в тканях сердца.
Было обнаружено, что гипокинезия приводит к увеличению содержания N0 в тканях печени 56-суточных крыс в 1,7 раза (р<0,05), у 81-суточных - в 3,8 раза по сравнению с показателями контрольных крыс (р<0,05) (рис.1В).
Известно, что при гипокинезии задние конечности крыс недостаточно нагружены и обнаруживаются значительные структурные изменения в мышцах в виде дистрофии [14]. Нами было обнаружено, что в тканях мышц у 56- суточных крыс гипокинезия приводит к увеличению содержания N0 в 2,5 раза по сравнению с показателями контрольных крыс (р<0,05) (рис.1Г).
В тканях спинного мозга 56- и 81-суточных крыс содержание N0 при гипокинезии изменя-
лось незначительно: у 56-суточных крыс гипокинезия приводит к увеличению содержания N0 в 1,14 раз, у 81-суточных к уменьшению в 1,35 раза по сравнению с показателями контрольных крыс (рис.1Д).
Следует отметить, что наибольшее содержание N0 обнаруживается в тканях печени крыс, далее по убывающей - в спинном мозге, в тканях предсердий и желудочков сердца, а наименьшее содержание N0 - в тканях мышц задних конечностей. Возможно, это объясняется тем, что печень - мощный фильтрат крови и все вещества, которые циркулируют с кровью, накапливаются в ней.
Наши результаты показывают, что при гипокинезии происходит значительное увеличение содержания N0 в тканях всех исследованных нами органов, кроме спинного мозга, притом
наибольшее увеличение N0 произошло в тканях предсердий и желудочков сердца. При сравнении интенсивности продукции N0 у интактных крыс (контроль) различных возрастов было найдено, что содержание N0 в тканях предсердий и желудочков сердца, спинного мозга существенно не отличается, а в тканях печени у интактных 56-суточных крыс содержание N0 было в два раза больше по сравнению с 81-суточными (р<0,05).
При исследовании крыс, подверженных интенсивным тренировкам (режим гиперкинезии), было обнаружено снижение продукции оксида азота в разных тканях [17].
Таким образом, обнаруженное нами повышение интенсивности образования N0 при гипокинезии позволяет сделать вывод о наличии тесных связей уровня N0 в организме с режимом двигательной активности.
А)
В)
Д)
Б)
250
200
$ 150
I ё 100
50
0
140
120
100
80
60
40
20
0
К 56 ГК 56
К 81
ГК 81
К 56 ГК 56 К 81 ГК 81
Г)
200
150
100
50
К 56 ГК 56 К 81 ГК 81
К 56 ГК 56 К 81 ГК 81
0
300
60
250
200
50
0
К 56
ГК 56
Рис.1. Изменение количества N0-содержащего парамагнитного комплекса (ДЭТК)2-Ре2+-Ы0) в тканях различных органов (А - желудочки сердца, Б - предсердия сердца, В - печень, Г - спинной мозг, Д - мышцы задних конечностей) у контрольных и гипокинезированных крыс. К56 - контрольные 56-суточные крысы, К81 - контрольные 81-суточные крысы, ГК56 - гипокинезированные 56-суточные крысы, ГК81 - гипокинезированные
81-суточные крысы.
По оси ординат - интегральная интенсивность спектра ЭПР, относит.ед.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант
№09-04-97020-р Поволжье (а)).
1. Граник В.Г., Григорьев Н.Б. Экзогенные доноры оксида азота и ингибиторы NO-синтаз // Вестник РФФИ. - 2002. - №4(30). - С.48-74.
2. Марков Х.М. Оксид азота и сердечно-сосудистая система // Успехи физиол. наук. - 2001. - Т.32. -№3. - С.49-65.
3. Реутов В.П., Охотин В.Е., Шуклин А.В. и др. Оксид азота и цикл в миокарде: молекулярные, биохимические и физиологические аспекты // Успехи физиол. наук. - 2007. - Т.38. - №4. - С.39-58.
4. Nishio E., Fukushima K., Shiozaki M., Watanabe Y. Nitric oxide donor SNAP induces apoptosis in smooth muscle cells through c GMP-independent mechanism // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1996. - Vol.221. - P.163-168.
5. Szabolcs M., Michler R.E., Yang X. et al. Apoptosis of cardiac myocytes during cardiac allograft rejection. Relation to induction of nitric oxide synthase // Circulation. - 1996. - Vol.94. - P.1665-1673.
6. Манухина Е.Б., Малышев И.Ю. Стресс-лимитирующая система оксида азота // Рос. физиол. журн. им.И.М. Сеченова. - 2000. - Т.86. - №10. -C.1283-1292.
7. Реутов В.П., Сорокина Е.Г., Косицын Н.С., Охотин В.Е. Проблема оксида азота в биологии и медицине и принцип цикличности. - М.: УРСС, 2003. - 96 с.
8. Ismailova A.I., Gnezdilov O.I., Muranova L.N. et al. ESR study of the nitric oxide production in tissues of animals under the external influence on the functioning of the cardiovascular and nervous systems // Applied Magn. Res. - 2005. - Vol.28. - P.421-430.
Манухина Е.Б., Малышев И.Ю., Маленюк Е.Б., Зе-нина Т.А., Покидышев Д.А., Микоян В.Д., Кубри-на Л.Н., Ванин А.Ф. Гипотензивное действие и тканевое распределение донора оксида азота-динитрозильных комплексов железа // Бюлл. экспериментальной биологии и медицины. - 1998. -Т.125. - №5. - С.30-33.
10. Ванин А.Ф., Маленкова И.В., Мордвинцев П.И., Мюльш А. Ф. Динитрозильные комплексы железа с тиол содержащими лигандами и их обратимое связывание нитрозиолами // Биохимия. - 1993. -Т.58. - №6. - С.1094-1103.
11. Khramtsov V.V., Volodarsky L.B. Use of imidazoline nitroxides in studies of chemical reactoins: ESR measurement of concentration and reactivity of protons, thiols, and nitric oxide // Biological Magnetic Resonance. - 1998. - Vol.14. - P.109-180.
12. Vanin A.F., Mordvintcev P.I., Kleshchev A.L. Appearance of nitrogen oxide in animal tissues in vivo // Studia Biophis. - 1984. - Vol.102. - P.135-143.
13. Андрианов В.В., Ситдиков Ф.Г., ГайнутдиновХ.Л., Юртаева С.В., Обыночный АА., Яфарова Г.Г., Муранова Л.Н., Каримов Ф.К., Чиглинцев В.М., Ию-дин В.С. Изменение содержания оксида азота в сердце интактных и десимпатизированных крыс в онтогенезе // Онтогенез. - 2008. - Т.39. - №6. - С.437-442.
14. Оганов В.С. Гипокинезия - фактор риска остео-пороза // Остеопороз и остеопатия. - 1998. - №1. - С.24-25.
15. Абзалов РА. Движение и развивающееся сердце: учеб. пособ. - М.: МГПИ им В.И.Ленина, 1985. - 90 с.
16. Ингрэм Д. Электронный парамагнитный резонанс в биологии. - М.: Мир, 1972. - 297 с.
17. Абзалов Р.Р., Абзалов Н.И., Яфарова Г.Г., Андрианов В. В. Содержание оксида азота в тканях тренированного организма // Теория и практика физической культуры. - 2009. - №10. - С.17-19.
Ф.Г.СИТДИКОВ, Х.Л.ГАЙНУТДИНОВ
9.
CHANGES OF NITRIC OXIDE CONTENTS IN DIFFERENT TISSUES OF 56- AND 81-DAY RATS GROWING IN THE CONDITIONS OF HYPOKINEZIA
R.I.Faizullina, R.I.Gilmutdinova, G.G.Jafarova, V.V.Andrianov, F.G.Sitdikov, Kh.L.Gainutdinov
Using the method of electron paramagnetic resonance with spin trap the authors of the article studied the nitric oxide content in tissues of heart ventricle and auricle, liver, cord brain and muscle of intact and hy-pokinezied rats of 56 and 81 days old. It was found out that during hypokinezia the quantity of nitric oxide remarkably increased in all studied tissues except spin cord. The biggest increase of nitric oxide was observed in heart ventricle and auricle.
Key words: nitric oxide, hypokinezia, rat, heart, electron paramagnetic resonance.
Файзуллина Раиля Ирековна - аспирант кафедры анатомии, физиологии и охраны здоровья человека Института физической культуры и восстановительной медицины Казанского (Приволжского) федерального университета.
E-mail: [email protected]
Гильмутдинова Роза Инсафутдиновна - кандидат биологических наук, доцент кафедры анатомии, физиологии и охраны здоровья человека Института физической культуры и восстановительной медицины Казанского (Приволжского) федерального университета.
E-mail: [email protected]
Яфарова Гузель Гульусовна - кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории биофизики Казанского физико-технического института Казанского научного центра РАН.
E-mail: [email protected]
Андрианов Вячеслав Вадимович - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории биофизики Казанского физико-технического института Казанского научного центра РАН.
E-mail: [email protected]
Ситдиков Фарит Габдулхакович - доктор биологических наук, профессор кафедры анатомии, физиологии и охраны здоровья человека Института физической культуры и восстановительной медицины Казанского (Приволжского) федерального университета.
E-mail: [email protected]
Гайнутдинов Халил Латыпович - доктор биологических наук, проф., заведующий лабораторией Казанского физико-технического института Казанского научного центра РАН.
E-mail: [email protected]
Поступила в редакцию 11.05.2011
